[0001]
本发明属于铁皮石斛多糖技术领域，具体为一种铁皮石斛多糖及其制备方法。
背景技术：
[0002]
铁皮石斛性微寒，味甘、淡。具有滋阴清热、养胃生津之功效。可用于治疗具有阴虚证的急性及慢性咽喉炎、慢性支气管炎、结核病、甲状腺功能亢进、糖尿病、慢性肝炎、慢性萎缩性胃炎、免疫功能综合征和癌症放化疗调理等病症，并可增强中老抗病能力。
[0003]
但是现有的技术在对铁皮石斛内部的糖分进行提取时，不但效率低下，且在提取过程中极易造成材料损失，加大了成本。因此需要对铁皮石斛多糖的制备方法加以改进，同时提出一种铁皮石斛多糖及其制备方法，便于更好的解决上述提出的问题。
技术实现要素：
[0004]
本发明的目的在于：为了解决上述提出的问题，提供一种铁皮石斛多糖及其制备方法。
[0005]
本发明采用的技术方案如下：
[0006]
一种铁皮石斛多糖及其制备方法，包括铁皮石斛根部，所述的一种铁皮石斛多糖及其制备方法包括以下步骤：
[0007]
步骤一：提取多糖，采用水提醇沉法从铁皮石斛根茎中提取粗多糖，结合反复冻融、h2o2脱色、超滤、透析等分离纯化方法,分别得到两种分子量均一的铁皮石斛多糖dop-1和dop-2；
[0008]
步骤二：物质分析，采用苯酚-硫酸法测得dop-1和dop-2的糖含量分别为99.47％、97.46％，高效凝胶渗透色谱法测得两种多糖的分子量分别为4.929
×
105da、3.339
×
104da，通过紫外光谱定性扫描以及蛋白质含量定量检测,发现两种铁皮石斛多糖基本不含核酸和蛋白质，间羟基联苯法确定dop-1和dop-2均不含糖醛酸，采用folin
–
ciocalteu法对铁皮石斛多糖的总酚含量进行测定,结果表明dop-1和dop-2的总酚含量分别为147.25mg/kg、918.67mg/kg，通过对两种多糖的纯度鉴定可知,dop-1和dop-2成分均一,纯度高,满足对多糖类物质结构鉴定的要求；
[0009]
步骤三：结构单元测定，单糖组成结果表明两种多糖均含有葡萄糖和甘露糖,组成比分别为1.00:1.38、1.00:4.06，高碘酸氧化-smith降解法的分析结果表明两种多糖末端连接或1.6-连接的糖残基类型含量较低,主要由氧化降解为赤藓醇的1.4-连接或1.4.6-连接的糖残基组成，甲基化分析结果表明,dop-1的主要连接类型为1,4-连接的葡萄糖和1.4-连接的甘露糖,糖残基比例为1.00:1.78；dop-2主要由1.4-连接的葡萄糖、1.4-连接的甘露糖和1.6-连接的葡萄糖组成,糖残基比例为1.90:14.10:1.00，结合红外扫描图谱、smith降解gc结果以及nmr图谱的结果进行分析,表明两种多糖的乙酰基均连在1.4-β-d-manp的2位或3位,dop-1和dop-2的乙酰化比例分别约为50％、30％。由于dop-2分子量较小,溶解度高,粘度相对dop-1低,其2d核磁检测相关峰响应较好,可通过1d和2d nmr图谱对dop-2的结构
进一步确定,并推测出dop-2的重复结构单元；
[0010]
步骤四：体外抗氧活化性测定，体外抗氧化活性的测定采用了三个抗氧化体系,包括dpph自由基清除体系、羟基自由基清除体系和超氧阴离子自由基清除体系，结果表明,dop-1和dop-2对三种自由基均具有较高的体外抗氧化能力,dop-2的羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力高于dop-1,可能与其分子量较低、溶解度较高、甘露糖含量较高、乙酰化程度较低以及多酚含量较高有关。此外,选用h2o2建立氧化损伤细胞模型,研究铁皮石斛多糖dop-1和dop-2对氧化损伤hep g2细胞存活率的影响，结果表明,dop-1和dop-2对氧化损伤hep g2细胞均有一定的保护作用,在浓度为800μg/m l时,细胞存活率均达到90％以上。同时,dop-1和dop-2均能够降低氧化损伤hep g2细胞内活性氧的强度。
[0011]
步骤五：组合制备，将上述步骤完成后，将dop-1和dop-2进行粉碎，随后加入约220度的水进行浸泡并加热，当dop-1和dop-2出现分散情况后停止加热，将其中残渣进行过滤，提取浓缩液；
[0012]
步骤六：沉淀干燥，完成步骤五后将浓缩液采用水提醇沉法去除上面漂浮的清液，随后在高温下进行沉淀干燥，最终得到铁皮石斛多糖。
[0013]
在一优选的实施方式中，所述水提醇沉法系指在中药水提浓缩液中，加入乙醇使达不同含醇量，某些药物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固液分离后使水提液得以精制的方法，一般操作过程是：将中药水提液浓缩至1︰1～1︰2(ml︰g)，药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇使达规定含醇量，密闭冷藏24～48h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液。操作时应注意以下问题：
[0014]
①
药液应适当浓缩，以减少乙醇用量。但应控制浓缩程度，若过浓，有效成分易包裹于沉淀中而造成损失；
[0015]
②
浓缩的药液冷却后方可加入乙醇，以免乙醇受热挥发损失；
[0016]
③
选择适宜的醇沉浓度，一般药液中含醇量达50％～60％可除去淀粉等杂质，含醇量达75％以上大部分杂质均可沉淀除去；
[0017]
④
慢加快搅，应快速搅动药液，缓缓加入乙醇，以避免局部醇浓度过高造成有效成分被包裹损失；
[0018]
⑤
密闭冷藏，可防止乙醇挥发，促进析出沉淀的沉降，便于滤过操作；
[0019]
⑥
洗涤沉淀，沉淀采用乙醇(浓度与药液中的乙醇浓度相同)洗涤可减少有效成分在沉淀中的包裹损失。
[0020]
在一优选的实施方式中，所述苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定，此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久，测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1
--
0.3之间。比如:小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
[0021]
在一优选的实施方式中，所述dpph为1.1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名1.1-二苯基-2-苦肼基(自由基)，1.2-二苦基-2-三硝基苯亚肼，1.2-二苯基-2-苦肼基，是一个稳定的自由基，为暗紫色棱柱状结晶，熔点127～129℃，最大吸收波长528nm，可用于光度测定生育酚和脂肪族硫醇类、还原物质的分析试剂，也是常用的阻聚剂，pph具有几个不同结晶形态，它们的晶格对称性和熔点(m.p.)存在差异，商品化的粉末是不同晶相的混合物，熔点在
130℃附近。dpph
-ⅰ
(m.p.106℃)是正交晶系，dpph
-ⅱ
(m.p.137℃)是无定形态，dpph
-ⅲ
(m.p.128-129℃)是三斜晶系，dpph是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的ππ共-轭作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用，作为一种稳定的自由基，dpph可以捕获("清除")其他的自由基，因此通过加入dpph后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标，由于dpph自由基在以300～400之间为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。利用这一特性可以直观地检测反应的过程，通过记录dpph在在520nm吸光度值或者epr信号的变化可以得到初始自由基的量。
[0022]
在一优选的实施方式中，所述羟基自由基是一种重要的活性氧，从分子式上看是由氢氧根失去一个电子形成，羟基自由基具有极强的得电子能力也就是氧化能力，氧化电位2.8v，是自然界中仅次于氟的氧化剂，所述羟基自由基采用三维电极法时，能在较短时间内达到优异的水处理效果，比色法的测定结果发现，不锈钢电极材料在电催化降解过程中产生了氧化能力极强的
·
oh，在复极性三维电解槽中在填充粒子和通入空气条件下的电化学氧化过程中，利用阳极的直接氧化作用、阳极
·
oh和阴极产生h2o2的间接氧化作用，从而在较低能耗的情况下，充分提高填充粒子的利用率，达到了较好的降解效果。
[0023]
在一优选的实施方式中，所述超氧阴离子为需氧生物体内氧分子作为最重要的电子受体在物质代谢过程中被还原成水:o2+4e
→
2h2o，如此利用的氧约占组织耗氧总量的95％，其余5％的氧在还原过程中由于接受电子数目不等可以形成多种性质活泼的活性氧，氧分子受单一电子还原的产物称为超氧阴离子o2+e
→
o2，o2是阴离子，又是自由基，性质活泼，具有很强的氧化性和还原性，既是氧化剂，又是还原剂。
[0024]
综上所述，由于采用了上述技术方案，本发明的有益效果是:不但提高了铁皮石斛的糖分含量，且在制备过程中更为节省原料，通过羟基自由基与超氧阴离子有效的加快了反应速率。
[0025]
1、本发明中，羟基自由基是一种重要的活性氧，从分子式上看是由氢氧根失去一个电子形成，羟基自由基具有极强的得电子能力也就是氧化能力，氧化电位2.8v，是自然界中仅次于氟的氧化剂，所述羟基自由基采用三维电极法时，能在较短时间内达到优异的水处理效果，比色法的测定结果发现，不锈钢电极材料在电催化降解过程中产生了氧化能力极强的
·
oh，在复极性三维电解槽中在填充粒子和通入空气条件下的电化学氧化过程中，利用阳极的直接氧化作用、阳极
·
oh和阴极产生h2o2的间接氧化作用，从而在较低能耗的情况下，充分提高填充粒子的利用率，达到了较好的降解效果。
[0026]
2、本发明中，超氧阴离子为需氧生物体内氧分子作为最重要的电子受体在物质代谢过程中被还原成水:o2+4e
→
2h2o，如此利用的氧约占组织耗氧总量的95％，其余5％的氧在还原过程中由于接受电子数目不等可以形成多种性质活泼的活性氧，氧分子受单一电子还原的产物称为超氧阴离子o2+e
→
o2，o2是阴离子，又是自由基，性质活泼，具有很强的氧化性和还原性，既是氧化剂，又是还原剂，有效的提高了氧化速率，且更为节省原料。
具体实施方式
[0027]
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限
定本发明。
[0028]
一种铁皮石斛多糖及其制备方法，包括铁皮石斛根部，一种铁皮石斛多糖及其制备方法包括以下步骤：
[0029]
步骤一：提取多糖，采用水提醇沉法从铁皮石斛根茎中提取粗多糖，结合反复冻融、h2o2脱色、超滤、透析等分离纯化方法,分别得到两种分子量均一的铁皮石斛多糖dop-1和dop-2；
[0030]
步骤二：物质分析，采用苯酚-硫酸法测得dop-1和dop-2的糖含量分别为99.47％、97.46％，高效凝胶渗透色谱法测得两种多糖的分子量分别为4.929
×
105da、3.339
×
104da，通过紫外光谱定性扫描以及蛋白质含量定量检测,发现两种铁皮石斛多糖基本不含核酸和蛋白质，间羟基联苯法确定dop-1和dop-2均不含糖醛酸，采用folin
–
ciocalteu法对铁皮石斛多糖的总酚含量进行测定,结果表明dop-1和dop-2的总酚含量分别为147.25mg/kg、918.67mg/kg，通过对两种多糖的纯度鉴定可知,dop-1和dop-2成分均一,纯度高,满足对多糖类物质结构鉴定的要求；
[0031]
步骤三：结构单元测定，单糖组成结果表明两种多糖均含有葡萄糖和甘露糖,组成比分别为1.00:1.38、1.00:4.06，高碘酸氧化-smith降解法的分析结果表明两种多糖末端连接或1.6-连接的糖残基类型含量较低,主要由氧化降解为赤藓醇的1.4-连接或1.4.6-连接的糖残基组成，甲基化分析结果表明,dop-1的主要连接类型为1,4-连接的葡萄糖和1.4-连接的甘露糖,糖残基比例为1.00:1.78；dop-2主要由1.4-连接的葡萄糖、1.4-连接的甘露糖和1.6-连接的葡萄糖组成,糖残基比例为1.90:14.10:1.00，结合红外扫描图谱、smith降解gc结果以及nmr图谱的结果进行分析,表明两种多糖的乙酰基均连在1.4-β-d-manp的2位或3位,dop-1和dop-2的乙酰化比例分别约为50％、30％。由于dop-2分子量较小,溶解度高,粘度相对dop-1低,其2d核磁检测相关峰响应较好,可通过1d和2d nmr图谱对dop-2的结构进一步确定,并推测出dop-2的重复结构单元；
[0032]
步骤四：体外抗氧活化性测定，体外抗氧化活性的测定采用了三个抗氧化体系,包括dpph自由基清除体系、羟基自由基清除体系和超氧阴离子自由基清除体系，结果表明,dop-1和dop-2对三种自由基均具有较高的体外抗氧化能力,dop-2的羟基自由基和超氧阴离子自由基清除能力高于dop-1,可能与其分子量较低、溶解度较高、甘露糖含量较高、乙酰化程度较低以及多酚含量较高有关。此外,选用h2o2建立氧化损伤细胞模型,研究铁皮石斛多糖dop-1和dop-2对氧化损伤hep g2细胞存活率的影响，结果表明,dop-1和dop-2对氧化损伤hep g2细胞均有一定的保护作用,在浓度为800μg/m l时,细胞存活率均达到90％以上。同时,dop-1和dop-2均能够降低氧化损伤hep g2细胞内活性氧的强度。
[0033]
步骤五：组合制备，将上述步骤完成后，将dop-1和dop-2进行粉碎，随后加入约220度的水进行浸泡并加热，当dop-1和dop-2出现分散情况后停止加热，将其中残渣进行过滤，提取浓缩液；
[0034]
步骤六：沉淀干燥，完成步骤五后将浓缩液采用水提醇沉法去除上面漂浮的清液，随后在高温下进行沉淀干燥，最终得到铁皮石斛多糖。
[0035]
水提醇沉法系指在中药水提浓缩液中，加入乙醇使达不同含醇量，某些药物成分在醇溶液中溶解度降低析出沉淀，固液分离后使水提液得以精制的方法，一般操作过程是：将中药水提液浓缩至1︰1～1︰2(ml︰g)，药液放冷后，边搅拌边缓慢加入乙醇使达规定含醇
量，密闭冷藏24～48h，滤过，滤液回收乙醇，得到精制液。操作时应注意以下问题：
[0036]
①
药液应适当浓缩，以减少乙醇用量。但应控制浓缩程度，若过浓，有效成分易包裹于沉淀中而造成损失；
[0037]
②
浓缩的药液冷却后方可加入乙醇，以免乙醇受热挥发损失；
[0038]
③
选择适宜的醇沉浓度，一般药液中含醇量达50％～60％可除去淀粉等杂质，含醇量达75％以上大部分杂质均可沉淀除去；
[0039]
④
慢加快搅，应快速搅动药液，缓缓加入乙醇，以避免局部醇浓度过高造成有效成分被包裹损失；
[0040]
⑤
密闭冷藏，可防止乙醇挥发，促进析出沉淀的沉降，便于滤过操作；
[0041]
⑥
洗涤沉淀，沉淀采用乙醇(浓度与药液中的乙醇浓度相同)洗涤可减少有效成分在沉淀中的包裹损失。
[0042]
苯酚-硫酸法是利用多糖在硫酸的作用下先水解成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚生成橙黄色化合物，再以比色法测定，此法简单、快速、灵敏、重复性好，对每种糖仅制作一条标准曲线，颜色持久，测定时根据光密度值确定取样的量。光密度值最好在0.1
--
0.3之间。比如:小于0.1之下可以考虑取样品时取2克，仍取0.2ml样品液，如大于0.3可以减半取0.1ml的样品液测定。
[0043]
dpph为1.1-二苯基-2-三硝基苯肼，别名1.1-二苯基-2-苦肼基(自由基)，1.2-二苦基-2-三硝基苯亚肼，1.2-二苯基-2-苦肼基，是一个稳定的自由基，为暗紫色棱柱状结晶，熔点127～129℃，最大吸收波长528nm，可用于光度测定生育酚和脂肪族硫醇类、还原物质的分析试剂，也是常用的阻聚剂，pph具有几个不同结晶形态，它们的晶格对称性和熔点(m.p.)存在差异，商品化的粉末是不同晶相的混合物，熔点在130℃附近。dpph
-ⅰ
(m.p.106℃)是正交晶系，dpph
-ⅱ
(m.p.137℃)是无定形态，dpph
-ⅲ
(m.p.128-129℃)是三斜晶系，dpph是一种很稳定的氮中心的自由基，它的稳定性主要来自3个苯环的ππ共-轭作用及空间障碍，使夹在中间的氮原子上不成对的电子不能发挥其应有的电子成对作用，作为一种稳定的自由基，dpph可以捕获("清除")其他的自由基，因此通过加入dpph后观察某一化学反应的速率是否减慢，来作为这一反应是否具有自由基反应本质的指标，由于dpph自由基在以300～400之间为中心处具有强烈的吸收，因此在溶液中呈现深紫色，并且在被中和之后会变为无色或浅黄色。利用这一特性可以直观地检测反应的过程，通过记录dpph在在520nm吸光度值或者epr信号的变化可以得到初始自由基的量。
[0044]
羟基自由基是一种重要的活性氧，从分子式上看是由氢氧根失去一个电子形成，羟基自由基具有极强的得电子能力也就是氧化能力，氧化电位2.8v，是自然界中仅次于氟的氧化剂，所述羟基自由基采用三维电极法时，能在较短时间内达到优异的水处理效果，比色法的测定结果发现，不锈钢电极材料在电催化降解过程中产生了氧化能力极强的
·
oh，在复极性三维电解槽中在填充粒子和通入空气条件下的电化学氧化过程中，利用阳极的直接氧化作用、阳极
·
oh和阴极产生h2o2的间接氧化作用，从而在较低能耗的情况下，充分提高填充粒子的利用率，达到了较好的降解效果。
[0045]
超氧阴离子为需氧生物体内氧分子作为最重要的电子受体在物质代谢过程中被还原成水:o2+4e
→
2h2o，如此利用的氧约占组织耗氧总量的95％，其余5％的氧在还原过程中由于接受电子数目不等可以形成多种性质活泼的活性氧，氧分子受单一电子还原的产物
称为超氧阴离子o2+e
→
o2，o2是阴离子，又是自由基，性质活泼，具有很强的氧化性和还原性，既是氧化剂，又是还原剂。
[0046]
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。