制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法与流程

本发明属于化合物生物技术领域，尤其是一种制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法。

背景技术：

胞二磷胆碱是生物体中卵磷脂合成的重要前体。胞二磷胆碱由日本武田药品工业公司首先开发成功，商品名称为“nicholin””(尼可林)，现已被中国药典收录作为细胞代谢改善药。胞二磷胆碱是临床用量最大的神经激活剂，能促进卵磷脂的生物合成，恢复神经组织功能，改善脑代谢和循环，可用于急性颅脑外伤和脑手术所引起的意识障碍恢复，并可用于帕金森综合征和老年性痴呆症的辅助治疗。胞二磷胆碱是卵磷脂生物合成的前体，当大脑功能下降时，脑组织内的卵磷脂含量显著减少。补充外源性胞二磷胆碱即能激活卵磷脂的生物合成，刺激脑干网状结构的兴奋，提高苏醒阈值，恢复神经组织机能，改善脑代谢和神经传导，提高患者的意识水平。

现有胞二磷胆碱的制备方法主要为化学合成法。通用的方法是采用cytidine-5’-phospho-morpholide和磷酸胆碱盐酸盐在乙腈或吡啶中缩合形成胞二磷胆碱。其中，cytidine-5’-phospho-morpholide可以通过cmp和吗啉在dcc中脱水缩合(chemicalandpharmaceuticalbulletin,1971,19(5):1011–1016.)或者通过选择性磷酸化胞苷(journalofchemicalresearch,2016,40(6):358–360.)的方法获得。然而，上述合成路线中使用的原料和缩合剂价格昂贵，而且需要在有毒的有机溶剂中完成反应，导致胞二磷胆碱的合成收率较低，生产成本居高不下。

近年国内大部分的生产多报道为生物转化，以各种微生物为生物催化剂，利用其中的磷酸胆碱胞苷转移酶(cholinephosphatecytidylyltransferase，cct，ec2.7.7.15)，以胞苷三磷酸(cytidinetriphosphate，ctp)和磷酸胆碱为底物可直接合成胞二磷胆碱，具有反应条件温和、成本低和工艺简便等特点，但也存在转化率低、产品纯度低和生产规模小等问题。詹谷宇等(中国医药工业杂志,1987,18(6):252–255.)以异常汉逊酵母的静息细胞为生物催化剂，用胞苷酸(cytidinemonophosphate，cmp)和磷酸胆碱生物合成胞二磷胆碱；专利申请号201210066604.7报道了用简单原料碳、氮源，在含有多微生物培养液中生物合成cmp，并累积生成胞二磷胆碱。随分子生物学技术的发展，基因工程技术成为改良产胞二磷胆碱菌株的新手段。专利201310167034.5报道利用大肠杆菌工程菌异源表达cct酶并固定化，以磷酸胆碱和ctp为原料生物合成胞二磷胆碱；专利申请号201510702581.8报道用经改造的基因工程大肠杆菌菌株作为生物催化剂，用乳清酸和磷酸胆碱生物合成胞二磷胆碱。邓童心等(药物生物技术,2018,25(04):294–298.)通过在酵母中过表达反应关键酶cct酶而提高胞二磷胆碱的转化率和产量，以cmp和磷酸胆碱为原料，生物转化制造胞二磷胆碱，反应7h摩尔转化率可高达73.1％。

在生物法制备胞二磷胆碱方面，国外主要采用多酶催化体系，通过不同的反应途径获得目标产物。例如，在普遍使用的cmp-葡萄糖-酿酒酵母(cgs)途径中，以cmp、葡萄糖和氯化胆碱(或磷酸胆碱)为底物，使用透性化的酿酒酵母细胞将cmp和胆碱转化为胞二磷胆碱(journaloffermentationtechnology,1974,52:637–645)，并通过糖酵解途径为反应不断地提供atp(bioresourcetechnology,2009,100(20):4848–4853.)，产物的最大积累量、摩尔得率以及反应速率分别达到26.9mm、82.3％以及1.11mmol﹒l^-1﹒h^-1(bioresourcetechnology,2010,101(22):8807–8813)。在乳清酸-葡萄糖-产氨棒杆菌-大肠杆菌(ogce)途径中，以乳清酸和氯化胆碱作为催化底物，首先使用透性化的产氨棒杆菌细胞将乳清酸转化为utp并将葡萄糖分解产生atp，再使用重组大肠杆菌过表达ctp合成酶(ctps)、磷酸胆碱胞苷酰转移酶(cct)以及胆碱激酶(cki)将utp和氯化胆碱转化为胞二磷胆碱，产物的积累量、摩尔得率以及反应速率分别达到21.6mm、45.7％以及0.94mmol﹒l^-1﹒h^-1(journaloftheagriculturalchemicalsocietyofjapan,1997,61(6):956–959)。

鉴于现有的化学法存在有毒试剂与合成收率低的问题，而多酶催化法存在原料成本过高、转化率和反应速率低等问题，特提出本专利申请。

技术实现要素：

本发明的目的在于克服现有技术中的不足之处，提供一种制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，制备步骤如下：

首先，构建工程菌escherichiacolicki-cct表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶，胆碱激酶能够催化氯化胆碱形成磷酸胆碱，磷酸胆碱胞苷转移酶能够催化磷酸胆碱和ctp形成胞二磷胆碱；构建工程菌escherichiacolippk-udk表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶，聚磷酸激酶能够用于催化atp再生，胞苷激酶能够用于催化胞苷形成cmp；构建工程菌escherichiacolicmk-ndk表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶，胞苷酸激酶能够用于催化cmp形成cdp，二磷酸核苷激酶能够用于催化cdp形成ctp；

其次，对发酵得到的产酶细胞进行破碎，13000rpm离心2min收集上清液得到粗酶液，即得制备胞二磷胆碱用酶制剂。

而且，具体制备步骤如下：

⑴在大肠杆菌e.colibl21(accc11171)中表达异源的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株escherichiacolicki-cct；

⑵在大肠杆菌e.colibl21(accc11171)中表达异源的聚磷酸激酶和胞苷激酶编码基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株escherichiacolippk-udk；

⑶在大肠杆菌e.colibl21(accc11171)中表达内源的胞苷酸激酶和二磷酸激酶编码基因，构建出具有胞苷酸激酶和二磷酸激酶活性的菌株escherichiacolicmk-ndk；

⑷将上述构建的重组菌株escherichiacolicki-cct、escherichiacolippk-udk和escherichiacolicmk-ndk分别在培养基中培养，诱导产生高酶活性的胆碱激酶、磷酸胆碱胞苷转移酶、聚磷酸激酶、胞苷激酶、二磷酸激酶和胞苷酸激酶，离心收集产酶细胞；

⑸将步骤⑷中培养获得的产酶细胞escherichiacolicki-cct、escherichiacolippk-udk和escherichiacolicmk-ndk重悬于平衡缓冲液中并进行细胞破碎，破碎液经13000r/min离心20min后取上清液，即为粗酶液。

而且，所述步骤⑴中是以pet-duet质粒为载体在e.colibl21中过表达胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株e.colicki-cct；其中，所述胆碱激酶编码基因来源于具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,atcc25586)，其扩增引物为seqidno.1、seqidno.2；所述磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因来源于具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,atcc25586)，其扩增引物为seqidno.3、seqidno.4；所述质粒pet-duet的核苷酸序列为seqidno.13；

所述步骤⑵中是以pet-duet质粒为载体在e.colibl21中过表达聚磷酸激酶和胞苷激酶基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株e.colippk-udk；其中，所述聚磷酸激酶编码基因来源于类球红细菌(rhodobactersphaeroides，cgmcc1.5028)，其扩增引物为seqidno.5、seqidno.6；所述胞苷激酶编码基因来源于嗜热栖热菌(thermusthermophilus，atcc27634)，其扩增引物为seqidno.7、seqidno.8；所述质粒pet-duet的核苷酸序列为seqidno.13；

所述步骤⑶中是以pet-duet质粒为载体在e.colibl21中过表达胞苷酸激酶和二磷酸激酶基因，构建出具有胞苷酸激酶活性和二磷酸激酶活性的菌株e.colicmk-ndk；其中，所述胞苷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌(escherichiacolik12,atcc10798)，其扩增引物为seqidno.9、seqidno.10；所述二磷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌(escherichiacolik12,atcc10798)，其扩增引物为seqidno.11、seqidno.12；所述质粒pet-duet的核苷酸序列为seqidno.13。

而且，所述步骤⑷中重组菌株在培养基中培养的具体步骤为：

①试管斜面培养：用接种环从甘油保菌管中挑取3-4环划线接种于带有氨苄青霉素抗性的斜面培养基，于37℃培养箱中培养10-14h，转接1代；

②茄形瓶斜面培养：用接种环从试管斜面培养基中挑取全部菌体划线接种于带有氨苄青霉素抗性的茄形瓶斜面培养基，于37℃培养箱中培养10-14h，转接2代；

③将茄形瓶中的菌全部接种至含有带有氨苄青霉素抗性的发酵培养基中，初始通气量2l/min，溶氧控制在20％～40％(溶氧0％定义为添加了少量硫酸铜的饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧，溶氧100％定义为静止空气中的溶氧)，通过自动流加氨水控制ph在7.0，培养温度37℃；

④培养至od600＝12-14时，添加终浓度为0.1-0.3mm的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)诱导表达目的蛋白，调节诱导温度为25-30℃，诱导培养6-8h收集菌体；

⑤8000r/min、4℃离心15min收集菌体，再取生理盐水或pbs缓冲液振荡重悬清洗菌体2次，最后离心保存于-80℃冰箱备用。

而且，所述斜面培养基为：葡萄糖5g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，牛肉膏10g/l，nacl5g/l，琼脂25g/l，ph7.0-7.2，121℃灭菌20min；

所述发酵培养基为：葡萄糖20g/l，酵母提取物5g/l，玉米浆30g/l，nacl5g/l，kh2po41g/l，mgso40.5g/l，vh1mg/l，ph6.5-7.2，其中，葡萄糖115℃灭菌15min，其他成分121℃灭菌20min。

而且，所述步骤⑸中三种大肠杆菌escherichiacolicki-cct、escherichiacolippk-udk和escherichiacolicmk-ndk的细胞湿重用量与平衡缓冲液的比例g：ml依次为12：50、10：50和8：50；

或者，所述平衡缓冲液为50mmna2hpo4和/或300mmnacl，用naoh调ph至8.0；

或者，所述细胞破碎的方法为超声破碎、冻融破碎、液氮研磨破碎或者高压匀浆破碎，

高压匀浆破碎的破碎条件为：4℃，800-1000bar。

如上所述的酶制剂在胞二磷胆碱的制备方面中的应用。

利用如上所述的酶制剂催化制备胞二磷胆碱的方法，所述方法以酶制剂为催化剂，以氯化胆碱、胞苷、六偏磷酸钠和atp为底物，将酶制剂与氯化胆碱、氯化镁、六偏磷酸钠、atp、胞苷和tris-hcl缓冲液混合，进行酶催化反应，温度控制在30℃，搅拌转速控制在300r/min，反应过程中能够通过流加naoh或hcl维持ph值在8.0，合成胞二磷胆碱。

而且，反应体系中氯化胆碱的浓度为30mm，氯化镁的浓度为60mm，六偏磷酸钠的浓度为60mm，胞苷的浓度为30mm，atp的浓度为5mm，tris-hcl缓冲液的ph＝8.0、浓度为100mm。

而且，所得反应液中胞二磷胆碱的检测方法为：取反应液经沸水浴灭活后，13000r/min离心2min，取上清液用去离子水稀释至1g/l，用0.22μm的无菌膜过滤至液相瓶待分析；使用高效液相色谱测定胞二磷胆碱的含量，进样量为20μl，色谱柱为sepaxhp-sax(4.6×250mm)色谱柱，流动相为50mmkh2po4，h3po4调ph3.5，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长254nm，胞二磷胆碱保留时间为6.5min。

本发明取得的优点和积极效果为：

1、本发明首次报道了具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,atcc25586)来源的磷酸胆碱胞苷转移酶可以用于胞二磷胆碱的合成。与现有报道中普遍使用的酿酒酵母来源的磷酸胆碱胞苷转移酶相比，具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的异源可溶性表达量和酶活力更高。

2、本发明首次使用多酶催化体系实现了以胞苷和氯化胆碱为主要原料制备胞二磷胆碱的过程。与现有报道中普遍使用的cmp以及磷酸胆碱相比，原料成本更为低廉且容易获得。

3、本发明解决了多酶催化存在的转化率和反应速率低的问题，使用pet-duet质粒对反应用酶进行了串联表达，并优化了组合配比，从而简化了产酶菌株的数量。在最优的反应条件下，胞二磷胆碱对胞苷的摩尔转化率达到91.5％，反应速率达到4.58mmol﹒l^-1﹒h^-1。

4、本发明酶制剂多酶催化反应合成胞二磷胆碱，反应6h，胞二磷胆碱的摩尔产率为27.4mm，对底物胞苷的摩尔转化率为91.5％。相较于传统生产方法，本发明具有原料成本低、反应条件温和，操作简单，转化率高和反应速度快等优点。

附图说明

图1为本发明中酶催化反应的一种示意图；

图2为本发明中多酶催化反应液中胞二磷胆碱的液相色谱图；

图3为本发明中胞二磷胆碱标准品液相色谱图；

图4为本发明中酿酒酵母和具核梭杆菌来源的磷酸胆碱胞苷转移酶蛋白电泳图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明进一步说明，下属实施例是叙述性的，不是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。

本发明中所使用的原料，如无特殊说明，均为常规市售产品，本发明中所使用的方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法，本发明所用各物质质量均为常规使用质量。

一种制备胞二磷胆碱用酶制剂，制备步骤如下：

首先，构建工程菌escherichiacolicki-cct表达来源于具核梭杆菌的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶，胆碱激酶能够催化氯化胆碱形成磷酸胆碱，磷酸胆碱胞苷转移酶能够催化磷酸胆碱和ctp形成胞二磷胆碱；构建工程菌escherichiacolippk-udk表达来源于类球红细菌的聚磷酸激酶和来源于嗜热栖热菌的胞苷激酶，聚磷酸激酶能够用于催化atp再生，胞苷激酶能够用于催化胞苷形成cmp；构建工程菌escherichiacolicmk-ndk表达来源于大肠杆菌自身的胞苷酸激酶和二磷酸核苷激酶，胞苷酸激酶能够用于催化cmp形成cdp，二磷酸核苷激酶能够用于催化cdp形成ctp；

其次，对发酵得到的产酶细胞进行破碎，13000rpm离心2min收集上清液得到粗酶液，即得制备胞二磷胆碱用酶制剂。

较优地，具体制备步骤如下：

⑴在大肠杆菌e.colibl21(accc11171)中表达异源的胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株escherichiacolicki-cct；

⑵在大肠杆菌e.colibl21(accc11171)中表达异源的聚磷酸激酶和胞苷激酶编码基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株escherichiacolippk-udk；

⑶在大肠杆菌e.colibl21(accc11171)中表达内源的胞苷酸激酶和二磷酸激酶编码基因，构建出具有胞苷酸激酶和二磷酸激酶活性的菌株escherichiacolicmk-ndk；

⑷将上述构建的重组菌株escherichiacolicki-cct、escherichiacolippk-udk和escherichiacolicmk-ndk分别在培养基中培养，诱导产生高酶活性的胆碱激酶、磷酸胆碱胞苷转移酶、聚磷酸激酶、胞苷激酶、二磷酸激酶和胞苷酸激酶，离心收集产酶细胞；

⑸将步骤⑷中培养获得的产酶细胞escherichiacolicki-cct、escherichiacolippk-udk和escherichiacolicmk-ndk重悬于平衡缓冲液中并进行细胞破碎，破碎液经13000r/min离心20min后取上清液，即为粗酶液。

较优地，所述步骤⑴中是以pet-duet质粒为载体在e.colibl21中过表达胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶基因，构建出具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株e.colicki-cct；其中，所述胆碱激酶编码基因来源于具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,atcc25586)，其扩增引物为seqidno.1、seqidno.2；所述磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因来源于具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,atcc25586)，其扩增引物为seqidno.3、seqidno.4；所述质粒pet-duet的核苷酸序列为seqidno.13；

所述步骤⑵中是以pet-duet质粒为载体在e.colibl21中过表达聚磷酸激酶和胞苷激酶基因，构建出具有聚磷酸激酶和胞苷激酶活性的菌株e.colippk-udk；其中，所述聚磷酸激酶编码基因来源于类球红细菌(rhodobactersphaeroides，cgmcc1.5028)，其扩增引物为seqidno.5、seqidno.6；所述胞苷激酶编码基因来源于嗜热栖热菌(thermusthermophilus，atcc27634)，其扩增引物为seqidno.7、seqidno.8；所述质粒pet-duet的核苷酸序列为seqidno.13；

所述步骤⑶中是以pet-duet质粒为载体在e.colibl21中过表达胞苷酸激酶和二磷酸激酶基因，构建出具有胞苷酸激酶活性和二磷酸激酶活性的菌株e.colicmk-ndk；其中，所述胞苷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌(escherichiacolik12,atcc10798)，其扩增引物为seqidno.9、seqidno.10；所述二磷酸激酶编码基因来源于大肠杆菌(escherichiacolik12,atcc10798)，其扩增引物为seqidno.11、seqidno.12；所述质粒pet-duet的核苷酸序列为seqidno.13。

较优地，所述步骤⑷中重组菌株在培养基中培养的具体步骤为：

①试管斜面培养：用接种环从甘油保菌管中挑取3-4环划线接种于带有氨苄青霉素抗性的斜面培养基，于37℃培养箱中培养10-14h，转接1代；

②茄形瓶斜面培养：用接种环从试管斜面培养基中挑取全部菌体划线接种于带有氨苄青霉素抗性的茄形瓶斜面培养基，于37℃培养箱中培养10-14h，转接2代；

③将茄形瓶中的菌全部接种至含有带有氨苄青霉素抗性的发酵培养基中，初始通气量2l/min，溶氧控制在20％～40％(溶氧0％定义为添加了少量硫酸铜的饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧，溶氧100％定义为静止空气中的溶氧)，通过自动流加氨水控制ph在7.0，培养温度37℃；

④培养至od600＝12-14时，添加终浓度为0.1-0.3mm的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)诱导表达目的蛋白，调节诱导温度为25-30℃，诱导培养6-8h收集菌体；

⑤8000r/min、4℃离心15min收集菌体，再取生理盐水或pbs缓冲液振荡重悬清洗菌体2次，最后离心保存于-80℃冰箱备用。

较优地，所述斜面培养基为：葡萄糖5g/l，蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，牛肉膏10g/l，nacl5g/l，琼脂25g/l，ph7.0-7.2，121℃灭菌20min；

所述发酵培养基为：葡萄糖20g/l，酵母提取物5g/l，玉米浆30g/l，nacl5g/l，kh2po41g/l，mgso40.5g/l，vh1mg/l，ph6.5-7.2，其中，葡萄糖115℃灭菌15min，其他成分121℃灭菌20min。

较优地，所述步骤⑸中三种大肠杆菌escherichiacolicki-cct、escherichiacolippk-udk和escherichiacolicmk-ndk的细胞湿重用量与平衡缓冲液的比例g：ml依次为12：50、10：50和8：50；

或者，所述平衡缓冲液为50mmna2hpo4和/或300mmnacl，用naoh调ph至8.0；

或者，所述细胞破碎的方法为超声破碎、冻融破碎、液氮研磨破碎或者高压匀浆破碎，

高压匀浆破碎的破碎条件为：4℃，800-1000bar。

如上所述的酶制剂在胞二磷胆碱的制备方面中的应用。

利用如上所述的酶制剂催化制备胞二磷胆碱的方法，所述方法以酶制剂为催化剂，以氯化胆碱、胞苷、六偏磷酸钠和atp为底物，将酶制剂与氯化胆碱、氯化镁、六偏磷酸钠、atp、胞苷和tris-hcl缓冲液混合，进行酶催化反应，温度控制在30℃，搅拌转速控制在300r/min，反应过程中能够通过流加naoh或hcl维持ph值在8.0，合成胞二磷胆碱。

较优地，反应体系中氯化胆碱的浓度为30mm，氯化镁的浓度为60mm，六偏磷酸钠的浓度为60mm，胞苷的浓度为30mm，atp的浓度为5mm，tris-hcl缓冲液的ph＝8.0、浓度为100mm。

较优地，所得反应液中胞二磷胆碱的检测方法为：取反应液经沸水浴灭活后，13000r/min离心2min，取上清液用去离子水稀释至1g/l，用0.22μm的无菌膜过滤至液相瓶待分析；使用高效液相色谱测定胞二磷胆碱的含量，进样量为20μl，色谱柱为sepaxhp-sax(4.6×250mm)色谱柱，流动相为50mmkh2po4，h3po4调ph3.5，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长254nm，胞二磷胆碱保留时间为6.5min。

可以如图1所示。

具体地，相关制备及检测如下：

一、胆碱激酶和磷酸胆碱胞苷转移酶菌株e.colicki-cct的构建

①以具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,atcc25586)基因组为模板，根据胆碱激酶基因lica序列设计一对引物，扩增获取lica基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点ecori和hindiii(见附录〈1〉)。

②使用takara限制性内切酶ecori和hindiii双酶切步骤①中获得目的片段及pet-duet载体质粒(见附录〈7〉)，获得带有相同粘性末端的目的基因和pet-duet线性片段。

③使用takarat4dna连接酶分别连接步骤②中的基因片段，得到重组表达载体pet-duet-lica。

④以具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatum,atcc25586)基因组为模板，根据磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因licc序列，设计一对基因扩增引物，扩增获取目的基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点ecorⅴ和xhoi(见附录〈2〉)。

⑤使用takara限制性内切酶ecorⅴ和xhoi双酶切步骤③中获得的重组表达载体pet-duet-lica，获得带有相同粘性末端的目的基因和pet-duet-lica线性片段。

⑥使用takarat4dna连接酶连接步骤④中获得的基因片段，得到重组表达载体pet-duetlica-licc。

⑦将步骤⑥中的重组表达载体转化入e.colibl21(accc11171)中，获得具有胆碱激酶活性和磷酸胆碱胞苷转移酶活性的菌株e.colicki-cct。

二、聚磷酸激酶和胞苷激酶菌株e.colippk-udk的构建

①以类球红细菌(rhodobactersphaeroides，cgmcc1.5028)基因组为模板，根据聚磷酸激酶编码基因ppk序列，设计一对基因扩增引物，扩增获取目的基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点ecori和hindiii(见附录〈3〉)。

②使用takara限制性内切酶ecori和hindiii双酶切步骤①中获得目的片段pet-duet载体质粒(见附录〈7〉)，获得带有相同粘性末端的目的基因和pet-duet线性片段。

③使用takarat4dna连接酶连接步骤②中获得的基因片段，得到重组表达载体pet-duet-ppk。

④以嗜热栖热菌(thermusthermophiles,atcc27634)基因组为模板，根据胞苷激酶编码基因udk序列，设计一对基因扩增引物，扩增获取目的基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点ecorⅴ和xhoi(见附录〈4〉)。

⑤使用takara限制性内切酶ecorⅴ和xhoi双酶切步骤③中获得的重组表达载体pet-duet-ppk，获得带有相同粘性末端的目的基因和pet-duet-ppk线性片段。

⑥使用takarat4dna连接酶连接步骤④中获得的基因片段，得到重组表达载体pet-duetppk-udk。

⑦将步骤⑥中的重组表达载体转化入e.colibl21(accc11171)中，获得具有聚磷酸激酶活性和胞苷激酶活性的菌株e.colippk-udk。

三、胞苷酸激酶和二磷酸激酶菌株e.colicmk-ndk的构建

①以大肠杆菌(escherichiacolik12,atcc10798)基因组为模板，根据胞苷酸激酶编码基因cmk序列，设计一对基因扩增引物，扩增获取目的基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点ecori和hindiii(见附录〈5〉)。

②使用takara限制性内切酶ecori和hindiii双酶切步骤①中获得目的片段pet-duet载体质粒(见附录〈7〉)，获得带有相同粘性末端的目的基因和pet-duet线性片段。

③使用takarat4dna连接酶连接步骤②中获得的基因片段，得到重组表达载体pet-duet-cmk。

④以大肠杆菌(escherichiacolik12,atcc10798)基因组为模板，根据二磷酸激酶编码基因ndk序列，设计一对基因扩增引物，扩增获取目的基因片段。所述一对引物分别包含酶切位点ecorⅴ和xhoi(见附录〈6〉)。

⑤使用takara限制性内切酶ecorⅴ和xhoi双酶切步骤③中获得的重组表达载体pet-duet-cmk，获得带有相同粘性末端的目的基因和pet-duet-cmk线性片段。

⑥使用takarat4dna连接酶连接步骤④中获得的基因片段，得到重组表达载体pet-duetcmk-ndk。

⑦将步骤⑥中的重组表达载体转化入e.colibl21(accc11171)中，获得具有胞苷酸激酶活性和二磷酸激酶活性的菌株e.colicmk-ndk。

四、e.colicki-cct、e.colippk-udk和e.colicmk-ndk菌株发酵产酶及粗酶液制备

①将步骤一、二、三中的重组菌株用接种环从甘油保菌管中挑取3-4环划线接种于带有相应质粒抗性的斜面培养基，于37℃培养箱中培养12h，转接1代。

②用接种环从试管斜面培养基中挑取全部菌体划线接种于带有相应质粒抗性的茄形瓶斜面培养基，于37℃培养箱中培养12h，转接2代。

③将茄形瓶中的菌全部接种至含有3l带有相应质粒抗性的发酵培养基的5l发酵罐中。初始通气量2l/min，溶氧控制在20％～40％(溶氧0％定义为添加了少量硫酸铜的饱和亚硫酸钠溶液中的溶氧，溶氧100％定义为静止空气中的溶氧)，通过自动流加氨水控制ph在7.0，培养温度37℃。

④培养至od600＝13时，添加终浓度为0.2mm的iptg(异丙基-β-d-硫代半乳糖苷)诱导表达目的蛋白，调节诱导温度为30℃，诱导培养8h收集菌体。

⑤8000r/min、4℃离心15min低温离心收集菌体，再取适量生理盐水或pbs缓冲液振荡重悬清洗菌体2次，最后离心保存于-80℃冰箱备用。

⑥从-80℃冰箱取出12gescherichiacolicki-cct湿菌体细胞、10gescherichiacolippk-udk湿菌体细胞和8gescherichiacolicmk-ndk湿菌体细胞，分别重悬于50ml平衡缓冲液中(50mmna2hpo4、300mmnacl，用naoh调ph至8.0)。重悬均匀后，进行高压匀浆破碎细胞，破碎条件为：4℃，1000bar，破碎液经13000r/min离心20min后取上清液，即为粗酶液。

五、多酶催化合成胞二磷胆碱

①配制反应体系，其中氯化胆碱浓度为30mm、硫酸镁浓度为60mm、六偏磷酸钠浓度为60mm、胞苷浓度为30mm、atp的浓度为5mm，tris-hcl缓冲液(ph8.0)的浓度为100mm。5l发酵罐中进行酶催化反应，温度控制在30℃，搅拌转速控制在300r/min。反应过程中可以通过流加naoh或hcl维持ph值在8.0。

六、反应液中胞二磷胆碱的检测

取适量体积的反应液经沸水浴灭活后，13000r/min离心2min，取上清液用去离子水稀释至1g/l，用0.22μm的无菌膜过滤至液相瓶待分析。使用高效液相色谱测定胞苷酸的含量，进样量为20μl，色谱柱为sepaxhp-sax(4.6×250mm)色谱柱，流动相为50mmkh2po4(h3po4调ph3.5)，柱温30℃，流速1ml/min，检测波长254nm。经高效液相色谱检测，反应情况如图2、图3和表1所示。

表1酶催化反应结果

七、不同来源的磷酸胆碱胞苷转移酶活性对比

根据现有技术中普遍使用的酿酒酵母saccharomycescerevisiaes288c来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的基因序列，设计引物(5'

atgggtcgcggatccgaattcatggccaatccgacaaccg3'和5'

ctcgagtgcggccgcaagcttttagttggcgctctgcttcttc3')并从saccharomycescerevisiaes288c基因组中扩增目的基因，经5`端ecorⅰ和3`端hindⅲ酶切连接至pet-28a质粒获得重组质粒pet-28a-cctsc。将重组质粒转化到e.colibl21感受态细胞中获得重组菌株e.colibl21pet-28a-cctsc。

根据本发明中使用的具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatumatcc25586)来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的基因序列，设计引物(5'

atgggtcgcggatccgaattcgaattcatgaaacgtaacgcga3'和5'

ctcgagtgcggccgcaagcttaagcttttagctgctgtgcagtt3')并从fusobacteriumnucleatumatcc25586基因组中扩增目的基因，经5`端ecorⅰ和3`端hindⅲ酶切连接至pet-28a质粒获得重组质粒pet-28a-liccfn。将重组质粒转化到e.colibl21感受态细胞中获得重组菌株e.colibl21pet-28a-liccfn。

对上述构建重组菌株分别进行培养，经iptg诱导产酶后收集菌体，破碎细胞提取粗酶液，使用sds-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定酶的表达情况，如图4所示。加入底物进行酶催化反应测试磷酸胆碱胞苷转移酶的活性。酶活测定条件为ctp10mm，磷酸胆碱10mm，atp10mm，硫酸镁30mm，tris-hcl缓冲液(ph8.0)50mm，粗酶液(蛋白浓度)50mg/l。以30℃，每分钟催化形成1μm胞二磷胆碱定义为1个酶活力单位。测定结果如表1所示。

表2不用来源磷酸胆碱胞苷转移酶的酶活力比较

实验结果表明，具核梭杆菌(fusobacteriumnucleatumatcc25586)来源的磷酸胆碱胞苷转移酶的可溶性表达更好。该酶的比酶活是酿酒酵母saccharomycescerevisiaes288c来源磷酸胆碱胞苷转移酶的3.12倍。

尽管为说明目的公开了本发明的实施例，但是本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明及所附权利要求的精神和范围内，各种替换、变化和修改都是可能的，因此，本发明的范围不局限于实施例所公开的内容。

附录

〈1〉具核梭杆菌的胆碱激酶编码基因酶切位点及扩增引物

5'ccgaattcatgaatgcaataataat3'ecori

5'gtgaagcttttactccatatctgtaagat3'hindiii

〈2〉具核梭杆菌的磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因酶切位点及扩增引物

5'ccgatatcatgaatgccatcatcat3'ecorⅴ

5'gtgctcgagttagctgctgtgcagttcga3'xhoi

〈3〉类球红细菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物

5'ccgaattcatggccgaagatcgtgctat3'ecori

5'cgcaagctttcaaccttgacgcggtttac3'hindiii

〈4〉嗜热栖热菌的胞苷激酶编码基因酶切位点及扩增引物

5'ccgatatcgtgagcgccccgaaacc3'ecorⅴ

5'gtgctcgagttaggctgcgcccatacgtg3'xhoi

〈5〉大肠杆菌的胞苷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物

5'ccgaattcatgacggcaattgcccc3'ecori

5'cgcaagcttttatgcgagagccaatttct3'hindiii

〈6〉大肠杆菌的二磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物

5'ccgatatcatggctattgaacgtac3'ecorⅴ

5'gtgctcgagttaacgggtgcgcgggcaca3'xhoi

〈7〉pet-duet质粒

ggggaattgtgagcggataacaattcccctctagaaataattttgtttaactttaagaaggagatataccatgggcagcagccatcaccatcatcaccacagccaggatccgaattcgagctcggcgcgcctgcaggtcgacaagcttgcggccgcataatgcttaagtcgaacagaaagtaatcgtattgtacacggccgcataatcgaaattaatacgactcactataggggaattgtgagcggataacaattccccatcttagtatattagttaagtataagaaggagatatacatatggcagatctcaattggatatcggccggccacgcgatcgctgacgtcggtaccctcgagtctggtaaagaaaccgctgctgcgaaatttgaacgccagcacatggactcgtctactagcgcagcttaattaacctaggctgctgccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggaactatatccggattggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgccagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttctggcggcacgatggcatgagattatcaaaaaggatcttcacctagatccttttaaattaaaaatgaagttttaaatcaatctaaagtatatatgagtaaacttggtctgacagttaccaatgcttaatcagtgaggcacctatctcagcgatctgtctatttcgttcatccatagttgcctgactccccgtcgtgtagataactacgatacgggagggcttaccatctggccccagtgctgcaatgataccgcgagacccacgctcaccggctccagatttatcagcaataaaccagccagccggaagggccgagcgcagaagtggtcctgcaactttatccgcctccatccagtctattaattgttgccgggaagctagagtaagtagttcgccagttaatagtttgcgcaacgttgttgccattgctacaggcatcgtggtgtcacgctcgtcgtttggtatggcttcattcagctccggttcccaacgatcaaggcgagttacatgatcccccatgttgtgcaaaaaagcggttagctccttcggtcctccgatcgttgtcagaagtaagttggccgcagtgttatcactcatggttatggcagcactgcataattctcttactgtcatgccatccgtaagatgcttttctgtgactggtgagtactcaaccaagtcattctgagaatagtgtatgcggcgaccgagttgctcttgcccggcgtcaatacgggataataccgcgccacatagcagaactttaaaagtgctcatcattggaaaacgttcttcggggcgaaaactctcaaggatcttaccgctgttgagatccagttcgatgtaacccactcgtgcacccaactgatcttcagcatcttttactttcaccagcgtttctgggtgagcaaaaacaggaaggcaaaatgccgcaaaaaagggaataagggcgacacggaaatgttgaatactcatactcttcctttttcaatcatgattgaagcatttatcagggttattgtctcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggtcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgctagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatgtccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagcccgatcttccccatcggtgatgtcggcgatataggcgccagcaaccgcacctgtggcgccggtgatgccggccacgatgcgtccggcgtagaggatcgagatcgatctcgatcccgcgaaattaatacgactcactata。

序列表

<110>天津科技大学

<120>制备胞二磷胆碱用酶制剂以及酶催化制备胞二磷胆碱的方法

<160>13

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>25

<212>dna

<213>具核梭杆菌的胆碱激酶编码基因酶切位点及扩增引物1(unknown)

<400>1

ccgaattcatgaatgcaataataat25

<210>2

<211>29

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<213>具核梭杆菌的胆碱激酶编码基因酶切位点及扩增引物2(unknown)

<400>2

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<213>具核梭杆菌的磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因酶切位点及扩增引物1(unknown)

<400>3

ccgatatcatgaatgccatcatcat25

<210>4

<211>29

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<213>具核梭杆菌的磷酸胆碱胞苷转移酶编码基因酶切位点及扩增引物2(unknown)

<400>4

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<210>5

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<213>类球红细菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物1(unknown)

<400>5

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<213>类球红细菌的聚磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物2(unknown)

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<213>嗜热栖热菌的胞苷激酶编码基因酶切位点及扩增引物1(unknown)

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<213>嗜热栖热菌的胞苷激酶编码基因酶切位点及扩增引物2(unknown)

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<210>9

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<213>大肠杆菌的胞苷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物1(unknown)

<400>9

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<210>10

<211>29

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<213>大肠杆菌的胞苷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物2(unknown)

<400>10

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<210>11

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<213>大肠杆菌的二磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物1(unknown)

<400>11

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<210>12

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<213>大肠杆菌的二磷酸激酶编码基因酶切位点及扩增引物2(unknown)

<400>12

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<210>13

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<213>pet-duet质粒(unknown)

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