一种珊瑚致病菌的鉴定与防治方法与流程

本发明涉及珊瑚疾病防治技术领域，具体涉及一种珊瑚致病菌的鉴定与防治方法。

背景技术：

珊瑚礁生态系统是初级生产力最高的海洋生态系统之一，具有极高的生物多样性和重要的经济价值。然而，近几十年来，珊瑚礁逐渐退化。据mulhallm等调查，1980年代初到2000年，珊瑚礁的总面积已从约60万平方公里，减少到约25万平方公里。导致珊瑚礁退化的因素很多，包括自然环境因素(气候变化、海洋酸化、厄尔尼诺、漂白、旋风)和人为因素(炸药捕鱼、过度使用生物资源、冲洗农田、化学污染)以及生物因素(海星摄食、大型藻类竞争、病原微生物)。其中，病原微生物是导致珊瑚退化重要原因之一。由于环境因素及人为因素的影响，珊瑚的免疫能力下降，从而进一步使珊瑚更易受到病原菌的感染及危害。迄今为止，已经发现的由病原微生物导致的珊瑚疾病已经波及106种珊瑚，范围遍及54个国家。

1995年，richardson和他的同事将发生在北佛罗里达群岛，椭圆星珊瑚爆发的疾病定为ⅱ型白色瘟疫。白色瘟疫主要包括三种类型：白色瘟疫-ⅰ、白色瘟疫-ⅱ、白色瘟疫-ⅲ。这三种类型的白色瘟疫症状相似，都表现为突兀的白色线条或条带将健康珊瑚组织和裸露的珊瑚骨骼分开。其中只有白色瘟疫-ⅱ的病原体被探索出来。白色瘟疫-ⅱ在发病时一般从珊瑚底部向上扩散，其病原能感染32种珊瑚，是3种白色瘟疫中感染珊瑚种类最多的。因此，珊瑚白色瘟疫-ⅱ的防治就显得极为重要。

珊瑚白色瘟疫-ⅱ是由致病菌aurantimonascoralicida感染导致的。aurantimonascoralicida分泌能够致病的功能物质有两种，其中一种即为氨，氨作为光合作用的解偶联剂破坏类囊体膜的ph梯度。这意味着一定浓度的氨可以通过阻碍光合作用杀死虫黄藻。针对于珊瑚白色瘟疫-ⅱ的防治研究尚且未见报道。因此，本发明涉及的对于致病菌的防治具有重要的意义。

本发明涉及的目标菌株aureimonasaltamirensis与aurantimonascoralicida的亲缘关系很近，但目标菌株并未被证明过有致病能力，而目标菌株的产氨能力还要高于aurantimonascoralicida，所以本发明对目标菌株是否具有致病性进行了鉴定，并以降低致病菌产氨浓度的思路来防治致病菌导致的疾病。

技术实现要素：

本发明的目的在于针对现有鹿角杯形珊瑚致病菌的防治的不足，提供一种鉴定新的珊瑚致病菌以及新的防治该种珊瑚致病菌导致的珊瑚疾病方法。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种珊瑚致病菌的鉴定与防治方法，所述鉴定方法包括如下步骤：

(a1)样本选择：采集生长状态良好的健康珊瑚，置于养殖池中适应至少15d；

(a2)菌株培养：将对比菌株和目标菌株分别接种要液体培养基中，摇床培养，测定2株菌株的od值并制作其生长曲线；

(a3)科赫法则鉴定：将目标菌株接种于珊瑚样本上，待其出现白化现象时，从白化珊瑚样本中分离出目标菌株，将其纯化后再接种至新的珊瑚样本上，待新的珊瑚样本出现白化现象时，再次从白化珊瑚样本中分离出目标菌株，对其进行16srdna鉴定其种属，确定白化珊瑚体内含有的致病菌；

所述防治方法包括如下步骤：

(b1)分组处理：将目标菌株分为两组，一组加入降氨物质，记为实验组1，一组不做任何处理，记为阳性对照组1，另设一组阴性对照组，为含有降氨物质的液体培养基；

将对比菌株分为两组，一组加入降氨物质，记为实验组2，一组不做任何处理，记为阳性对照组2；

(b2)接种观察：将步骤(b1)的5组处理分别接种到单独的珊瑚样本上，期间测定珊瑚样本上的共生虫黄藻密度及光合速率，并观察记录珊瑚样本表观特征；

(b3)防治评估：以步骤(b2)各珊瑚样本表观特征，共生虫黄藻密度，光合速率判断致病菌作用珊瑚样本前后差异为指标，评估珊瑚样本在致病菌作用前后白化程度，若实验组1的珊瑚样本状态优于阳性对照组1和阴性对照组，且实验组2的珊瑚样本状态优于阳性对照组2和阴性对照组，则表明对珊瑚致病菌防治有效。

优选地，所述对比菌株为致病菌aurantimonascoralicida的菌株。

优选地，所述目标菌株为致病菌aureimonasaltamirensis的菌株，该致病菌保藏于海洋微生物菌种保藏管中心，保藏编号为mccc1a15408。

优选地，所述珊瑚为鹿角杯型珊瑚。

优选地，步骤(b2)中，若实验组1的珊瑚样本状态优于阳性对照组1和阴性对照组，且实验组2的珊瑚样本状态优于阳性对照组2和阴性对照组，且检测数据存在显著性差异，表明对珊瑚致病菌防治有效。

优选地，所述液体培养基为ma液体培养基。

优选地，步骤(b1)中的5组处理，每组处理设有至少3个重复。

优选地，所述的降氨物质为降氨解毒灵。

本发明由于采用了上述技术方案，具有以下有益效果：

本发明通过科赫法则鉴定得出菌株aureimonasaltamirensis可引起珊瑚发生白色瘟疫，并发现其是通过分泌氨导致珊瑚致病的。因此，针对其发病机理，通过加入一定量的降氨产品防治该致病菌对珊瑚的致病作用，防治的结果可以通过分析珊瑚表观特征来检验，检验结果迅速可靠。本发明的鉴定方法和防治方法科学可靠，成本较低，操作简单，防治效率及样本成活率高，可规模化操作，可以应用于对珊瑚特定疾病的预防，对保护珊瑚礁资源和珊瑚人工移植成活率有重大意义，对助力我国珊瑚礁生态系统保护取得长远发展有一定的积极作用。

附图说明

图1为不同处理组鹿角杯形珊瑚表观特征。

图2为不同处理组鹿角杯形珊瑚共生虫黄藻密度。

图3为一定浓度降氨产品对实验菌株生长情况影响。

图4为两株实验菌株的产氨情况。

图5为不同处理组鹿角杯形珊瑚fv/fm值。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下举出优选实施例，对本发明进一步详细说明。然而，需要说明的是，说明书中列出的许多细节仅仅是为了使读者对本发明的一个或多个方面有一个透彻的理解，即便没有这些特定的细节也可以实现本发明的这些方面。

实施例1

一种珊瑚致病菌的鉴定与防治方法，所述鉴定方法包括如下步骤：

(a1)样本选择：采集生长状态良好的健康鹿角杯形珊瑚，置于养殖池中适应20d。

根据珊瑚生长特性，设置养殖池水质条件为：t:29℃、kh:7.0±0.3、ph:8.2±0.1、ca²⁺:400±15ppm、mg²⁺:1400±20ppm、po4^3-<0.03ppm、nh³⁺<0.15ppm、no^2-<0.1ppm、no^3-≈0ppm，设置12/12h光照，采用250wmetalhalogenlamp+4t5ho,odyssea，每周两次喂食刚孵化的丰年虾。

(a2)菌株培养：将对比菌株(aurantimonascoralicida)和目标菌株(aureimonasaltamirensis)分别接种到ma液体培养基中，29℃，160rpm下培养，测定2株菌株的od值并制作其生长曲线，目标菌株达到稳定期时，取菌液9ml，8000rpm离心3min，浓缩为3ml，分为3份，每份1ml；用同样方法处理无菌ma培养基，获得3份1ml的ma培养基浓缩液。上述两种菌株均购于国家微生物资源平台(nimr)。

(a3)科赫法则鉴定：

(a31)菌株接种：取6个烧杯，每个烧杯放置一株珊瑚，将步骤(a2)的浓缩菌液以及ma培养基浓缩液分别淋加于珊瑚表面，再加入500ml珊瑚缸内的海水，其中，加入浓缩菌液的3株珊瑚记为实验组，加入ma培养基浓缩液的3株珊瑚记为对照组，期间监测共生虫黄藻叶绿素荧光fv/fm值、虫黄藻密度和光合速率，以及观察珊瑚的表观特征变化，24h后将珊瑚返回缸内。

(a32)菌株分离：当实验组的珊瑚出现肉眼可见的白化特征时，停止实验，将白化的珊瑚取出，用无菌海水冲洗实验组珊瑚获得珊瑚冲洗液，经过滤纸过滤除去珊瑚骨骼及其它杂质，再通过0.45μm的滤膜，用刀片刮取滤膜上的残留物溶解于无菌海水中进行稀释涂布培养，挑取菌落形态与目标菌株相似的菌落接种于ma培养基中进行培养，对所获得的菌株进行16srdna鉴定其种属，以确定白化珊瑚体内含有致病菌。

(a33)菌株纯化再接种：将从步骤(a32)的患病珊瑚冲洗液中获得的目标菌株扩大培养，以与步骤(a31)同样的方式接种到珊瑚上；

(a34)当步骤(a33)出现白化的珊瑚时，重复步骤(a32)的操作，获得目标菌株，说明目标菌株为鹿角杯形珊瑚白色瘟疫的致病菌。

本实施例还提供一种由所述目标菌株导致珊瑚白色瘟疫的防治方法，包括如下步骤：

(b1)分组处理：

(b11)产氨情况测定：分别将对比菌株和目标菌株接种到ma培养基中，29℃，160rpm，培养10h，在培养过程用氨氮测试盒测试菌株的产氨情况；

(b12)降氨影响：当两株菌株的od值达到0.1-0.2时，每份加入从市面购得的降氨解毒灵(0.25g/ml)2ml，再测定od值，制作生长曲线，判断降氨解毒灵对菌株的生长是否有影响。

(b13)菌株处理：当菌株培养至刚达到稳定期时，分别取菌液18ml，8000rpm离心3min浓缩为6ml，浓缩菌液分为2组，每组3个处理，每个处理1ml；目标菌株浓缩液的其中一组加入降氨解毒灵(0.25g/ml)200μl，记为实验组1，另一组不做任何处理，记为阳性对照组1；

对比菌株浓缩液的其中一组加入加入降氨解毒灵(0.25g/ml)200μl，记为实验组2，另一组不做任何处理，记为阳性对照组2；

另设一组阴性对照组，为加入降氨解毒灵的ma培养基浓缩液，同设3个处理，降氨解毒灵的加入量为(0.25g/ml)200μl。

(b21)接种观察：取12个烧杯，每个烧杯放置一株珊瑚，步骤(b13)的12个处理分别淋加于珊瑚表面，再加入500ml珊瑚缸内海水，24h后将珊瑚放回缸内。

(b22)数据采集：在(b21)实验期间，对珊瑚进行拍照记录，用于后期分析不同条件珊瑚表观特征变化，采用diving-pamunderwaterfluorometer(walz,germany)测定共生虫黄藻叶绿素荧光fv/fm值，将研磨珊瑚获得的组织液，以滤纸过滤掉杂质获得滤液进行显微镜计数，计算得到虫黄藻密度和光合速率，结果如图1-图5所示。

(b3)防治评估：

如图1所示，图1中，tank1为加入阴性对照组的珊瑚样本，tank2为加入阳性对照组1的珊瑚样本，tank3为加入实验组1的珊瑚样本。由珊瑚表观形态可见，tank2组出现明显白化及组织脱落现象，而加有降氨产品的tank3则无白化及组织脱落现象，仅有部分触手收缩，与对照组tank1并无差异。这说明从珊瑚表观形态看，降氨产品的加入对目标菌株导致的珊瑚疾病有防治功效。

在图2中，aa为加入阳性对照组1的珊瑚样本虫黄藻含量，aat为加入实验组1的珊瑚样本虫黄藻含量，ac为加入阳性对照组2的珊瑚样本虫黄藻含量，act为实验组2的珊瑚样本虫黄藻含量，c为加入阴性对照组的珊瑚样本虫黄藻含量。由图可知，aa与aat之间，ac与act之间存在显著性差异，说明降氨解毒灵可有效降低两种菌株对珊瑚虫黄藻的毒性。

图3结果表明：将一定浓度降氨产品加入对比菌株和目标菌株的菌液中(终浓度为0.05g/ml)，对2种菌株的生长情况无影响。

图4结果表明：两种菌株都可以产氨。在相同培养时间内，目标菌株的产氨能力要强于对比菌株。

图5结果表明：两种致病菌株对珊瑚的光合效率影响不大。

以上结果表明通过加入一定量的降氨产品防治致病菌的方法科学可靠，可以应用于对珊瑚特定疾病的预防，对保护珊瑚礁资源和珊瑚人工移植成活率有重大意义，对助力我国珊瑚礁生态系统保护取得长远发展有一定的积极作用。