一种基于香豆素的硫化氢荧光探针及其制备方法和应用与流程

本发明属于分析化学领域。更具体地，涉及一种具有硫化氢检测和成像能力的香豆素化合物及其制备方法和应用。

背景技术：

硫化氢继no和co之后发现的第三种信号分子，正常浓度的硫化氢具有调节神经系统、提高免疫和预防心血管疾病等功能，而浓度异常的硫化氢，往往会导致组织器官的功能紊乱，甚至引发重大疾病，如糖尿病、唐氏综合症、老年痴呆症等。生命体系的内源性硫化氢很少以气体的形式存在，大多数会在体液存在时溶解，并以hs^-，s^2-的形式存在，这些离子的存在维持了生命系统的某些重要生理过程。

荧光显微镜能够以极高的灵敏度和时空分辨率对目标化合物进行实时可视化的检测分析。与单光子显微镜相比，双光子显微镜具有分辨率高、穿透深度大、光损伤少等优点。双光子探针用长波长(700～1000nm)激发，可以实现对活体深层不透明组织和细胞进行高分辨率的可视化。小分子荧光探针空间体积小，标记速率快，并且不需要转染，在近几年已经有各种荧光探针被开发用于线粒体的成像和跟踪。香豆素及其衍生物是一类自然界中广泛存在的天然杂环化合物，其母体结构苯并吡喃并没有荧光，当在3或4位引入吸电子基，7位引入给电子基后便会生成强荧光物质，具有stoke位移大、荧光量子产率高、双光子吸收截面大等优点，近年来被广泛应用于荧光分子探针设计中。因此，设计和合成双光子吸收截面大、生物相容性好的新型线粒体荧光探针具有重要意义。

为了有效地预防部分疾病的产生，发展适用于生命体系的、有效的h2s检测方法具有实际意义。因此，本发明提供一种具有硫化氢检测和成像能力的香豆素类荧光探针，具有合成简单、成本低、灵敏度高、选择性好等优点，具有非常广阔的应用前景。

技术实现要素：

本发明的主要目的是克服已有技术的不足，提供一种具有硫化氢检测和成像能力的基于香豆素的荧光探针。

本发明的另一目的是提供上述基于香豆素的硫化氢荧光探针的制备方法。

本发明还有一个目的是提供上述基于香豆素的硫化氢荧光探针在硫化氢检测方面的应用。

本发明通过以下技术方案实现上述发明目的。

本发明公开了一种基于香豆素的硫化氢荧光探针，其结构通式如式(i)所示：

本发明还提供了上述基于香豆素的硫化氢荧光探针的制备方法，概述如下：本发明首先通过2,4-二硝基氯苯和2-巯基苯甲酸在铜粉催化和碳酸钾存在下制备2-((2,4-二硝基苯基)硫代)苯甲酸；然后在缩合剂和弱碱存在，使上述制备苯甲酸和7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)香豆素缩合，即为目标化合物(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-苯并吡喃-4-基)2-((2,4-二硝基苯基)硫代)苯甲酸甲酯。

优选的，制备方法包括如下步骤：

s1：将化学计量比为1:1.1:1.2:2的2,4-二硝基氯苯，2-巯基苯甲酸，铜粉和碳酸钾在n，n-二甲基甲酰胺(dmf)中反应，于65℃下反应9小时。反应结束后，加入蒸馏水稀释，再加入6mhcl调至酸性，然后用二氯甲烷萃取，有机相水洗、干燥、过滤，减压蒸馏得粗产物。粗产物用乙醇溶解，再滴加到蒸馏水中，析出黄色固体。过滤，真空干燥，得黄色固体即为目标化合物2-((2,4-二硝基苯基)硫代)苯甲酸。

s2：将化学计量比为5:6:6:1的7-(二乙氨基)-4-(羟甲基)香豆素，2-((2,4-二硝基苯基)硫代)苯甲酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和4-二甲氨基吡啶在二氯甲烷中于室温反应24小时。反应结束后，反应液依次用稀酸，稀碱水选，分液漏斗分离出有机相、干燥、减压蒸馏除去溶剂，再加入少量甲醇洗涤，过滤，真空干燥，得红色固体，即为目标通式(i)的化合物。

另外，上述香豆素化合物在制备硫化氢检测探针中的应用，以及制备硫化氢成像试剂中的应用都应在本发明的保护范围之内。

本发明具有以下有益效果：

本发明的香豆素化合物能够选择性对硫化氢荧光响应，为硫化氢的监测研究提供了简单有效直观的手段，也预示本发明所述苯并噻唑化合物在硫化氢检测与成像研究中具有十分广泛的应用。而且，本发明的化合物容易合成、荧光性能好、选择性高的特点，在硫化氢的检测及成像领域具有潜在的应用价值。此外，制备该化合物的原料便宜易得、成本低廉、制备过程简单，适于大规模工业推广应用。

附图说明

图1是实施例2中香豆素化合物与硫化氢及其它物质反应的荧光变化；

图2是实施例2中香豆素化合物加入h2s后的荧光强度变化图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，本发明所用试剂和材料均为市购。

实施例1

制备香豆素化合物chs：

将7-二乙胺-3-羟甲基香豆素(0.05g，0.2mmol)，2-(2,4-二硝基苯基)硫代苯甲酸(0.08g，0.25mmol)和催化剂1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.048g，0.25mmol)，4-二甲氨基吡啶(0.005g，0.04mmol)溶于20ml二氯甲烷中，在室温不断搅拌，避光反应24小时。反应结束后，反应液依次用稀酸，稀碱洗涤，有机相干燥，减压蒸馏除去溶剂，再加入少量甲醇洗涤，然后过滤，真空干燥得红色固体，即为目标化合物(7-(二乙氨基)-2-氧代-2h-苯并吡喃-4-基)2-((2,4-二硝基苯基)硫代)苯甲酸甲酯(chs)。

¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ9.00(d,j＝2.4hz,1h),8.16–8.10(m,1h),8.04(dd,j＝9.0,2.5hz,1h),7.73(dd,j＝5.5,3.7hz,3h),7.18(d,j＝9.0hz,1h),6.90(d,j＝9.0hz,1h),6.49(dd,j＝9.0,2.6hz,1h),6.44(d,j＝2.5hz,1h),6.02(s,1h),5.29(s,2h),3.41(q,j＝7.1hz,4h),1.22(t,j＝7.1hz,6h).¹³cnmr(500mhz,cdcl3)δ164.73,160.95,155.74,150.30,147.69,146.93,143.71,142.96,137.95,135.07,133.34,131.60,131.05,128.87,126.13,123.90,120.73,108.14,106.92,105.20,97.13,62.26,44.25,11.90.

实施例2

将实施例1中的香豆素化合物chs对硫化氢及其它分子离子的荧光响应实验：

在室温下10mmph＝7.4的pbs缓冲液中，配制20μm的化合物chs溶液，然后加入20μm的nahs，记录不同时间的荧光光谱。图1中，a)为化合物chs与h2s反应的时间变化图；结果显示，与等量的硫化氢反应后，化合物chs的荧光迅速增强，当时间大约为35分钟时，荧光强度基本保持不变。

20μm的化合物chs分别与1mm的co3^2-、cl^-、hco3^-、so4^2-、s2o3^2-、so3^2-、gsh、cys、hcy孵育35分钟后，记录相应的荧光光谱，取480nm处荧光强度值，与50μm的nahs孵育35分钟后480nm处的荧光强度值一并作图比较。图1中，b)为化合物chs对不同分子离子的荧光响应情况；结果表明，探针分子化合物chs对硫化氢的响应具有比较高的选择性。

20μm的化合物chs与不同浓度nahs反应后的荧光变化及对480nm荧光强度的线性拟合。图1中，c)为化合物chs与不同浓度h2s反应的荧光变化图；图1中，d)为化合物chs荧光强度对不同浓度h2s的线性关系。结果表明，在一定浓度范围内，探针荧光强度与硫化氢浓度呈现出非常好的线性关系(r²＝0.9987)，可以作为硫化氢定性和定量检测荧光探针。

图2是化合物1加入h2s后的荧光变化图；在加入h2s后，化合物1溶液在紫外光照射下其荧光强度明显提高。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。