一种辣椒耐热基因及其应用的制作方法

1.本发明涉及植物分子生物学技术领域，具体涉及一种辣椒的耐热基因及其应用。


背景技术：

2.辣椒是一年或多年生草本植物，是全球继豆类、番茄之后的第三大蔬菜作物，也是我国第一大蔬菜作物，在蔬菜周年供应和农民增收中占重要地位。辣椒营养价值丰富，其深加工制品，如辣椒素和辣椒红素等被广泛应用于医药、食品、化工等行业。高温作为主要的非生物胁迫因子之一，严重影响辣椒的生长发育、产量及品质。随着全球气候变暖，气候异常的天气时有发生，高温导致的辣椒花粉败育、落花落果、产量及品质下降等现象日趋严重。
3.根据ippc的推测，到21世纪末，全球气温可能上升2
‑
5℃。因此在辣椒生产过程中须选育耐热新品种,以提高辣椒的产量与品质。面对高温给辣椒产业带来的严峻考验，选育和推广耐高温辣椒新品种是解决这一问题最高效的手段，而收集、鉴定耐高温辣椒种质资源、挖掘耐高温基因资源是决定耐热辣椒新品种选育工作进程的最关键因素。
4.谷胱甘肽s
‑
转移酶(glutathiones
‑
transferase，gst)普遍存在于动植物和微生物中，是一类功能丰富的超基因家族，在调控植物的生长发育、代谢、逆境胁迫及信号转导等过程中起重要作用。目前，一些植物的gst基因已被证实，其功能多样广泛参与植物的生长发育和逆境胁迫等过程，但还没有有关辣椒耐热基因的报道出现。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种辣椒耐热相关的基因、编码的蛋白、扩增耐热基因的引物、表达载体及它们在提高植物耐热性中的应用。
6.一种辣椒耐热基因，其核苷酸序列如seq id no.1所示，命名为cagstu23。
7.本发明分析了辣椒耐热基因的启动子区域，发现该区域含有响应高温胁迫的顺式作用原件。
8.所述的辣椒耐热基因编码的蛋白，其氨基酸序列如seq id no.2所示。
9.扩增所述辣椒耐热基因的引物，序列为：
10.f：tctcgagctttcgcgagctcatggctgaggaaaacaaagt，如seq id no.4所示；
11.r：aggtcgactctagaggatcctcacttggtgctggatttt，如seq id no.5所示。
12.本发明构建了一种表达上述辣椒耐热基因的表达载体。
13.所述的辣椒耐热基因，或者该基因编码的蛋白在提高植物耐热能力中的应用。所述的植物包括：辣椒、拟南芥。耐热具体标准为40℃。
14.本发明提供的辣椒耐热基因能显著增强拟南芥的耐热能力。
15.本发明的有益效果为：本发明提供了辣椒的耐热基因cagstu23，该基因可调控辣椒的耐热性，在拟南芥中超表达该基因提高了拟南芥的耐热性，不仅为辣椒耐高温新品种选育提供了参考，还为植物耐热基因提供了新的资源。
附图说明
16.图1为cagst家族的进化树图(辣椒、水稻、拟南芥)。
17.图2为高温胁迫下cagst家族基因的表达量。
18.图3为cagstu23启动子的顺式作用元件预测统计图。
19.图4为高温胁迫下转cagstu23过表达载体拟南芥耐热性表型图。
20.图5为cagstu23在高温胁迫下的表达情况。
21.图6为高温胁迫下转基因株系cagstu23和野生型wt中mda的含量图。
22.注：本发明中所述高温处理指40℃处理，对照为22
±
2℃培养；图中wt
‑
hs为高温胁迫处理的野生型拟南芥植株；oe
‑
hs为高温胁迫处理的cagstu23转基因拟南芥株系；wt
‑
ck为对照组的野生型拟南芥植株；oe
‑
hs为对照组的cagstu23转基因拟南芥株系。
具体实施方式
23.下面结合实施例对本发明做进一步的描述说明，但以下实例仅用来详细说明本发明，并不是对本发明范围的限制。
24.以下实例中所涉及的仪器设备、试剂、试验方法，如无特别说明，均为常规方法。
25.实施例1：辣椒gst家族的进化树构建
26.研究表明，谷胱甘肽s
‑
转移酶(gsts)是一类普遍存在的多功能基因超家族，在调控植物的生长发育、初生代谢、次生代谢、信号转导、胁迫响应等过程中起重要作用。根据氨基酸序列的相似性，gsts家族被分为phi(f)、tau(u)、theta(t)、zeta(z)、lambda(l)、脱氢抗坏血酸还原酶(dhar)、真核翻译延伸因子1b的γ
‑
亚基(ef1bγ),四氯氢醌脱卤素酶(tchqd)、微粒体前列腺素e合成酶
‑
2(mpges
‑
2),谷胱甘肽氢醌还原酶(ghr)、毒素、ure2p、血红蛋白(h)和iota(i)十四个亚家族。gsts家族功能多样，不同成员其功能也不同。如：u和f亚族在植物中含量最高，并且在异源物质代谢中起主要作用；t亚族主要参与氧化代谢；z亚族参与谷胱甘肽依赖性的反应，并将马来酰乙酰乙酸转化为富马酸乙酯；l和dhar亚族可作为硫醇转移酶，将丝氨酸残基替换为半胱氨酸；ure2p亚族在谷胱甘肽稳定中起作用；mpges
‑
2,ghr,毒素,h和i亚族具有半胱氨酸的活性；目前未见有关ef1bγ亚族功能描述的报道。但目前对于辣椒响应高温胁迫时gsts的作用并无报道。
27.因此，本发明基于转录组学和分子生物学方法，对gsts家族基因与辣椒耐热性的关系进行了分析。
28.比如，基于pfam数据库(http://pfam.xfam.org/)中提供的gst蛋白的hmm模型(pf00043)，利用hmmsearch软件鉴定zunla
‑
1中包含的候选gsts，剔除不完整结构域的成员后，最终保留80个cagsts。
29.从zunla
‑
1基因组中提取cagsts的氨基酸序列、cdna序列和启动子区域序列。利用mega
‑
x软件对80个cagsts的氨基酸序列进行比对，并基于邻接法构建了该家族的系统发育进化树(图1)。基于pepperhub数据库中提供的高温胁迫下辣椒叶片的表达谱数据和课题组已公开的转录组数据(prjna550288)筛选热胁迫响应cagsts，共8个。通过实时荧光定量pcr实验，验证高温胁迫下这些基因的表达情况，q
‑
pcr引物(表1)。
30.表1 q
‑
pcr引物序列
[0031][0032]
上表1中序列如seq id no.6
‑
27所示。
[0033]
q
‑
pcr结果表明，高温胁迫下80个cagsts基因中，包括cagstu23在内的8个基因被诱导表达，其中cagstu23基因受高温诱导最为显著(图2)。
[0034]
利用tbtools软件提取cagstu23的核苷酸序列及启动子区域(转录起始位点上游2kb的序列)，如seq id no.3所示。
[0035]
利用在线工具plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)
[0036]
分析cagstu23的顺式作用元件，结果表明，cagstu23启动子区域包含于高温胁迫响应元件caat
‑
box(图3)。
[0037]
综上，cagstu23基因参与辣椒对高温胁迫的响应过程。
[0038]
实施例2：耐高温拟南芥的转化
[0039]
为验证cagstu23基因在植物抵抗高温胁迫时的作用，构建了cagstu23过表达拟南芥植株(oe)。
[0040]
构建pc1300s
‑
cagstu23载体，利用农杆菌(gv3101)介导的拟南芥蘸花法将载体转化拟南芥(wt)，得到t0代阳性拟南芥转化植株(潮霉素抗性)。
[0041]
具体步骤如下：
[0042]
a)目的片段扩增
[0043]
利用引物
[0044]
f：tctcgagctttcgcgagctcatggctgaggaaaacaaagt
[0045]
r：aggtcgactctagaggatcctcacttggtgctggatttt
[0046]
以17cl30(辣椒耐热材料，wang et al，2019)基因组dna为模板进行pcr扩增，获得目的片段。pcr扩增体系与反应程序如下：
[0047]
pcr体系：
[0048][0049]
pcr程序
[0050][0051]
b)目的片段克隆至植物表达载体及阳性克隆筛选
[0052]
pc1300s载体(天问生物)用saci与bamhi双酶切处理并回收，与步骤a)的pcr扩增产物进行重组，重组产物转化大肠杆菌(dh5α)，涂抗性平板(卡那霉素)。挑选克隆子摇菌，进行菌落pcr验证阳性克隆，然后进行测序验证。
[0053]
c)拟南芥植株准备
[0054]
在营养土上点播拟南芥，土壤吸水后22
±
2℃培养至开花期备用。
[0055]
d)农杆菌菌液制备
[0056]
lb培养基培养菌液(gv3101)，收集菌体置于5％蔗糖溶液(现配现用)，加入0.01％的表面活性剂sliwet
‑
77。
[0057]
e)蘸花法转化拟南芥
[0058]
去除已结实的果荚，将拟南芥花浸入农杆菌液中(60s)，保湿过夜，一周后再次转化。
[0059]
f)阳性植株筛选
[0060]
转化植株收种，利用次氯酸钠消毒后接种于含50mg/l卡那霉素的ms培养基中，22
±
2℃培养一周后挑选正常萌发的阳性植株种植于土壤中，培养管理至收种。
[0061]
转基因苗pcr检测
[0062]
利用改良的ctab法提取t1代植株叶片的dna，利用hpt特异引物进行pcr(引物见表1)。
[0063]
pcr体系：
[0064][0065][0066]
pcr程序
[0067][0068]
观察高温胁迫下拟南芥wt和oe的表型，检测叶片中cagstu23基因的表达(引物序列见表1)，高温胁迫下(40℃)处理4天，对t3代拟南芥转基因株系和野生植株进行表达分析，引物见表1。
[0069]
结果如图，高温胁迫下过表达cagstu23的拟南芥株系的耐热性强于野生型(图4)oe
‑
hs中cagstu23的表达量显著高于wt
‑
hs(图5)。
[0070]
实施例3：cagstu23基因的功能验证
[0071]
高温胁迫导致植物体内活性氧(ros)代谢失衡。在长期的进化过程中植物形成了比较完备的防御系统(酶促和非酶促)以清除体内过量的ros。gst是植物抗氧化系统中的重要成员，能催化谷胱甘肽与疏水的和亲电的化合物发生亲电取代反应从而降低体内的活性氧水平在生物体内执行多种功能。丙二醛(mda)是膜脂过氧化产物，可用于评价膜的过氧化状态。
[0072]
利用试剂盒(南京建成生物工程研究所)测定丙二醛mda的含量。
[0073]
结果如图6，过表达cagstu23的拟南芥株系(oe
‑
hs)的mda的含量较(wt
‑
hs)显著下降，高温胁迫引起的伤害明显降低。
[0074]
上述内容仅为对本发明所用的具体材料、设备、方法等的叙述，并不用于限制本发明，使用过程中可依据实际情况进行调整和改进。