RNF181作为结核病诊断分子标识的用途的制作方法

本发明属于生物医药领域，涉及一种分子标记物rnf181在诊断结核病中的应用。

背景技术：

结核病(tuberculosis，tb)是由结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis,m.tb)感染引发的一种严重威胁人类健康的慢性传染性疾病，全球将近四分之一的人感染结核分枝杆菌，并长期处于潜伏感染状态，其中5％～10％可能会在一生中发生活动性结核病。由于结核分枝杆菌的自身的细胞壁较厚、脂肪酸含量较高、细胞内寄生等生物学特点，结核病早期以及快速诊断的灵敏度和检出率均较低，一直未有突破进展。目前活动性结核病的诊断主要依据病原学检测和患者影像学诊断。病原学检测被认为是结核诊断的“金标准”，包括患者痰涂片、痰培养以及分子生物学检测方法，主要针对宿主标本中存在的结核分枝杆菌活菌及其基因组份进行检测；然而，现有数据显示菌阳结核比例只占临床结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果做出诊断。另一方面，影像学诊断虽然快捷、灵敏，但存在假阳性高、无法区分肺结核与其他肺部感染的缺陷。而针对宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，tst)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，igra)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。

目前临床应用的结核病诊断及辅助诊断主要是从病原学和宿主出发建立的的方法，其应用仍存在一定的缺陷和限制条件。(一)病原学检查：患者痰涂片检查，简便易行，但检出率低；痰培养方法，如罗氏斜面培养、mgit960，虽准确性较高，但培养周期长，操作过程复杂，需要在标准参比实验室中进行；分子生物学检测，如genexpert等检测，是针对样本结核菌dna分子，无法判定结核菌是否为活菌。病原学检测阳性是诊断活动性结核的“金标准”，然而，目前临床菌阳结核比例只占结核病例的30－40％，仍有过半的病例无法应用病原学结果作出诊断。(二)影像学检查：胸部x线检查可以早期发现结核病，而且可以确定病灶的部位、性质、范围，了解发病情况及用于治疗效果的判断，并且开展方便，病人乐于接受；胸部ct可以发现较小的或隐蔽部位的病变，可以弥补一般x线检查的不足。但容易与其他肺部疾病混淆，需要专业医生确证。(三)宿主的免疫反应检测方法，如结核菌素皮肤试验(tuberculinskintest，tst)和γ干扰素释放试验(interferongammareleaseassays，igra)只能判定结核菌感染而无法确定是否为活动性结核，且无法区分结核与非结核分枝杆菌感染。因此，迫切需要新的诊断方法，实现结核病的早期和快速诊断，从而达到有效治疗个体，控制、消灭结核传播的目标。

rnf181(ringfingerprotein181(rnf181)基因位于人2号染色体上，编码指环蛋白181，长度153氨基酸,基因序列见参考(zhang,q.h.etal.cloningandfunctionalanalysisofcdnaswithopenreadingframesfor300previouslyundefinedgenesexpressedincd34+hematopoieticstem/progenitorcells.2000，genomeres10,1546-1560)¹。该蛋白为泛素连接酶。研究报道，该基因表达蛋白与肿瘤抑制有关，体外及动物模型实验显示，其能够抑制细胞生长，降低肿瘤细胞增殖并增加细胞凋亡²。其机制可能与信号转导通路的活化酶(extracellularsignal-regulatedkinase1/2,erk1/2)/丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activateproteinkinase,mapk)/有关，在肝细胞癌研究中，通过抑制细胞外信号调节激酶/丝裂原激活激活酶途径抑制肝细胞癌生长³。我们的研究数据显示，相比结核潜伏感染者(ltbi,latenttuberculosisinfection)和非结核感染对照组(hc，healthcontrol)，在活动性结核(activetuberculosis,atb)患者体内，其基因表达量呈上升状态，且差异显著，可作为活动性结核诊断，区分活动性结核与结核潜伏感染的分子标识。尚无与结核病相关的文献发表及相关专利报道。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供分子标记物rnf181在诊断结核病中的应用。本发明所述的标记物能够作为诊断结核病或者检测结核分枝杆菌感染的标识，并且其具有良好的敏感性和特异性。

本发明所述的分子标记物rnf181，为已知基因，能够根据现有方法提取得到。

本发明更加详细的描述如下：

检测分子标记物rnf181表达水平的试剂在制备诊断结核病的试剂盒的应用。

检测rnf181蛋白水平改变在制备诊断结核病试剂盒的应用。

检测分子标记物rnf181表达水平方法为荧光定量pcr法。

检测分子标记物rnf181表达水平的试剂制备诊断活动性结核病的试剂盒中的应用。

其中，所述应用包括用于区分活动性结核病患者、结核潜伏感染以及非活动性肺结核非潜伏感染者。

其中，所述结核病为肺结核或肺外结核。

其中，该试剂盒还包括如下组分：

cd15+细胞特异抗体筛选磁珠(invitrogen.)；

rneasyplusminikit(qiangen.)

superscript^tmivreversetranscriptase(invitrogen.)

taqmandnapolymerase

taqman探针及基因扩增特异引物。

本发明还提供rnf181在制备结核病诊断标记物的产品中的应用。

本发明还提供rnf181在制备诊断结核病的医疗器械中的应用，所述的诊断结核病的医疗器械以rnf181作为诊断分子标记物。

凡是能够检测体内rnf181基因含量的检测方法都包含在本发明之内，如本发明提供的以下方法：

(1)全血样本处理：取人或动物全血进行孵育；

(2)磁性分离：分离中性粒细胞并对中性粒细胞进行裂解；

(3)总rna提取：对中性粒细胞的总rna进行提取；

(4)cdna的合成：对rna进行反转录，得到样本cdna，

(5)实时荧光定量pcr：以cdna为模板，使用rnf181特异引物，内参引物进行实时荧光定量pcr检测，经过计算即可得到样本中rnf181基因的含量。

结论：

以该研究方法获得宿主体内的基因相对表达量，经统计学分析，得出该基因在活动性结核，结合潜伏感染及非结核感染的宿主中的表达量有明显的变化，可用于活动性结核与非结核感染者，结核潜伏感染与非结核感染者鉴别的分子标识。

本发明还提供相应的检测方法，步骤如下：

1)全血样本处理

按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，以1：2的比例向流式管中加入1.6ml的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入cd15⁺磁珠并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在hulamixer上，4℃，8rpm旋转孵育20min，

2)磁性分离

⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6ml分离液，轻轻吹匀后转移至对应2ml蛋白低吸附管，磁力架上静置2min，吸去上清，

⑶从磁力架上取下，加入1.6ml分离液，轻轻吹匀，磁力架上静置2min，吸去上清，重复1次，

⑷加入350μl的bufferrlt裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用，

3)总rna提取

采用rneasyplusminikit对磁珠分选的中性粒细胞总rna进行提取，具体操作如下：

⑴配制反应体系1和反应体系2

将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gdna去除柱中，12,000rpm离心30s；

⑵向流穿液中加入350μl70％乙醇，混匀，转移700μl至rneasymini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑶加入700μlbufferrw1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑷加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液，

⑸加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min，

⑹将rneasymini柱放入标记好编号的1.5ml的ep管，向柱膜中心加入30μl水，静置1min，12,000rpm，离心1min，所得rna冰上放置备用，

4)cdna的合成

取细胞总rna，采用superscript^tmivvilo^tmmastermix进行反转录，得到细胞样本cdna，

5)实时荧光定量pcr检测rnf181基因的相对表达量

采用上步中制备的cdna为模板，对rnf181特异引物对或内参引物对进行实时定量pcr，进而得到各个样本模板中rnf181基因的相对表达量。

其中，实时荧光定量pcr检测基因的相对表达量，具体步骤如下：

(1)配制反应体系1和反应体系2

反应体系1(目的基因)为20μl，由qpcr反应多聚酶fastadvancedmastermix，目的基因assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。反应体系2(内参基因)为20μl，由fastadvancedmastermix，assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。

其中，rnf181及内参基因特异引物为商业化探针(appliedbiosystems，us)，分别在预配分装的qpcr反应液中加入1ul/孔。充分混匀后，上机，收集数据。

(2)实时定量pcr检测

将步骤(1)配制的各个反应体系在quantstudio^tm6and7flex实时荧光定量pcr仪(appliedbiosystems，us)上进行实时定量pcr检测。使用2^-δδct法计算各个模板中rnf181基因的相对表达量。

反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。

(3)统计分析使用graphpadprism6对步骤(2)的结果进行统计分析。

本发明相对于现有技术而言，有益效果在于：

现有结核病诊断方法主要依据病原学诊断，病原学阳性患者在人群中的检出率约为30-50％；其余病原性阴性患者无法被检出。rnf181基因可区分活动性结核病患者与结核潜伏感染以及非结核感染者，作为诊断活动性结核病的候选生物标志物，本发明为结核诊断的宿主分子标识，不限于病原学检测阳性人群，同时能够应用于结核菌病原检测阴性人群的分子诊断，可有效提高临床结核病检出率。

对于说明书中出现的相关术语，在此进行相应的解释和说明：

tb：tuberculosis，结核病

m.tb：mycobacteriumtuberculosis。结核分枝杆菌

tst：tuberculinskintest，结核菌素试验

igra：interferongammareleaseassays，γ干扰素释放试验

atb：activetuberculosis,活动性结核

ltbi：latenttuberculosisinfection，结核潜伏感染者

hc：healthcontrol，非结核感染对照组

pn：pneumonia，肺部感染

cd15：白细胞分化抗原15

hulamixer：hula混匀器

bufferrlt：rlt缓冲液

rneasyplusminikit：rna提取试剂盒

gdna：基因组dna

bufferrw1：rw1缓冲液

bufferrpe：rpe缓冲液

superscript^tmivvilo^tmmastermix:superscript^tmivvilo^tm混合液

cdna：反转dna

fastadvancedmastermix：快速混合液

附图说明

图1、实时定量pcr结果图，

注：atb：活动性肺结核患者；ltbi：潜伏感染者；hc：非活动性肺结核非潜伏感染者。

具体实施方式

通过以下具体实施例对本发明作进一步的说明，但不作为本发明的限制。

实施例1、

1.1研究对象

研究对象及纳入标准

本研究对象包括活动性结核、结核潜伏感染及正常对照组。活动性结核(activetuberculosis,atb)来自深圳第三人民医院的确诊住院患者，诊断标准依据《中华人民共和国卫生行业标准(ws288—2017)肺结核诊断》标准，且病原学检测阳性即：痰涂片/培养/核酸检测三者至少1项为阳性，无既往结核病史(问诊及x射线胸片检查无陈旧性结核病灶)，初次抗结核治疗，用药少于7天；潜伏感染者(ltbi,latenttuberculosisinfection)为有临床接触史，无临床症状，且igra阳性；正常对照组(hc，healthcontrol)，为体检相关指标正常，igra阴性。所有研究对象均年龄小于70岁或大于18岁、无妊娠或哺乳期妇女以及合并其它严重慢性疾病及免疫缺陷性疾病。遵循中国医学科学院/北京协和医学院病原生物学研究所和深圳第三人民医院伦理委员会制定的伦理标准，并签订知情意见通知书。

样本信息

本研究共收取207例宿主样本，分为三组，包括活动性结核组(atb,activetuberculosis,51例)、结核感染组(ltbi,latenttuberculosisinfection,54例)及正常对照组(hc，healthcontrol,102例)。年龄、性别等详细信息见表1

表1.样本人口统计学资料

标本来源

分别抽取上述研究对象的外周血2.5ml，置于含肝素锂抗凝采血管(bdbiosciences，us)，上下颠倒5-6次(目的为抗凝液和外周血混匀)，得到外周血标本。

1.2研究方法

磁珠分选是基于细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性单抗相结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在分选柱内，而无该种表面抗原的细胞由于不能与连接有磁珠的特异性单抗相结合而没有磁性，不在分选柱内停留，进而使细胞得以分离。

本发明所述的试剂盒，包括以下组分：cd15+细胞富集磁珠及相关试剂，细胞总rna提取分离柱及相关试剂，cdna合成逆转录酶及相关试剂，rnf181序列扩增特异性引物及实时荧光定量pcr相关试剂。

1.2.1全血样本处理

按照商业化试剂实验说明书操作，吸取0.8ml混匀全血到5ml流式管中，已1：2的比例向流式管中加入1.6ml的4℃预冷的分离液，吹吸混匀；加入cd15⁺磁珠(invitrogen，us)并迅速向稀释好的血液中加入一份磁珠，盖紧盖子，将流式管妥善安置在hulamixer(invitrogen，us)上，4℃，8rpm旋转孵育20min。

1.2.2磁性分离

⑴取出孵育好的细胞，瞬时离心，在磁力架上静置2min，小心吸去上清；

⑵加入1.6ml分离液，轻轻吹匀后转移至对应2ml蛋白低吸附管。磁力架上静置2min，吸去上清。

⑶从磁力架上取下，加入1.6ml分离液，轻轻吹匀。磁力架上静置2min，吸去上清。重复1次。

⑷加入350μl的bufferrlt(qiagen,germany)裂解细胞，涡旋震荡1min，4℃放置备用。

1.3总rna提取

采用rneasyplusminikit(qiagen,germany)对磁珠分选的中性粒细胞总rna进行提取，具体操作如下：

⑴配制反应体系1和反应体系2

将细胞裂解液在磁力架上静置2min，吸取细胞裂解液转移至gdna去除柱中，12,000rpm离心30s；

⑵向流穿液中加入350μl70％乙醇，混匀。转移700μl至rneasymini柱中，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑶加入700μlbufferrw1，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑷加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心15s，弃去流穿液。

⑸加入500μlbufferrpe，12,000rpm，离心2min，更换新的收集管，开盖全速离心1min。

⑹将rneasymini柱放入标记好编号的1.5ml的ep管，向柱膜中心加入30μl水，静置1min。12,000rpm，离心1min，所得rna冰上放置备用。

1.4cdna的合成

取细胞总rna，采用superscript^tmivvilo^tmmastermix(invitrogen，us)进行反转录，得到细胞样本cdna。

1.5实时荧光定量pcr检测rnf181的相对表达量

采用步骤1.4中制备的cdna为模板，对rnf181特异引物对或内参引物对进行实时定量pcr，进而得到各个样本模板中rnf181基因的相对表达量。具体步骤如下：

(1)配制反应体系1和反应体系2

反应体系1(目的基因)为20μl，由qpcr反应多聚酶fastadvancedmastermix，目的基因assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。反应体系2(内参基因)为20μl，由fastadvancedmastermix，assayprimer,及样本cdna和无核酸酶水组成。

(2)实时定量pcr检测

将步骤(1)配制的各个反应体系在quantstudio^tm6and7flex实时荧光定量pcr仪(appliedbiosystems，us)上进行实时定量pcr检测。使用2^-δδct法计算各个模板中rnf181基因的相对表达量。

反应条件：50℃2min；5℃预变性3min；95℃1s，60℃20sec，40个循环，荧光信号在延伸阶段采集。

(3)统计分析使用graphpadprism6对步骤(2)的结果进行统计分析。

2.研究结果

将定量pcr结果处理后，使用graphpadprism6对数据进行分析，结果见图1.由图可见，与结核潜伏感染组和非结核感染组相比，活动性结核病组的rnf181相对表达水平升高，差异显著(****p<0.0001)，与潜伏感染组差异极显著量显著增加(****p<0.0001)。可以区别诊断健康人和结核病患者、潜伏感染和结核病患者，因此基因rnf181可以用做结核病的分子诊断标识。

实施例2、试剂盒

本发明的试剂盒由以下成分组成：

1.特定细胞富集抗体标记磁珠，dynabeadscd15(invitrogen，us)

2.细胞总rna提取试剂盒，rneasyplusminikit(qiagen,germany)

3.cdna反转录酶，superscript^tmivvilo^tmmastermix(invitrogen，us)

4.qpcr荧光定量pcr检测体系，包括多聚酶，缓冲体系，以及assayrnf181外显子区域特异性检测引物及探针。

本发明首次报道基于人体外周血内所包含的特定细胞rnf181基因表达量变化的检测，相比外周血全血相关基因表达变化检测更加灵敏和特异。通过系列商业化试剂的组合和流程优化，使该基因作为结核病分子诊断标识具有可能性和实用性。

参考文献：

1zhang,q.h.etal.cloningandfunctionalanalysisofcdnaswithopenreadingframesfor300previouslyundefinedgenesexpressedincd34+hematopoieticstem/progenitorcells.genomeres10,1546-1560,doi:10.1101/gr.140200(2000).

2wang,s.etal.rn181isatumoursuppressoringastriccancerbyregulationoftheerk/mapk-cyclind1/cdk4pathway.jpathol248,204-216,doi:10.1002/path.5246(2019).

3wang,s.h.etal.rn181suppresseshepatocellularcarcinomagrowthbyinhibitionoftheerk/mapkpathway.hepatology53,1932-1942,doi:10.1002/hep.24291(2011)。