一种第四代CAR-T细胞及其应用的制作方法

本发明属于生物医药
技术领域：
，涉及一种第四代car-t细胞及其应用，尤其涉及一种条件性过表达复合型il-6和ccl19的第四代car-t细胞及其应用。
背景技术：
：随着肿瘤免疫学理论和临床技术的发展，嵌合抗原受体t细胞疗法(chimericantigenreceptort-cellimmunotherapy，car-t)成为最有发展前景的肿瘤免疫疗法之一。目前，car-t细胞疗法已经广泛应用于治疗b细胞恶性肿瘤，靶向cd19的car-t细胞是car-t疗法治疗b细胞恶性肿瘤的先驱，为治疗b细胞恶性肿瘤提供了有效方案。但是，car-t细胞疗法仍然存在多种问题。在白血病治疗方面，car-t细胞疗法存在复发率高的问题，促进car-t细胞的维持和记忆性t细胞的形成可能是解决该问题的技术突破口；此外，抗cd19的car-t细胞的临床治疗研究结果显示，患者对car-t细胞治疗的响应率与细胞因子释放综合征(crs)的发生存在一定的正相关关系，而crs又可能导致car-t细胞相关的脑病综合征(cres)等副作用，严重限制了car-t细胞的临床应用；而在实体瘤治疗方面，car-t细胞疗效差，目前尚未报道相关的临床研究突破。技术实现要素：针对现有技术的不足和实际需求，本发明提供了一种第四代car-t细胞及其应用，通过条件性过表达复合型il-6和ccl19，不仅提高了car-t抗肿瘤作用，而且降低了其在治疗过程中的副作用。为达此目的，本发明采用以下技术方案：第一方面，本发明提供了一种第四代car-t细胞，所述第四代car-t细胞表达特异性结合抗原的嵌合抗原受体、复合型il-6和ccl19；所述复合型il-6和ccl19为nfat调控型过表达。本发明中，采用nfat调控启动子调控t细胞对复合型il-6和ccl19的表达，当car-t细胞处于静息状态时，复合型il-6和ccl19不表达，当car-t细胞识别肿瘤抗原被激活后，nfat调控启动子5×nfat-re-minp启动对复合型il-6和ccl19的转录和翻译，复合型il-6和ccl19表达，复合型il-6刺激car-t细胞增殖、记忆分化、增强杀伤效果，ccl19将外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部，两者相互配合共同实现对肿瘤的靶向促凋亡作用。优选地，所述复合型il-6为il-6和il-6rα的复合物，所述复合型il-6(hil-6)包括seqidno:1所示的氨基酸序列；seqidno:1：ppeepqlscfrksplsnvvcewgprstpslttkavllvrkfqnspaedfqepcqysqesqkfscqlavpegdssfyivsmcvassvgskfsktqtfqgcgilqpdppanitvtavarnprwlsvtwqdphswnssfyrlrfelryraersktfttwmvkdlqhhcvihdawsglrhvvqlraqeefgqgewsewspeamgtpwtesrsppargggsggggsvepvppgedskdvaaphrqpltsseridkqiryildgisalrketcnksnmcesskealaennlnlpkmaekdgcfqsgfneetclvkiitgllefevyleylqnrfesseeqaravqmstkvliqflqkkaknldaittpdpttnaslltklqaqnqwlqdmtthlilrsfkeflqsslralrqm。优选地，所述ccl19包括seqidno:2所示的氨基酸序列；seqidno:2：malllalsllvlwtspaptlsgtndaedcclsvtqkpipgyivrnfhyllikdgcrvpavvfttlrgrqlcappdqpwveriiqrlqrtsakmkrrss。优选地，所述嵌合抗原受体包括抗原结合结构域、跨膜结构域和信号传导结构域。优选地，所述抗原结合结构域结合肿瘤表面抗原，所述肿瘤表面抗原包括cd19、cd20、cd22、cd30、cea、egfr、braf、her-2、mesothelin、muc1、psca、gpc3、tert、pten、pd-1、pd-l1或vegf中的任意一种，优选为cd19、muc1、gpc3、mesothelin、psca或her2中的任意一种，进一步优选为mesothelin。优选地，所述抗原结合结构域为靶向mesothelin的单链抗体。优选地，所述跨膜结构域包括cd28跨膜结构域和/或cd8α跨膜结构域，优选为cd28跨膜结构域。优选地，所述信号传导结构域包括cd28胞内结构域、cd3ζ、tlr2、4-1bb、tlr1、cd27、ox40或dap10中的任意一种或至少两种的组合，优选为cd28胞内结构域、cd3ζ和tlr2的组合。优选地，所述嵌合抗原受体还包括信号肽。优选地，所述嵌合抗原受体由gm-csf信号肽、mesothelin抗原结合结构域、cd28跨膜结构域、cd28胞内结构域、cd3ζ和tlr2串联组成。优选地，所述嵌合抗原受体包括如seqidno:3所示的氨基酸序列；seqidno:3：mlllvtslllcelphpafllsqvqlqqsgpglvtpsqtlsltcaisgdsvssnsatwnwirqspsrglewlgrtyyrskwyndyavsvksrmsinpdtsknqfslqlnsvtpedtavyycargmmtyyygmdvwgqgttvtvssgilgsggggsggggsggggsqpvltqssslsaspgasasltctlrsginvgpyriywyqqkpgsppqyllnyksdsdkqqgsgvpsrfsgskdasanagvllisglrsedeadyycmiwhssaavfgggtqltvlsgileqqgievmypppyldneksngtiihvkgkhlcpsplfpgpskpfwvlvvvggvlacysllvtvafiifwvrskrsrllhsdymnmtprrpgptrkhyqpyapprdfaayrsrvkfsrsadapayqqgqnqlynelnlgrreeydvldkrrgrdpemggkprrknpqeglynelqkdkmaeayseigmkgerrrgkghdglyqglstatkdtydalhmqalpprqakrkprkapsrnicydafvsyserdaywvenlmvqelenfnppfklclhkrdfipgkwiidniidsiekshktvfvlsenfvksewckyeldfshfrlfdenndaailillepiekkaipqrfcklrkimntktylewpmdeaqregfwvnlraaiks。第二方面，本发明提供了一种表达载体，所述表达载体包括嵌合抗原受体编码基因、nfat调控启动子、复合型il-6编码基因和ccl19编码基因。优选地，所述嵌合抗原受体编码基因包括seqidno:4所示的核酸序列；seqidno:4：atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctgagccaggtacagctgcagcagtcaggtccaggactcgtgacgccctcgcagaccctctcactcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactggatcaggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtggtataacgactatgcagtatctgtgaaaagtcgaatgagcatcaacccagacacatccaagaaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgtgcaagaggaatgatgacttactattacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtcaccgtctcctcaggaattctaggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccggaggcggcggttctcagcctgtgctgactcagtcgtcttccctctctgcatctcctggagcatcagccagtctcacctgcaccttgcgcagtggcatcaatgttggtccctacaggatatactggtaccagcagaagccagggagtcctccccagtatctcctgaactacaaatcagactcagataagcagcagggctctggagtccccagccgcttctctggatccaaagatgcttcggccaatgcaggggttttactcatctctgggctccggtctgaggatgaggctgactattactgtatgatttggcacagcagcgctgctgtgttcggaggaggcacccaactgaccgtcctctccggaattctagaacaacagggtattgaagttatgtatcctcctccttacctagacaatgagaagagcaatggaaccattatccatgtgaaagggaaacacctttgtccaagtcccctatttcccggaccttctaagcccttttgggtgctggtggtggttgggggagtcctggcttgctatagcttgctagtaacagtggcctttattattttctgggtgaggagtaagaggagcaggctcctgcacagtgactacatgaacatgactccccgccgccccgggcccacccgcaagcattaccagccctatgccccaccacgcgacttcgcagcctatcgctccagagtgaagttcagcaggagcgcagacgcccccgcgtaccagcagggccagaaccagctctataacgagctcaatctaggacgaagagaggagtacgatgttttggacaagagacgtggccgggaccctgagatggggggaaagccgagaaggaagaaccctcaggaaggcctgtacaatgaactgcagaaagataagatggcggaggcctacagtgagattgggatgaaaggcgagcgccggaggggcaaggggcacgatggcctttaccagggtctcagtacagccaccaaggacacctacgacgcccttcacatgcaggccctgccccctcgccaggccaaaaggaagcccaggaaagctcccagcaggaacatctgctatgatgcatttgtttcttacagtgagcgggatgcctactgggtggagaaccttatggtccaggagctggagaacttcaatccccccttcaagttgtgtcttcataagcgggacttcattcctggcaagtggatcattgacaatatcattgactccattgaaaagagccacaaaactgtctttgtgctttctgaaaactttgtgaagagtgagtggtgcaagtatgaactggacttctcccatttccgtctttttgatgagaacaatgatgctgccattctcattcttctggagcccattgagaaaaaagccattccccagcgcttctgcaagctgcggaagataatgaacaccaagacctacctggagtggcccatggacgaggctcagcgggaaggattttgggtaaatctgagagctgcgataaagtcc。优选地，所述nfat调控启动子5×nfat-re-minp包括seqidno:5所示的核酸序列；seqidno:5：ggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtggaggaaaaactgtttcatacagaaggcgtagatctagactctagagggtatataatggaagctcgaattccagcttggcattccggtactgttggtaaaaagcttggcaatccggtactgttggtaaagccacc。优选地，所述复合型il-6(hil-6)编码基因包括seqidno:6所示的核酸序列；seqidno:6：ccccccgaggagccccagctctcctgcttccggaagagccccctcagcaatgttgtttgtgagtggggtcctcggagcaccccatccctgacgacaaaggctgtgctcttggtgaggaagtttcagaacagtccggccgaagacttccaggagccgtgccagtattcccaggagtcccagaagttctcctgccagttagcagtcccggagggagacagctctttctacatagtgtccatgtgcgtcgccagtagtgtcgggagcaagttcagcaaaactcaaacctttcagggttgtggaatcttgcagcctgatccgcctgccaacatcacagtcactgccgtggccagaaacccccgctggctcagtgtcacctggcaagacccccactcctggaactcatctttctacagactacggtttgagctcagatatcgggctgaacggtcaaagacattcacaacatggatggtcaaggacctccagcatcactgtgtcatccacgacgcctggagcggcctgaggcacgtggtgcagcttcgtgcccaggaggagttcgggcaaggcgagtggagcgagtggagcccggaggccatgggcacgccttggacagaatccaggagtcctccagctcgcggtggtggatcaggaggtggagggtcagtcgagccagtacccccaggagaagattccaaagatgtagccgccccacacagacagccactcacctcttcagaacgaattgacaaacaaattcggtacatcctcgacggcatctcagccctgagaaaggagacatgtaacaagagtaacatgtgtgaaagcagcaaagaggcactggcagaaaacaacctgaaccttccaaagatggctgaaaaagatggatgcttccaatctggattcaatgaggagacttgcctggtgaaaatcatcactggtcttttggagtttgaggtatacctagagtacctccagaacagatttgagagtagtgaggaacaagccagagctgtgcagatgagtacaaaagtcctgatccagttcctgcagaaaaaggcaaagaatctagatgcaataaccacccctgacccaaccacaaatgccagcctgctgacgaagctgcaggcacagaaccagtggctgcaggacatgacaactcatctcattctgcgcagctttaaggagttcctgcagtccagcctgagggctcttcggcaaatg。优选地，所述ccl19编码基因包括seqidno:7所示的核酸序列；seqidno:7：atggccctgctactggccctcagcctgctggttctctggacttccccagccccaactctgagtggcaccaatgatgctgaagactgctgcctgtctgtgacccagaaacccatccctgggtacatcgtgaggaacttccactaccttctcatcaaggatggctgcagggtgcctgctgtagtgttcaccacactgaggggccgccagctctgtgcacccccagaccagccctgggtagaacgcatcatccagagactgcagaggacctcagccaagatgaagcgccgcagcagt。优选地，所述表达载体包括病毒载体。优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种，优选为慢病毒载体。第三方面，本发明提供了一种重组慢病毒，所述重组慢病毒采用第二方面所述的表达载体与包装辅助质粒共转染哺乳细胞制备得到。第四方面，本发明提供了一种第一方面所述的第四代car-t细胞的制备方法，所述方法包括将第二方面所述的表达载体或第三方面所述的重组慢病毒导入t细胞的步骤。第五方面，本发明提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括第一方面所述的第四代car-t细胞。优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂中的任意一种或至少两种的组合。第六方面，本发明提供了第一方面所述的第四代car-t细胞、第二方面所述的表达载体、第三方面所述的重组慢病毒或第五方面所述的药物组合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。优选地，所述肿瘤包括肝癌、肺癌、乳腺癌、肾母细胞瘤、神经胶质瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、鼻咽癌、间皮质瘤、胰岛细胞瘤、视网膜母细胞瘤、胰腺癌、子宫肌瘤、宫颈癌或甲状腺癌中的任意一种或至少两种的组合。与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：(1)本发明构建条件性表达复合型il-6和ccl19的car-t细胞，car-t在识别肿瘤抗原后表达分泌复合型il-6和ccl19，复合型il-6增强car-t的扩增和抗肿瘤作用，ccl19将外周血免疫细胞最大程度被招募到肿瘤内部，两者相互配合共同实现对肿瘤的靶向促凋亡作用；(2)本发明构建的条件性表达il-6和ccl19的car-t细胞具有更强的肿瘤抑制作用，可以显著抑制肿瘤的增殖和体积，同时不引起或加剧全身性或者局部的炎症反应，降低了car-t的副作用。附图说明图1为不同car-t细胞分泌hil-6和ccl19的结果；图2为不同car-t细胞的增殖情况；图3为不同car-t细胞对t细胞的招募能力；图4为不同car-t细胞的杀伤效率。具体实施方式为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。实施例1重组慢病毒载体的构建通过全基因合成以下核酸分子：①由gm-csf信号肽、mesothelinscfv、cd28跨膜结构域、cd28胞内结构域、cd3ζ、tlr2和2a肽的核酸序列串联形成的car分子；②由5×nfat-re-minp启动子(seqidno:5)、hil-6(seqidno:6)和ccl19(seqidno:7)串联形成的条件性分子；将①克隆至慢病毒表达载体pwpxld-egfp中，得到car-pwpxld-egfp；将①克隆至慢病毒表达载体pwpxld-tcd19中，随后将②反向克隆至pwpxld-tcd19的末端，得到car-hil-6/ccl19-pwpxld-tcd19。实施例2慢病毒包装采用293t细胞制备重组慢病毒，当293t细胞铺100mm培养皿板底达80～90％时，进行慢病毒包装：病毒包装前2h，更换培养基为含1％胎牛血清的dmem，加入量为6ml/100mm培养皿；配制如表1所示的质粒混合液；表1试剂剂量重组慢病毒载体4.5μgpmd2.g1.5μgpspax26μg将36μgpei加至另一500μlopti-mem培养基内，混匀，室温静置5min；将表1所示的质粒混合液与pei混合，吹打混匀，室温静置25～30min；将上述混合液逐滴加至培养在100mm培养皿中的293t细胞上；培养6h后，更换培养基为含1％胎牛血清的dmem，加入量为7ml/100mm培养皿；包装后24h、48h和72h，收取病毒上清，同时向293t细胞补加培养基，加入量为7ml/100mm培养皿；1000g离心10min，0.45μm滤器过滤，得到重组慢病毒，4℃保存待用。实施例3t细胞激活和慢病毒转染通过ficoll密度梯度法分离血液中的单个核细胞，采用红细胞裂解液裂解去除红细胞后，通过macspan-t磁珠分选出t细胞，采用培养基aim-v加5％fbs、100u/ml青霉素和0.1mg/ml链霉素稀释至浓度为2.5×106个/ml待用；利用包被cd2、cd3和cd28抗体的磁珠(美天旎)刺激t细胞，磁珠与t细胞比例为1:2，t细胞密度为5×106个/ml/cm2，t细胞在37℃、5％co2培养箱中培养刺激48h；去除t细胞中的磁珠，将激活后的t细胞在300g下离心5min，去上清，用新鲜培养基重悬，分别加入不同的重组慢病毒、8μg/ml的polybrene和300iu/ml的il-2，病毒加入量为moi＝10，37℃、5％co2培养箱中培养24h后，300g离心5min，去上清，用含300iu/mlil-2的新鲜培养基重悬细胞，37℃、5％co2培养箱培养；将car-t细胞密度维持在1×106个/ml左右，每2～3天进行一次半量换液；培养10天后进行后续实验。本实施例制备的car-t细胞为mesothelincar-t和hil-6/ccl19-car-t。实施例4car-t细胞对hil-6和ccl19的分泌取两种car-t细胞各2×106个，用新鲜的t细胞培养基培养24小时，收集细胞上清；同时取2×106个car-hil-6/ccl19-t，与等量的mesothelin阳性细胞k562-mesothelin-gl共培养24h，收集细胞上清；采用elisa试剂盒(r&dsystem)检测每种细胞对hil-6和ccl19的分泌情况。如图1所示，mesothelincar-t细胞的培养上清中没有hil-6和ccl19，hil-6/ccl19-car-t细胞的培养上清中也没有hil-6和il-7，与k562-mesothelin-gl共培养后，car-hil-6/ccl19-t分泌hil-6和ccl19，说明hil-6/ccl19-car-t细胞对hil-6和ccl19的表达受到肿瘤抗原调控。实施例5car-t细胞的体外增殖实验取两种car-t细胞各2×106个，用新鲜的t细胞培养基培养；同时取2×106个两种car-t细胞，与等量的mesothelin阳性细胞k562-mesothelin-gl共培养，每天进行计数，连续培养7天，分析car-t细胞的增殖情况。结果图2所示，mesothelincar-t由于不分泌hil-6，对car-t细胞没有促进增殖的作用；hil-6/ccl19-car-t在没有肿瘤抗原的情况下也不分泌hil-6，对car-t细胞同样没有促进增殖的作用，反而由于hil-6/ccl19的影响，增殖能力不如mesothelincar-t；hil-6/ccl19-car-t与k562-mesothelin-gl共培养，分泌hil-6促进car-t细胞的增殖。实施例6car-t细胞的体外迁移实验取两种car-t细胞各2×106个，于transwell装置下层培养24h，同时取2×106个两种car-t与等量k562-mesothelin-gl于下层共培养24h，取cfse标记的野生t细胞于上层培养5h，用流式细胞仪检测下层细胞中cfse标记的t细胞的数量。统计结果如图3所示，car-hil-6/ccl19-t与肿瘤细胞共培养后可以招募到更多的t细胞，说明car-hil-6/ccl19-t条件性表达ccl19，只有在识别肿瘤细胞后才会分泌ccl19，发挥招募作用，避免了炎症副反应。实施例7体外检测car-t细胞对肿瘤细胞的杀伤功能取wt、mesothelincar-t和hil-6/ccl19-car-t细胞各2×106个，与肿瘤细胞k562-mesothelin-gl按e:t为4:1、2:1、1:1、1:2、1:4、1:8、1:16的比例混合，加入到96孔板中，每组设置3个复孔，250g离心5min后，置于37℃、5％co2培养箱共培养18h；18h后，向96孔板中加入100μl/孔的荧光素酶底物(1×)，将细胞重悬混匀，立即通过多功能酶标仪测定rlu(relativelightunit)，测定时间为1秒，利用荧光素酶(luciferase)定量杀伤效率评估方法，体外比较wt、mesothelincar-t和car-hil-6/ccl19-t对k562-mesothelin-gl的杀伤作用，杀伤比例计算公式如下：100％×(对照孔读数-实验孔读数)/对照孔读数(不加细胞的空白组读数可以忽略)结果如图4所示，car-hil-6/ccl19-t对k562-mesothelin-gl的体外杀伤效率显著高于wt和mesothelincar-t，在e:t很小的情况下，即肿瘤靶细胞远大于效应t细胞，car-hil-6/ccl19-t也能表现出较强的肿瘤杀伤活性。综上所述，本发明的第四代car-t细胞在识别肿瘤抗原后表达分泌hil-6和ccl19，显著提高了car-t细胞的增殖能力和抗肿瘤效果，同时规避了全身性或者局部的炎症反应，降低了car-t的副作用。申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属
技术领域：
的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。sequencelisting<110>广东昭泰体内生物医药科技有限公司<120>一种第四代car-t细胞及其应用<130>202012<160>7<170>patentinversion3.3<210>1<211>407<212>prt<213>人工序列<400>1proproglugluproglnleusercysphearglysserproleuser151015asnvalvalcysglutrpglyproargserthrproserleuthrthr202530lysalavalleuleuvalarglyspheglnasnserproalagluasp354045pheglngluprocysglntyrserglngluserglnlysphesercys505560glnleualavalprogluglyaspserserphetyrilevalsermet65707580cysvalalaserservalglyserlyspheserlysthrglnthrphe859095glnglycysglyileleuglnproaspproproalaasnilethrval100105110thralavalalaargasnproargtrpleuservalthrtrpglnasp115120125prohissertrpasnserserphetyrargleuargphegluleuarg130135140tyrargalagluargserlysthrphethrthrtrpmetvallysasp145150155160leuglnhishiscysvalilehisaspalatrpserglyleuarghis165170175valvalglnleuargalaglngluglupheglyglnglyglutrpser180185190glutrpserproglualametglythrprotrpthrgluserargser195200205proproalaargglyglyglyserglyglyglyglyservalglupro210215220valproproglygluaspserlysaspvalalaalaprohisarggln225230235240proleuthrsersergluargileasplysglnileargtyrileleu245250255aspglyileseralaleuarglysgluthrcysasnlysserasnmet260265270cysgluserserlysglualaleualagluasnasnleuasnleupro275280285lysmetalaglulysaspglycyspheglnserglypheasngluglu290295300thrcysleuvallysileilethrglyleuleugluphegluvaltyr305310315320leuglutyrleuglnasnargphegluserserglugluglnalaarg325330335alavalglnmetserthrlysvalleuileglnpheleuglnlyslys340345350alalysasnleuaspalailethrthrproaspprothrthrasnala355360365serleuleuthrlysleuglnalaglnasnglntrpleuglnaspmet370375380thrthrhisleuileleuargserphelysglupheleuglnserser385390395400leuargalaleuargglnmet405<210>2<211>98<212>prt<213>人工序列<400>2metalaleuleuleualaleuserleuleuvalleutrpthrserpro151015alaprothrleuserglythrasnaspalagluaspcyscysleuser202530valthrglnlysproileproglytyrilevalargasnphehistyr354045leuleuilelysaspglycysargvalproalavalvalphethrthr505560leuargglyargglnleucysalaproproaspglnprotrpvalglu65707580argileileglnargleuglnargthrseralalysmetlysargarg859095serser<210>3<211>665<212>prt<213>人工序列<400>3metleuleuleuvalthrserleuleuleucysgluleuprohispro151015alapheleuleuserglnvalglnleuglnglnserglyproglyleu202530valthrproserglnthrleuserleuthrcysalaileserglyasp354045servalserserasnseralathrtrpasntrpileargglnserpro505560serargglyleuglutrpleuglyargthrtyrtyrargserlystrp65707580tyrasnasptyralavalservallysserargmetserileasnpro859095aspthrserlysasnglnpheserleuglnleuasnservalthrpro100105110gluaspthralavaltyrtyrcysalaargglymetmetthrtyrtyr115120125tyrglymetaspvaltrpglyglnglythrthrvalthrvalserser130135140glyileleuglyserglyglyglyglyserglyglyglyglysergly145150155160glyglyglyserglnprovalleuthrglnserserserleuserala165170175serproglyalaseralaserleuthrcysthrleuargserglyile180185190asnvalglyprotyrargiletyrtrptyrglnglnlysproglyser195200205proproglntyrleuleuasntyrlysseraspserasplysglngln210215220glyserglyvalproserargpheserglyserlysaspalaserala225230235240asnalaglyvalleuleuileserglyleuargsergluaspgluala245250255asptyrtyrcysmetiletrphisserseralaalavalpheglygly260265270glythrglnleuthrvalleuserglyileleugluglnglnglyile275280285gluvalmettyrproproprotyrleuaspasnglulysserasngly290295300thrileilehisvallysglylyshisleucysproserproleuphe305310315320proglyproserlysprophetrpvalleuvalvalvalglyglyval325330335leualacystyrserleuleuvalthrvalalapheileilephetrp340345350valargserlysargserargleuleuhisserasptyrmetasnmet355360365thrproargargproglyprothrarglyshistyrglnprotyrala370375380proproargaspphealaalatyrargserargvallyspheserarg385390395400seralaaspalaproalatyrglnglnglyglnasnglnleutyrasn405410415gluleuasnleuglyargarggluglutyraspvalleuasplysarg420425430argglyargaspproglumetglyglylysproargarglysasnpro435440445glngluglyleutyrasngluleuglnlysasplysmetalagluala450455460tyrsergluileglymetlysglygluargargargglylysglyhis465470475480aspglyleutyrglnglyleuserthralathrlysaspthrtyrasp485490495alaleuhismetglnalaleuproproargglnalalysarglyspro500505510arglysalaproserargasnilecystyraspalaphevalsertyr515520525sergluargaspalatyrtrpvalgluasnleumetvalglngluleu530535540gluasnpheasnproprophelysleucysleuhislysargaspphe545550555560ileproglylystrpileileaspasnileileaspserileglulys565570575serhislysthrvalphevalleusergluasnphevallysserglu580585590trpcyslystyrgluleuasppheserhispheargleupheaspglu595600605asnasnaspalaalaileleuileleuleugluproileglulyslys610615620alaileproglnargphecyslysleuarglysilemetasnthrlys625630635640thrtyrleuglutrpprometaspglualaglnarggluglyphetrp645650655valasnleuargalaalailelysser660665<210>4<211>1995<212>dna<213>人工序列<400>4atgcttctcctggtgacaagccttctgctctgtgagttaccacacccagcattcctcctg60agccaggtacagctgcagcagtcaggtccaggactcgtgacgccctcgcagaccctctca120ctcacctgtgccatctccggggacagtgtctctagcaacagtgctacttggaactggatc180aggcagtccccatcgagaggccttgagtggctgggaaggacatactacaggtccaagtgg240tataacgactatgcagtatctgtgaaaagtcgaatgagcatcaacccagacacatccaag300aaccagttctccctgcagctgaactctgtgactcccgaggacacggctgtgtattactgt360gcaagaggaatgatgacttactattacggtatggacgtctggggccaagggaccacggtc420accgtctcctcaggaattctaggatccggtggcggtggcagcggcggtggtggttccgga480ggcggcggttctcagcctgtgctgactca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