一种番茄斑萎属病毒的蛋白标准物质及其应用的制作方法

本申请涉及蛋白标准物质领域，具体而言，涉及本发明涉及一种番茄斑萎属病毒的的蛋白标准物质及其应用。

背景技术：

番茄斑萎病毒属是一类值得关注的植物病毒。病毒种类或分离物不断增加，寄主范围也在不断扩大，仅tswv就能侵染1090种植物，涉及到番茄、辣椒、莴苣等蔬菜作物，花生、豌豆、烟草等重要经济作物及菊花、马蹄莲等许多花卉作物。该属病毒分布于亚洲和美洲大部分地区。造成的危害轻者减产，重者绝收，引起的巨大经济损失已被列为世界危害最大的十种植物病毒之一。番茄斑萎病毒属是近年来对我国蔬菜水果等生产危害上升的一类病毒，这类病毒也是国际上植物检疫比较重视的病毒。这类病毒种类繁多，基因组数据缺乏，亲缘关系复杂，对检测方法的准确性提出了极高的要求，这就需要检测实验室储备有检测用的阳性质控。本项目将通过体外转录的方式获得可用作分子生物学检测阳性质控rna，旨在研究确定这类阳性质控的保存方式、保存条件和运输要求等，为今后病毒分子检测阳性质控的制备进行基础数据的储备，也为促进这一类病毒的检测提供有效准确的阳性质控。目前国内尚无相同类型的阳性质控提供，本项目研发这一类阳性质控可以弥补国内服务的缺失，也可以降低从国外购外的成本，同时由于这类阳性质控丧失侵染活性，也降低了有害生物引进带来的风险。

分子生物学检测是病毒检测中必不可少的组成部分，然而检测的阳性质控却是难以获得，对方法的验证和检测的开展都极为不利。目前，实验室和研究机构想要获得植物病毒的标准样品主要有三个途径：通过从国际权威或著名生物标准品中心进行购买，比如美国标准省物品收藏中心、英国国家生物制品鉴定所和德国微生物菌种包藏中心等；与在研究刊物上发表研究文献的实验室联系索取而获得；购买商业试剂盒所配备的阳性对照，但多为血清学方法的对照。由于获得植物病毒分离物的来源信息少，本地扩繁和保存难度大，且毒株多为活体或是冷冻保存，都存在运输周期长，费用高、保存难等问题，加上检疫性植物病毒进口手续繁琐，因此想要收集病毒的阳性质控极为困难。分子生物学检测需要的仅为病毒基因组，较活性病毒的要求降低，通过基因工程的方法易获得大量的分子拷贝，较接种寄主植物等传统活性病毒繁殖的环境要求和周期都大大降低，因此均有开展的便利性。国内已有动物病毒分子生物学检测阳性质控的研发，如水中轮状病毒实时定量pcr阳性质控构建的研究，但在植物病毒领域，尤其是植物检疫病毒，都缺乏相关研究的报道和产品的面世。

技术实现要素：

为了填补目前产品的空白和满足植物检验检疫的需要，本发明旨在开发能够适用于番茄斑萎属病毒主要病毒分子生物学检测的阳性质控。该物质具有稳定性，无生物传染性，耐核糖核酸酶等特性，可最大程度检测病毒组分以及病毒粒子结构。

一种番茄斑萎属病毒的蛋白标准物质，通过真核表达载体pcdna3.1转入哺乳动物细胞293表达株中，经培养发酵获得表达产物分子，将获得的表达产物颗粒进行dnasei消化，离心弃沉淀，沉淀即是含有外壳蛋白和复制酶基因的表达产物，再经过his标签的亲和纯化、分子筛纯化，获得含有所需组分的纯化组分，将最终纯化产物进行稀释，对融合蛋白产物进行od值测定，依据od值换算稀释产物，获得病毒外壳蛋白和复制酶基因融合表达的标准蛋白物质，所述pcdna3.1-rp载体为包含番茄斑萎属病毒的外壳蛋白和复制酶融合蛋白的表达载体。

获取包含番茄斑萎属病毒的外壳蛋白和复制酶融合蛋白的表达载体，具体过程如下:

1)根据复制酶基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物为：

rdrp-f:5’-atgaacatccagaaaatacaaa-3’

rdrp-r:5’-gacttcagatttgatcttttgag-3’；

预期扩增产物为tswv的复制酶蛋白n端约100氨基酸，即复制酶基因，并引入酶切位点bstxi；分别双酶切复制酶基因；

2)根据外壳蛋白基因序列，设计一对特异性引物，所述一对特异性引物为：

cp-f:5’-atgtctaaggttaagctcactaagga-3’

cp-r：5’-acagacaaaacttgcagaacttgct-3’；

预期扩增产物为tswv的外壳蛋白，即cp基因，并引入酶切位点:ecorv，通过融合引物进行重叠pcr扩增，获得复制酶基因与外壳蛋白基因融合的dna片段，并进行bstxi/ecorv双酶切后回收纯化，

bstxi/ecorv双酶切pcdna3.1载体，并将cp基因和复制酶基因融合后连接到pet32a载体上，最终得到pcdna3.1-rp载体；所述融合基因序列如序列表中seqidn0.3所示。

用于病毒检测的外壳蛋白基因序列片段，如序列表中seqidn0.1所示，所述基因为tswv外壳蛋白基因中的一个片段。

用于病毒检测的复制酶基因序列片段，如序列表中seqidn0.2所示，所述基因为tswv复制酶基因中的一个片段。

表达产物分子进行dnasei消化，然后离心弃沉淀，保留上清；加入终浓度50％饱和硫酸铵，沉淀表达产物，离心弃上清，获得沉淀即是含有外壳蛋白和复制酶基因的表达产物，最后用pbs溶液重悬，获得含有所需粗体组分，将获得含有表达产物分子的溶液进行his标签的亲和纯化，经ni-nta凝胶介质结合目的蛋白后，用100mm咪唑洗脱所需组分，获得含有所需组分的纯化组分。

所述分子筛纯化为经葡聚糖凝胶介质筛选目的蛋白后，用保存缓冲液换液所需组分，获得含有所需组分的纯化组分，保存缓冲液为20mmtris、0.1mnacl、ρη8.0。

本发明具有如下优点:

(1)目前，实验室和研究机构想要获得斑萎病毒属病毒的标准样品主要有三个途径：通过从国际权威或著名生物标准品中心进行购买，与在研究刊物上发表研究文献的实验室联系索取而获得；购买商业试剂盒所配备的阳性对照。由于获得植物病毒分离物的来源信息少，本地扩繁和保存难度大，且毒株多为活体或是冷冻保存，都存在运输周期长，费用高、保存难等问题，加上检疫性植物病毒进口手续繁琐，因此想要收集病毒的阳性质控极为困难。本发明提供一种番茄斑萎属病毒的的蛋白标准物质及其应用，可以解决上述难题。

(2)采用病毒外壳蛋白与复制酶基因融合表达的策略，可以同时检测病毒两个基因组分，具有精确性和广谱性。

(3)采用哺乳动物细胞系表达蛋白，与多采用的原核生物表达系统相比，表达产物具有空间折叠准确，蛋白修饰完整等特性。

(4)本发明利用多步骤的蛋白纯化方法，首先用饱和硫酸铵对标准物质进行提纯。硫酸铵溶解度大、温度系数小且不易是蛋白质变性，用它对标准物质进行沉析，并可以进一步去除dna核酸的干扰。

(5)本发明的标准物质只含有病毒外壳蛋白和复制酶蛋白，不含有病毒的核酸，因此该标准物质无传染性，无病毒特性，易于存储与运输。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解，构成本申请的一部分，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

图1.用于真核生物表达的载体图。

图2.本发明所示融合蛋白的结构。

图3.本发明组分在293细胞中的表达检测。

图4.分子筛纯化峰图。

图5.最终纯化产物的蛋白电泳图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。以下对至少一个示例性实施例的描述实际上仅仅是说明性的，决不作为对本发明及其应用或使用的任何限制。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例一、tswv病毒外壳蛋白与复制酶基因的融合

选取的外壳蛋白基因以及复制酶基因特定区域，用特异引物扩增，

rdrp-f:5’-atgaacatccagaaaatacaaa-3’和

rdrp-r:5’-gacttcagatttgatcttttgag-3’；

cp-f:5’-atgtctaaggttaagctcactaagga-3’和

cp-r：5’-acagacaaaacttgcagaacttgct-3’获得复制酶基因片段和外壳蛋白基因全长，按图2所示结构，设计融合蛋白引物，

rdrp-r：5’-ctcgctgccgctagaaccaccagaagaaccaccagagacttcagatttgatcttttgag-3’和

cp-f:5’-tctggtggttcttctggtggttctagcggcagcgagatgtctaaggttaagctcactaagga-3-进行通过蛋白

linker(sggssggssgse)进行连接，其中画线序列蛋白linker序列。

并用rdrprdrp-f:5’-atgggtcatcatcaccatcaccatatgaacatccagaaaatacaaa-3’引入histag序列。

采用相同方法，获得复制酶基因与外壳蛋白融合的不同结构，包括rdrp-liner-cp，cp-linker-rdrp，cp-linker-rdrp-linker-cp等。

实施例二、融合蛋白的制备

将表达载体转入293细胞系，经过培养发酵后，收集细胞，按照方法，破碎细胞，离心获得含表达产物的上清。

实施例三、标准物质的检测

将实施例1获取的标准物质经紫外分光光度计测定，依据od值换算出标准物质病毒数值，测定出初始浓度病毒80次方，

证明利用该标准物质可用于tswv的定量分析。

以上仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110>昆明海关技术中心

<120>一种番茄斑萎属病毒的蛋白标准物质及其应用

<141>2020-12-23

<160>3

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>777

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