用生长调节因子(GRF)、GRF相互作用因子(GIF)或嵌合GRF-GIF改进植物再生的方法与流程

用生长调节因子(grf)、grf相互作用因子(gif)或嵌合grf-gif改进植物再生的方法
1.相关申请的引用
2.本技术要求先前在2019年7月11日提交的共同未决申请ussn 62/873,123的优先权，其内容通过引用全文纳入本文。
3.关于联邦资助研究的声明
4.本发明在美国农业部、国家粮食和农业研究所授予的资助号2017-67007-25939下由政府支持完成。政府对本发明拥有一定权力。
5.序列表
6.本发明包含以ascii格式经efs-web提交的序列，并通过引用全文纳入本文。所述ascii拷贝创建于2020年5月27日，名为p1322wo00_seqlisting_06-17-2020_st25且大小为385,059字节。


背景技术：

7.现在，植物育种和基因工程已经使用了好几十年以改善植物性能和提供植物尤其是农作物的农业改良。植物转化技术的一个缺点是某些植物的再生效率低，包括选择植物属和种且甚至植物种内特定基因型的低效率。因此，需要改进植物的再生效率。
8.发明概述
9.本方法要提高植物再生效率。所述方法采用向一个或多个植物细胞的引入生长调节因子(grf)和/或grf相互作用因子蛋白(gif)(其引入植物细胞)，或引入植物细胞的grf-gif嵌合体。引入编码多肽的核酸分子或引入所述多肽提高再生效率。在某些实施方案中，所述方法提高低再生效率植物的再生效率。其他实施方案加速产生转基因植物的时间。提供实施方案用于突变grf序列的mir396靶区域，以降低植物细胞中grf蛋白受mir396的阻遏。还提供其他实施方案，其中植物细胞内存在grf和gif或grf-gif嵌合多肽，允许细胞在培养基上再生，该培养基的细胞分裂素浓度对于不包含所引入的多肽的植物细胞再生而言过低。可在这类培养基上选择植物，而不需额外标记序列。在某些实施方案中，用grf和/或gif或grf-gif转化的植物具有高再生效率，用于后续转化实验。grf和/或grf或grf-gif嵌合体与诱导型启动子或结构域可操作连接，还允许选择多肽表达或活性的时间。在某些实施方案中，用grf和/或gif或grf-gif转化的植物具有高再生效率，用于后续转化实验。还提供其他实施方案，其中grf、gif或grf-gif嵌合体与基因编辑技术组合，且grf、gif或grf-gif嵌合体以及基因编辑构建体可通过经编辑的植物后代中的隔离(segregation)来移除。
技术领域
10.一般而言，本公开涉及植物再生方法。更具体地，本公开涉及通过用生长调节因子(grf)和/或grf相互作用因子(gif)或grf-gif嵌合体转化改进植物再生效率的方法。
11.附图简要说明
12.图1.a-c)用邻接法的分子系统发育分析。a)拟南芥(arabidopsis)、小鼠和小麦
grf蛋白。b)拟南芥、小鼠和小麦gif蛋白。c)通过小麦ubiquitin启动子表达的小麦grf4-gif1嵌合体方案。
13.图2.细胞分裂素再生培养基中的愈伤组织。在ubi::grf4-gif1嵌合体(seq id no:5，中间)存在下于kronos转化期间再生的芽(shoot)数量高于用同一载体但没有grf-gif嵌合体的kronos转化(如两侧所示)。
14.图3.a)通过pcr验证26个独立转化事件。用引物fw-grf4b和rev-gif1b获得pcr产物，使用分离自26株独立t0植物的基因组dna作为模板。各数字对应于独立转化事件。l＝dna梯状长度标记(ladder)。b)grf4-gif1嵌合体和用于基因分型的引物的示意图。扩增片段是1.087kb。
15.图4.细胞分裂素再生培养基中的愈伤组织。ubi::gif1(seq id no:2)存在下小麦转化期间的芽再生，和使用同一载体但没有gif1基因的小麦转化中的芽再生。
16.图5.细胞分裂素再生培养基中的愈伤组织。用ubi::grf4(seq id no:1),ubi::gif1(seq id no:2),ubi::grf4-gif1嵌合体(seq id no:5)转化的植物细胞的再生效率与对照作比较。
17.图6.grf4-gif1嵌合体对从叶片外植体的再生的影响。
18.图7.a)小麦转化不同步骤的示意图。b)grf4-gif1嵌合体对没有细胞分裂素情况下诱导胚发生的影响。
19.图8.由小麦ubiquitin启动子(seq id no:59)表达的小麦grf4-gif1嵌合体方案。以下是野生型mir396靶位点(顶部(seq id no:53)、带有沉默突变的mir396-抗性位点(底部(seq id no:54)和其与mir396相互作用(中间(seq id no:55))的序列。
20.图9.a)用构建体转化的植物细胞的芽再生，所述构建体包含grf4-gif1嵌合体、cas9和靶向基因q的引导rna(grna)。b)用引导rna靶向的基因q区域(seq id no:68)。c)确认靶基因的编辑。
21.图10.用grf4-gif1嵌合体转化的植物细胞的芽再生，其在十分之一的正常细胞分裂素浓度生长。
22.图11.小麦嵌合克隆的编码序列。a)小麦grf4-gif1的核苷酸序列。序列来自四倍体小麦kronos。b)小麦grf4-gif1编码蛋白的序列。蓝色的序列来自grf4，黑色为间隔子，绿色为gif1。
23.图12.plc41-ubi::grf4-gif1的序列(seq id no:5)。grf4序列采用蓝色字母，间隔子是黑色的，gif序列采用绿色字母。ubi启动子以灰色突出显示，ha标签为红色，nos终止子为粉色，35s启动子为绿色，hpt为黄色。lb(gtttacaccacaatatatcctgcca)(seq id no:57)和rb(gtttacccgccaatatatcctgtca)(seq id no:58)序列带有下划线。
24.图13.酿酒葡萄(vitis vinifera)grf4-gif1嵌合体的序列。a)葡萄(vitis)grf4-gif1的核苷酸序列(seq id no:6)。b)葡萄grf4-gif1编码的蛋白的序列(seq id no:7)。蓝色的序列来自grf4，黑色为间隔子，绿色为gif1。
25.图14.a)串联的qlq-wrc结构域的示范性序列，用于blastp检索和系统发育分析。b)5个选定小麦grf的预测的蛋白序列(seq id no:9-13)。保守qlq和wrc结构域分别以黄色和绿色突出显示。
26.图15.5个水稻grf直系同源物的预测的蛋白序列(seq id no:14-18)。保守qlq和
wrc结构域分别以黄色和绿色突出显示。
27.图16显示a)最接近的拟南芥grf的预测的序列(seq id no:19-22)和b)最接近的葡萄的预测的蛋白序列(seq id no:23)。保守qlq和wrc结构域分别以黄色和绿色突出显示。
28.图17显示a)最接近的拟南芥grf的预测的序列(seq id no:24、seq id no:25和seq id no:26)以及b)显示预测的小麦gif序列(seq id no:27、seq id no:28和seq id no:29)。保守snh结构域以黄色突出显示。
29.图18显示用单一小麦grf4或gif1的小麦转化效率。a)不同盒的方案，其用于表达单独的小麦gif1和grf4、同一t-dna中的单独的grf4和gif1以及grf4-gif1嵌合体。b-d)转化有小麦grf4-gif1嵌合体的转基因kronos植株相对于转化有以下的kronos植株的再生频率：b)空载体(n＝14,****p《0.0001)。c)对照载体和仅含gif1或仅含grf4的载体(n＝5,不同字母指示在p《0.05的显著差异性,图基检验)。d)包括在不同ubi启动子下的grf4和gif1的载体(未融合，n＝5,**p《0.0144)。
30.图19显示小麦(黄色突出显示)、水稻、拟南芥、柑橘和葡萄grf和gif家族的系统树。小麦grf4和gif1的最接近的直系同源物，柑橘以橙色突出且葡萄以紫色突出显示。我们把这些基因和其编码的蛋白称为柑橘grf4(ciclev10032065m)、柑橘gif1(ciclev10022144m)以及葡萄grf4(gsvivt01024326001)和葡萄gif1(gsvivt01036262001)。a)我们使用qlq和wrc结构域分析grf蛋白和b)使用snh结构域分析gif蛋白。进化史用最大似然法推断。我们用最高对数似然值显示树。在分支旁显示关联的分类群聚集在一起的树百分比。我们用程序mega x进行进化分析。黄色突出显示：小麦。橙色突出：选定的柑橘直系同源物。紫色突出显示：选定的葡萄直系同源物。
31.图20显示小麦转化，采用包括其他grf和/或gif序列的嵌合体。a)检测的grf-gif1嵌合体方案。b)嵌合体诱导的再生效率，所述嵌合体将不同小麦grf基因与gif1组合。平均值基于3次实验，除了grf5(2次实验可用)。柱上的不同字母指示图基检验中与对照的显著差异(p《0.05)。仅grf4-gif1和grf5-gif1显著不同于对照。星号指示组合的grf4-gif1和grf5-gif1嵌合体(进化相关)相较于组合的grfgrf1-gif1和grf9-gif1嵌合体(相关性更远，图19a)，再生效率的显著差异(p＝0.0368)。c)检测的grf4-gif嵌合体方案。d)转基因kronos植株的再生效率，所述植株用与gif1、gif2或gif3融合的grf4嵌合体转化(3次实验，对比嵌合体带有gif1vs.gif2和gif3p＝0.0046)。柱上的不同字母指示显著差异(p《0.05,图基检验)。误差棒是s.e.m。接种的胚的数目在构建体下标示。残差的常态通过shapiro-wilk检验确认且同方差性通过levene检验确认(原始数据可获自表7)。
32.图21显示grf4-gif1嵌合体对不同基因型中再生效率的影响。a)代表性转化显示在不同小麦和黑小麦基因型中，grf4-gif1嵌合体存在下的再生芽频率高于对照(空载体)。b)在四倍体和六倍体小麦及黑小麦育种系uc3190的不同栽培品种中，grf4-gif1 vs对照的再生效率。接种的胚的数目在名称下标示且频率在柱顶部标示。原始数据在表9中。
33.图22显示a)诱导型小麦grf4-gr-gif1嵌合体的方案，其带有在grf4-gif1中间的大鼠糖皮质激素受体(gr)(seq id no:32、33)。c)含有再生培养基中的经转化的kronos胚的平板图片，没有dex(-dex)或存在10um dex(+dex)。dex的存在诱导grf4-gr-gif1活性并显著增加再生效率。
34.图23显示grf4-gif1嵌合体在没有细胞分裂素情况下诱导胚发生。a)不同小麦转化步骤的示意图。b).在没有潮霉素的生长素培养基中的代表性愈伤组织。注意在没有细胞分裂素情况下用小麦grf4-gif1嵌合体转化的愈伤组织中生长的绿芽(红色箭头)。对照：plc41。c)转基因特异性pcr产物(箭头)显示在4个再生自对照的植株中没有转基因植株，而9个再生自grf4-gif1嵌合体的植株中有5个转基因植株。一对特异于t-dna的引物用于pcr。
35.图24显示在没有外源细胞分裂素情况下，grf4-gif1嵌合体对再生效率的影响。小麦幼胚来自grf4-gif1转基因kronos t1植株和隔离的非转基因t1姊妹系，其在标准转化操作后进行处理，排除农杆菌接种和向平板加入潮霉素。最后一个步骤中，愈伤组织转移至再生培养基，没有细胞分裂素。grf4-gif转基因植株中再生绿芽的愈伤组织数目(27个中的21个)显著高于非转基因姊妹对照(26个中的3个)。代表性平板的图片显示无细胞分裂素的再生培养基中的愈伤组织。
36.图25显示相对于在uc davis转化设施的正常小麦转化方案，用grf4-gif1嵌合体的小麦转化操作加速。用grf4-gif1嵌合体的方案更快，使全过程减少5周。
37.图26显示用grf4-gif1嵌合体转化柑橘。a)用空载体和柑橘grf4-gif1嵌合体转化柑橘上胚轴(农杆菌接种后60d)。b)用空载体和柑橘grf4-gif1及mir396抗性grf4-gif1(rgrf4-gif1)嵌合体转化柑橘上胚轴(农杆菌接种后120d)。c)葡萄grf4-gif1嵌合体的方案，显示mir396靶位点和其与下面mir396的相互作用。在mir396抗性rgrf4-gif1形式中，引入沉默突变(红色)以减少与mir396的相互作用。d)3次柑橘实验的统计学比较。不同字母指示图基检验中的显著差异(p《0.05)。顶部的水平线指示对照与grf-gif构建体之间的显著差异(p＝0.0153)。
38.图27显示用rgrf4-gif1嵌合体转化葡萄。照片是用空载体和葡萄rgrf4-gif1嵌合体转化的葡萄正在再生的愈伤组织。
39.图28显示用grf4.1-gif1.1嵌合体转化甜椒(番椒(capsicum annuum))栽培品种r&c cayenne，所述嵌合体包括分别与小麦grf4＝甜椒loc107869915(seq id no:138)和小麦gif1＝甜椒loc107870303(seq id no:139)最接近的番椒直系同源物。图片对应于实验#201027/28，显示用grf4.1-gif1.1嵌合体转化的甜椒子叶块中的再生效率(42个中的10个＝23.8％)相较于用空对照载体转化的那些(40个中的2个＝5.0％)增加》4倍(表11，方法6)。
40.发明详述
41.本公开提供使用生长调节因子蛋白(grf)和grf相互作用因子蛋白(gif)(单独或组合或作为融合嵌合体)提高植物再生效率的方法。grf基因属于的保守植物特异性转录因子(tf)家族(van der knaap等,2000；kim等2003)。grf家族定义为存在结构域qlq和wrc，其分别介导蛋白-蛋白和蛋白-dna相互作用(kim等,2003,kim和kende 2004,horiguchi等,2005)。grf tf在陆生植物中高度保守，并在双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和藓类植物中鉴定了grf基因(omidbakhshfard等,2015)。这些基因还是微小rna mir396的保守靶标(debernardi等,2012)。grf能控制许多植物器官的大小，并通过增加发育器官的细胞增殖而用作生长促进物(rodriguez等,2010)。grf中的功能缺失突变或通过mir396过表达而下调，能显著降低诸如拟南芥和水稻等种类中的植物大小(horiguchi等,2005；kim等,2003；kim和kende,2004；wang等,2011；liu等,2009；rodriguez等,2010；li s等,2016)。另一方
面，grf活性提高可在拟南芥水稻、小麦和芸苔属植物等中生成更大的器官，包括更大的叶、谷粒和根(horiguchi等,2005；rodriguez等,2010；debernardi等,2014；beltramino等,2018；li,s.等.2018)。
42.grf蛋白能形成复合体并与gif基因家族成员编码的蛋白共同起作用。gif蛋白不具有dna结合域(kim和kende,2004)，但已证明gif蛋白与grf和染色质重塑复合体在体内相互作用(debernardi等,2014；vercruyssen et al.,2014)。基于此观察结果，推测gif能用作辅助活化剂将染色质重塑复合体带到grf识别的dna序列(debernardi等,2014,vercruyssen等,2014)。gif基因的突变模拟grf功能缺失中观察到的大部分表型，而gif过表达能促进器官生长且增强grf活性(kim和kende 2004,horiguchi等,2005；he等,2017；shimano等,2018；zhang等,2018；debernardi等,2014)。先前观察到当拟南芥grf3和gif1一起表达为嵌合体时，其能促进叶片尺寸相对于个体单独基因增加较大(专利wo 2013/102762 a1)。
43.在一个实施方案中，所述引入grf和/或gif序列的植物是转基因的，即其具有引入的异源核酸分子或多肽，或其具有通过任何可用技术编辑的基因组，包括本文提供的示例。这种异源核酸分子或多肽是未天然发现紧挨相邻核酸分子的那些，或者其中多肽水平高于或低于不含异源核酸分子或多肽的植物。另一示例中，所述核酸分子或多肽可来自另一生物。当涉及异源核酸分子时，其包括连接启动子、未天然与启动子序列一起出现和/或经人工干预在基因组基因座中修饰的这类分子。示例中的核苷酸序列与启动子序列异源，但其可来自任何来源，可与植物宿主同源或天然且发现在植物细胞中天然出现，或与植物宿主异源或是外来的。使用本文所述方法，转化有grf-gif嵌合体或grf和/或gif转基因以及异源核酸分子或多肽的植物的再生效率提高。本公开提供可通过显著增加植物再生效率来大幅扩增植物物种数目的方法，该植物物种适合有效转化技术。本文所提供方法还可用于扩增基因型，其能在某一作物内转化。例如，在小麦中，仅一些栽培品种能够有效转化，包括bobwhite、fielder和kronos，且这些仍显示低再生效率。转化不同基因型的能力对于育种应用而言是重要的，因为直接转化高生产基因型的能力可以不再需要昂贵且冗长的回交过程。本文所提供的方法可用于加速从叶外植体而不是胚产生转基因植物。
44.在某些实施方案中，本公开提供再生效率改进的产生植物的方法。此方法包括步骤：(1)用一种或多种核酸分子转化一个或多个植物细胞，其中一种或多种核酸分子编码grf蛋白、gif蛋白或grf-gif嵌合体；和(2)在再生培养基中培养所述一个或多个植物细胞。实施方案提供grf和gif核酸分子或多肽，所述核酸分子或多肽能分开引入或作为嵌合体引入植物。构建体可包括编码嵌合体的核酸分子或实施方案中可引入多个构建体。
45.所述一个或多个植物细胞可瞬时或稳定转化。细胞可衍生自任何植物组织，例如来自叶外植体、小孢子、胚珠等。细胞可以是原生质体。
46.实施方案使得从转化时间到生成转基因植物的时间大幅减少。生成这类植物的时间可加速，从而生成转基因植物的时间相较于grf/gif蛋白未引入植物情况下生成转基因植物的时间减少5天、10天、15天、20天、25天、30天或更多，或是介于两者之间的时间量。例如，在小麦中用所述蛋白和其编码核酸分子使转基因植物的产生从90天加速到60天。
47.术语植物或植物材料或植物部分在本文中广泛用于包括任意发育阶段的任何植物，或植物部分，包括植物扦插、植物细胞、植物细胞培养物、植物器官、植物种子和小植物。
植物细胞是植物的结构和生理单元，包括原生质体和细胞壁。植物细胞可处于分离的单一细胞或细胞聚集物形式，如疏松型愈伤组织或培养细胞，或可以是更有序单元，例如植物组织、植物器官或植物。因此，植物细胞可以是原生质体、配子生成细胞或能再生成完整植物的细胞或细胞集合。如此，包括多个植物细胞且能够再生成全植物的种子，出于本公开目的被视作植物细胞。植物组织或植物器官可以是种子、原生质体、愈伤组织或任意其他植物细胞群，所述细胞组成结构或功能单元。特别有用的植物部分包括可收获部分和用于后代植物繁殖的部分。植物的可收获部分可以是植物的任意有用部分，例如花、花粉、幼苗、块茎、叶、茎、果实、种子、根等。用于繁殖的植物部分包括例如种子、果实、扦插、幼苗、块茎、砧木(rootstock)等。组织培养物优选能够再生植物。优选地，这类组织培养物中的可再生细胞是胚、原生质体、分生细胞、愈伤组织、花粉、叶、花药、根、根尖、须、花、核仁、穗、穗轴、外壳或秆。还提供从组织培养物中再生的植物。
48.再生效率改进或提高指从一个或多个细胞再生的植物细胞、组织或植物的数目增加，所述一个或多个细胞引入了grf、gif或grf/gif嵌合体。在一个实施方案中，所述芽再生和胚发生的数目增加。其他实施方案提供能在培养基上出现的再生，所述培养基的细胞分裂素浓度对于植物细胞再生而言过低。使用此类方法，能够选择含有grf、gif或grf-gif嵌合体的植物，而不需单独标记物以鉴定转化细胞。能在这类培养基上生长的植物包含所述分子或蛋白。在某些实施方案中，所述grf蛋白可以是小麦grfgrf1、grf2grf2、grf3、grf4、grf5、grf6或grf9多肽或者其他植物物种中的相关蛋白。实施方案的一个示例中，所述grf蛋白是小麦、水稻、拟南芥、葡萄、柑橘或辣椒grf多肽。其他实施方案中，所述grf蛋白是小麦grf4或与小麦grf4有显著相同性的蛋白，gif是小麦gif1或与小麦gif1有显著相同性的蛋白。示范性实施方案中，所述grf多肽可如seq id no:9-23和37-39中任一者所示。gif序列示例是seq id no:24-30,43-44和52所示那些中的任一者。在一些实施方案中，所述grf与上面所列序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％相同。在一些实施方案中，所述gif与上面所列序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约95％或至少约99％相同。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸分子编码嵌合grf-gif构建体，其中grf部分与小麦grf4对应部分或其他上面所列grf序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％相同，gif部分与上面gif序列对应部分且在一个实施方案中与小麦gif1序列至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或至少约99％相同。在一些实施方案中，所述一种或多种核酸分子编码嵌合grf4-gif1构建体。
49.在一些实施方案中，所述grf蛋白包含qlq和wrc结构域，其与可在seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13,seq id no:14、seq id no:15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21或seq id no:22中找到的至少一个所述结构域至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％相同。在其他实施方案中，所述grf包含qlq和wrc结构域，其与seq id no:69
–
83的至少之一的至少一种qlq结构域和seq id no:84
–
95的至少之一的wrc结构域至少70％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％相同，所述结构域可以在seq id no:9、seq id no:10、seq id no:11、seq id no:12、seq id no:13、seq id no:14、seq id no:
15、seq id no:16、seq id no:17、seq id no:18、seq id no:19、seq id no:20、seq id no:21或seq id no:22的全长grf序列中找到。在示例中，qlq结构域是如seq id no:69
–
83所示的那些，wrc结构域是如seq id no:84
–
95所示的和与其具有这种相同性的那些。
50.在一些实施方案中，所述gif包含snh结构域，其与seq id no:97
–
103中任一者至少70％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％相同，所述seq id no:97
–
103中任一者在seq id no:24、seq id no:25、seq id no:26、seq id no:27、seq id no:28、or seq id no:29or seq id no:133(os11g40100)、seq id no:134(os12g31350)or seq id no:135(os03g52320)的全长gif序列中找到。这类结构域示例是在seq id no:97-103、136和137中找到的和与其具有这种相同性的那些。
51.在一些实施方案中，所述一种或多种编码grf的核酸分子包含mir396识别位点中的一个或多个突变。其他实施方案提供的突变是沉默突变。其他实施方案提供减少grf蛋白阻遏的突变。还有其他实施方案提供对mir396靶位点进行的突变，如seq id no:53野生型序列所示，且在一个示例中能生成seq id no:54的经修饰mir396。
52.术语核酸分子是指一个核酸分子，其可以是rna分子以及dna分子，且可以是编码所需多肽或蛋白的分子，而且还指不构成完整基因且不必定编码多肽或蛋白的核酸分子。例如，当用于同源重组过程时，启动子可置于构建体内，该构建体具有与植物染色体区域类似的序列，其可能不编码蛋白。若需要，感兴趣的核苷酸序列能对植物翻译优化，这是通过优化用于植物的密码子和就植物而言翻译起始位点周围的序列进行的。还能避免导致潜在mrna不稳定的序列。
53.除非另有说明，特定核酸序列还暗示涵盖其保守修饰变体(如简并密码子置换)和互补序列以及明确所示序列。术语保守修饰变体适用于氨基酸和核酸序列。关于特定核酸序列，保守修饰变体指编码相同氨基酸序列或其保守修饰变体的那些核酸。由于遗传密码的简并性，大量功能相同的核酸编码任意给定蛋白。例如，密码子gca、gcc、gcg和gcu都编码氨基酸丙氨酸。因此，在丙氨酸由密码子指定的每一个位置，该密码子可改变成所述任意对应密码子，而不需改变所编码多肽。这种核酸变化是沉默变化且代表一种保守修饰变化。本文的各核酸序列编码多肽，还通过参照遗传密码，描述核酸的每一种可能沉默变化。普通技术人员会认识到，核酸的各密码子(除了aug，其通常是甲硫氨酸的唯一密码子；和ugg，其通常是色氨酸的唯一密码子)能修饰成产生功能相同分子。因此，多肽编码核酸的各沉默变化示于各所述多肽序列且在所述产物和过程范围内。
54.对于氨基酸序列，技术人员会认识到单独取代、缺失或加入核酸、肽、多肽或蛋白序列，会改变、添加或删除编码序列中的单一氨基酸或小部分氨基酸，这是“保守修饰变体”，在本文中称为“变体”，其中改变导致某一氨基酸被化学相似氨基酸取代。本领域熟知提供功能相似氨基酸的保守取代表。参见例如davis等,"分子生物学基本方法(basic methods in molecular biology)"appleton&lange,康涅狄克州诺瓦克.(1994)。
55.下列8组各包含彼此保守取代的氨基酸：1)丙氨酸(a)、甘氨酸(g)；2)天冬氨酸(d)、谷氨酸(e)；3)天冬酰胺(n)、谷氨酰胺(q)；4)精氨酸(r)、赖氨酸(k)；5)异亮氨酸(i)、亮氨酸(l)、甲硫氨酸(m)、缬氨酸(v)；6)苯丙氨酸(f)、酪氨酸(y)、色氨酸(w)；7)丝氨酸(s)、苏氨酸(t)；和8)半胱氨酸(c)、甲硫氨酸(m)(参见例如creighton,《蛋白质：结构和分子性质》(proteins:structures and molecular properties)(wh freeman&co.；第2版
(1993年12月))。
56.在一个实施方案中，所述编码同一物质的grf多肽或其编码核酸分子选自小麦grfgrf1、grf2grf2、grf3、grf4、grf5、grf6、grf9多肽或其编码核酸分子或者其同源物。实施方案提供编码gif多肽或其编码核酸分子，选自小麦gif1、gif2或gif3多肽或其编码核酸分子或者其同源物。实施方案提供所述多肽或其编码核酸分子，其是小麦grfgrf1、grf2grf2、grf3、grf4、grf5、grf6、grf9多肽或其编码核酸分子或者这类小麦多肽或其编码核酸分子的同源物。其他实施方案提供所述多肽或其编码核酸分子，其是小麦gif1、gif2或gif3多肽或其编码核酸分子或者其同源物。同源物是保留相同生物功能的不同种类中所遗传基因或多肽。grf家族如本文所定义，是具有介导蛋白-蛋白和蛋白-dna相互作用的保守qlq和wrc结构域的转录因子，如本文所讨论，在陆生植物中高度保守并已在双子叶植物、单子叶植物、裸子植物和藓类植物中鉴定。gif蛋白与grf相互作用且具有保守snh结构域。这类grf和gif多肽具有改进再生效率的特性，尤其是以嵌合蛋白组合时。本文提供这种同源物示例，如水稻、柑橘、葡萄、辣椒和拟南芥中发现的那些。本领域技术人员能容易地鉴定这类同源物。例如，ncbi提供在其他生物中搜索基因或蛋白的同源物。参见ncbi.nlm.nih.gov/homologene。此外，这种序列包括与本文所示grf和gif核酸分子或多肽序列在严格杂交条件下杂交的那些。
57.用于比较的序列比对方法为本领域熟知。因此，确定任意2种序列之间的相同性百分比，能用数学算法完成。
58.用于比较的最佳序列比对能采用本领域已知任何方式以分析序列相同性(同源性)，如通过以下方法进行：称为“pileup”的渐进式比对方法(morrison,(1997)mol.biol.evol.14:428-441,作为应用pileup的示例)；smith&waterman的局部同源性算法(adv.appl.math.2:482(1981))；needleman&wunsch的同源比对算法(j.mol.biol.48:443-453(1970))；pearson的相似性检索法(proc.natl.acad.sci.usa 85:2444(1988))；这些算法的电脑化实施(如wisconsin genetics软件包中的gap,best fit,fasta和tfasta,gcg(genetics computer group),575science dr.,威斯康星州麦迪逊)；clustalw(pc/gene程序中的clustal，intelligenetics,加利福尼亚州山景城，描述于例如higgins(1988),gene 73:237-244；corpet(1988),nucleic acids res.16:10881-10890；huang,computer applications in the biosciences 8:155-165(1992)；和pearson(1994),methods in mol.biol.24:307-331)；pfam(sonnhammer(1998),nucleic acids res.26:322-325)；treealign(hein(1994),methods mol.biol.25:349-364)；meg-align和sam序列比对计算机程序；或人工目检。
59.适合确定序列相似性的另一示例是blast算法，其描述于altschul等,(1990)j.mol.biol.215:403-410。altschul,s.f.等的blast程序(基本局部比对搜索工具)在默认参数下搜索与blast“genembl”数据库所含序列的相同性。能分析序列与genembl所含全部公开可用dna序列的相同性，使用默认参数下的blastn算法。
60.进行blast分析的软件通过national center for biotechnology information,www.ncbi.nlm.nih.gov/可公开获得；就"powerblast"变化而言还参见zhang(1997),genome res.7:649-656。此算法涉及首先鉴定高得分序列对(hsp)，这是通过在查询序列中鉴定长度w的短字，其与数据库序列中相同长度的字比对时，匹配或满足一些正值阈值得分
t。t被称为邻域字得分阈值(altschul等(1990),j.mol.biol.215:403-410)。这些初始邻域字命中用作起始搜索的种子以发现含有其的较长hsp。字命中在沿着各序列的2个方向延伸，只要累积比对得分能够增加。各方向的字命中延伸在以下情况时停止：累积比对得分比其最高实现值减少量x；累积得分达到零或以下，这归因于一个或多个负分残基比对的积累；或达到任一序列末端。blast算法参数w,t和x决定比对的灵敏度和速度。blast程序采用如下默认值：字长(w)为11，blosum62打分矩阵(参见henikoff(1992),proc.natl.acad.sci.usa 89:10915-10919)比对(b)为50，预期(e)为10，m＝5,n＝-4,和2条链的比较。术语blast指对2种序列之间相似性进行统计分析的blast算法；参见例如karlin(1993),proc.natl.acad.sci.usa90:5873-5787。blast算法提供的一个相似性量度是最小概率和(p(n))，其指示2种核苷酸或氨基酸序列之间的匹配会偶然发生的可能性。例如，若测试核酸与参照核酸对比中的最小概率和小于约0.1，更优选小于约0.01，最优选小于约0.001，则核酸被视作与参照序列相似。
61.在一个实施方案中，能使用gap(全局比对程序)。gap使用needleman和wunsch算法(j.mol.biol.48:443-453,1970)以发现2种使匹配数最大且缺口数最小的完整序列。常用wisconsin(accelrys公司(accelrys,inc.),加利福尼亚州圣地亚哥)版本10就蛋白序列而言默认缺口产生罚分值和缺口延伸罚分值，分别为8和2。对于核苷酸序列，默认缺口产生罚分是50，而默认缺口延伸罚分是3。相似性百分比是类似符号的百分比。忽视跨缺口的符号。当一对符号的打分矩阵值高于或等于0.50时，对相似性进行打分。通用打分系统是blosum62矩阵(henikoff和henikoff(1993),proteins 17:49-61)，其目前是blast程序的默认选择。blosum62使用3个矩阵的组合以覆盖所有意外事件。altschul,j.mol.biol.36:290-300(1993)通过引用全文纳入本文，其是用于wisconsin(accelrys公司,加利福尼亚州圣地亚哥)版本10的打分矩阵(参见henikoff&henikoff(1989)proc.natl.acad.sci.usa 89:10915)。
62.(c)如本文所用，2种核酸序列背景下的“序列相同性”或“相同性”指在指定比较窗口中就最大对应性比对时，2种序列内相同的残基。
63.(d)如本文所用，“序列相同性百分比”指通过在比较窗口对比2种最优比对序列而确定的值，其中比较窗口内的多核苷酸序列部分可包括相较参照序列(不包括添加或缺失)的添加或缺失(即缺口)以最优比对2种序列。百分比如下计算：确定相同核酸碱基在2种序列中出现的位置数以产生匹配位置数，将匹配位置除以比较窗口中的位置总数，该结果乘以100，产生序列相同性百分比。
64.涉及杂交技术时，所有或部分的已知核苷酸序列能用作探针，其选择性杂交来自选定生物的克隆基因组dna片段或cdna片段(即基因组或cdna库)群中存在的其他对应核苷酸序列。杂交探针可以是基因组dna片段、cdna片段、rna片段或其他寡核苷酸，且能用可检测基团如32p或任意其他可检测标志物标记。因此，例如，通过基于dna序列标记合成寡核苷酸，能制备杂交探针。用于制备杂交探针和构建cdna及基因组库的方法为本领域众所周知并公开(sambrook等,2001)。
65.例如，本文公开的序列或其一个或多个部分，可用作能够与对应序列特异性杂交的探针。为在多种条件下实现特异性杂交，这类探针包括在待筛选序列中独特且优选长度为至少约10个核苷酸、最优选至少约20个核苷酸的序列。或者，这种序列可用于从选定植物
中通过pcr扩增对应序列。此技术可用于从所需植物分离序列或作为诊断试验以确定植物中序列的存在。杂交技术包括dna文库铺板成为噬斑或菌落的杂交筛选(sambrook等,2001)。
66.这种序列的杂交可在严格条件下完成。“严格条件”或“严格杂交条件”是预定条件，在该条件下探针与其靶序列的杂交程度明显高于其他序列(如相比背景至少2倍)。严谨条件是序列依赖性且在不同环境下有差异。通过控制杂交严谨性和/或洗涤条件，能鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，严谨条件能调整成允许序列的某些错配，从而检测到较低程度的相似性(异源探测)。一般，探针长度小于约1000个核苷酸，优选长度小于500个核苷酸。
67.通常，严格条件是盐浓度低于约1.5m na离子的那些，一般在ph 7.0-8.3下约0.01-1.0m na浓度(或其他盐)，且温度就短探针(如10-50个核苷酸)而言是至少约30℃，就长探针(如大于50个核苷酸)而言是至少约60℃。严格条件还可通过加入去稳定剂如甲酰胺来实现。示范性低严谨条件包括用30-35％甲酰胺，1m nac1，1％sds(十二烷基磺酸钠)的缓冲溶液在37℃杂交，在1x-2x ssc(20x ssc＝3.0m nac1/0.3m柠檬酸三钠)中50-55℃洗涤。示范性中等严谨条件包括用40-45％甲酰胺,1m nac1,1％sds在37℃杂交，在0.5x-1x ssc中55-50℃洗涤。示范性高严谨条件包括用50％甲酰胺，1m nac1，0.1％sds在37℃杂交，在0.1x ssc中60-65℃洗涤。
68.特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因子是终洗涤溶液的离子强度和温度。对于dna-dna杂交体，tm能从meinkoth和wahl等式中近似推出，anal.biochem.,138:267-284(1984):tm＝81.5℃+16.6(log m)+0.41(％gc)
–
0.61(％form)
–
500/l；其中m是一价阳离子的摩尔浓度，％gc是dna中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％形式是杂交溶液中甲酰胺的百分比，l是碱基对中杂交体的长度。tm是温度(在定义离子强度和ph下)，在该处50％互补靶序列与完全匹配的探针杂交。就各1％错配而言，tm降低约1℃；因此，tm，杂交和/或洗涤条件能调整成与具有所需相同性的序列杂交。例如，若搜索～90％相同性的序列，tm能减少10℃。一般，就确定离子强度和ph下的特异序列和其补体而言，严谨条件选择为比热熔点(tm)低5℃。然而，非常严谨条件能采用在低于热熔点(tm)1、2、3或4℃下的杂交和/或洗涤；中等严谨条件能采用在低于热熔点(tm)6、7、8、9或10℃下的杂交和/或洗涤；低严谨条件能采用在低于热熔点(tm)11、12、13、14、15或20℃下的杂交和/或洗涤。使用等式、杂交和洗涤组合物以及所需tm，普通技术人员应理解杂交和/或洗涤溶液的严谨性变化如固有所描述。如果所需错配程度导致tm小于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加ssc浓度，从而能使用更高温度。关于核酸杂交的广泛指南参见tijssen(1993)《生物化学与分子生物学的实验室技术—用核酸探针的杂交》(laboratory techniques in biochemistry and molecular biology
‑‑
hybridization with nucleic acid probes),第i部分,第2章(纽约爱思唯尔(elsevier))；和ausubel等编.(1995)《精编分子生物学实验指南》(current protocols in molecular biology),第2章(格林出版社(greene publishing)和wiley-interscience出版公司(wiley-interscience),纽约)。参见sambrook等.(2001)《分子克隆：实验室手册》(molecular cloning:a laboratory manual)(第3版,冷泉港实验室出版社(cold spring harbor laboratory press),纽约普莱恩维尤)和haymes等.(1985)收录于:《核酸杂交，实用方法》(nucleic acid hybridization,a practical approach),华盛顿特区的irl出版
社(irl press)。
69.在核酸或多肽插入细胞上下文中引入的术语包括转染或转化或转导，且在一个实施方案中包括将核酸并入真核或原核细胞，其中核酸可并入细胞基因组(如染色体、质粒、质体或线粒体dna)，以及转变成自主复制子或瞬时表达(如转染mrna)。如下所讨论，向植物引入蛋白能采用诸如实施例8所述那些方法。
70.多种转化/转染方法可用。由于有更新的方法可用于转化农作物或其他宿主细胞，其可直接应用。因此，开发了多种方法向宿主细胞基因组插入dna序列，以获得转录或转录本或序列翻译，从而实现生物体的表型改变。由此，可采用提供有效转化/转染的任意方法。使用本文方法，再生效率提高。
71.例如但不限于，本领域技术人员可获得的向植物组织引入表达载体的方法可变且取决于所选植物。熟知转化多种植物物种的程序并在文献中描述(参见例如miki和mchugh(2004)biotechnol.107,193-232；klein等.(1992)biotechnology(n y)10,286-291；和weising等.(1988)annu.rev.genet.22,421-477)。例如，dna构建体可引入植物细胞基因组dna，使用技术如微弹介导的递送(klein等.1992,同上)、电穿孔(fromm等,1985proc.natl.acad.sci.usa 82,5824-5828)、聚乙二醇(peg)沉淀(mathur和koncz,1998methods mol.biol.82,267-276)、直接基因转移(wo 85/01856和ep-a-275 069)、体外原生质体转化(美国专利号4,684,611)和微注射植物细胞原生质体或胚性愈伤组织(crossway,a.(1985)mol.gen.genet.202,179-185)。ishida等.(1996)的且还描述于美国专利号5,591,616的农杆菌转化方法是另一选择。植物组织与根癌农杆菌(agrobacterium tumefaciens)共培养是一种变化形式，其中dna构建体置于双元载体系统内(ishida等,1996nat.biotechnol.14,745-750)。根癌农杆菌的毒性作用会在细胞受细菌感染时指导构建体插入植物细胞dna。参见例如fraley等.(1983)proc.natl.acad.sci.usa,80,4803-4807。农杆菌主要用于双子叶植物，但包括玉米在内的单子叶植物能由农杆菌转化。参见例如美国专利号5,550,318。在此方法的许多变化之一中，农杆菌感染玉米能与热激幼胚(wilson等.美国专利号6,420,630)或抗生素选择ii型愈伤组织(wilson等,美国专利号6,919,494)一起使用。
72.水稻转化描述于hiei等.(1994)plant j.6,271-282和lee等.(1991)proc.nat.acad.sci.usa 88,6389-6393。油菜籽转化的标准方法描述于moloney等.(1989)plant cell reports 8,238-242。玉米转化描述于fromm等.(1990)biotechnology(n y)8,833-839和gordon-kamm等.(1990)同上。小麦能通过与转化玉米或水稻所用类似的技术来转化。高粱转化描述于casas et al.(casas等.(1993)《经微粒轰击的转基因高粱植物》(transgenic sorghum plants via microprojectile bombardment).proc.natl.acad.sci.usa 90,11212-11216)且大麦转化描述于wan和lemaux(wan和lemaux(1994)《产生大量独立转化的可育大麦植株》(generation of large numbers of independently transformed fertile barley plants).plant physiol.104,37-48)。一些出版物描述了大豆转化，包括美国专利号5,015,580。在某些实施方案中，所述调节序列包括诱导型启动子。在其他实施方案中，所述grf、gif或grf-gif嵌合体的活性受诱导型系统调控。诱导型系统可以是或可包括与grf、gif或grf-gif蛋白融合的糖皮质激素受体。还可使用其他诱导型系统。
73.在本文所述某些实施方案中，所述一个或多个转化植物细胞可在含次优浓度外源细胞分裂素的再生培养基中培养。术语“未达最优的浓度”定义为任意浓度，其低到无法允许未转化有grf-gif嵌合体或grf和/或gif转基因的植物细胞适当再生。例如，未达最优的浓度可以是小于约50％，小于约10％，小于约5％，小于约1％或小于0.01％的植物再生常用细胞分裂素浓度。可测试细胞分裂素浓度以确定未达最优的浓度，其允许用grf-gif嵌合体转化的植物细胞再生，但不足以诱导非转基因植物再生。这能用作正相选择法以鉴定转基因芽，而不需使用抗生素标志物。
74.在某些实施方案中，本文所公开的方法提高再生效率。再生效率指能再生的植物细胞数目。该方法使得效率相较于未引入grf/gif多肽或核苷酸的植物的再生增加。再生效率可增加1％、2％、3％、4％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％或更多或两者之间。例如但不限于，未用grf/gif情况下再生效率为10％的植物能增加至50
–
70％。效率为1％的植物能增加至10
–
20％且再生效率为零的植物能增加至1-5％。
75.在一些实施方案中，所述用于本文公开方法的一种或多种核酸分子除了编码grf和gif，还编码至少一种额外感兴趣多核苷酸。
76.本文所公开方法可用于多种植物。在某些实施方案中，所述方法可用于再生效率低的植物。在某些实施方案中，所述植物是单子叶植物物种。在某些其他实施方案中，所述植物是双子叶植物物种。在某些其他实施方案中，所述植物既不是单子叶，也不是双子叶植物物种。示范性物种包括但不限于玉米(玉蜀黍(zea mays))、油菜(欧洲油菜(brassica napus)、芜菁(brassica rapa ssp.))、苜蓿(紫花苜蓿(medicago sativa))、水稻(水稻(oryza sativa))、黑麦(黑麦(secale cereale))、高粱(高粱(sorghum bicolor)、sorghum vulgare)、向日葵(向日葵(helianthus annuus))、小麦(小麦(triticum aestivum))、黑小麦((
×
小黑麦(triticosecale),小麦和黑麦的杂交)、黑小麦(triticale)(
×
小黑麦(triticosecale)、小麦和黑麦的杂交种)、大豆(大豆(glycine max))、烟草(烟草(nicotiana tabacum))、土豆(马铃薯(solanum tuberosum))、花生(花生(arachis hypogaea))、棉花(陆地棉(gossypium hirsutum))、甘薯(金叶甘薯(ipomoea batatus))、木薯(木薯(manihot esculenta))、咖啡(cofea spp.)、椰子(椰子(cocos nucifera))、菠萝(菠萝(ananas comosus))、柑橘树(柑橘(citrus spp.))、可可(可可(theobroma cacao))、茶(野茶树(camellia sinensis))、香蕉(芭蕉类(musa spp.))、鳄梨(牛油果(persea americana))、无花果(无花果(ficus casica))、番石榴(番石榴(psidium guajava))、芒果(芒果(mangifera indica))、橄榄(油橄榄(olea europaea))、番木瓜(木瓜(carica papaya))、腰果(腰果(anacardium occidentale))、澳洲坚果(澳洲坚果(macadamia integrifolia))、杏仁(巴旦杏(prunus amygdalus))、甜菜(甜菜(beta vulgaris))、燕麦(燕麦(avena))、大麦(大麦(hordeum))、蔬菜、观赏植物和松柏类。蔬菜包括番茄(番茄(lycopersicon esculentum))、甜椒(番椒(capsicum annuum))、生菜(如莴苣(lactuca sativa))、青豆(菜豆(phaseolus vulgaris))、利马豆(莱豆(phaseolus limensis))、豌豆(山黧豆属(lathyrus spp.))和黄瓜属成员如黄瓜(黄瓜(c.sativus))、哈密瓜(罗马甜瓜(c.cantalupensis))及甜瓜(甜瓜(c.melo))。观赏植物包括杜鹃花(杜鹃花(rhododendron spp.))、绣球花(绣球花(macrophylla hydrangea))、木槿(芙蓉
(hibiscus rosasanensis))、玫瑰(玫瑰(rosa spp.))、郁金香(郁金香(tulipa spp.))、水仙花(水仙(narcissus spp.))、矮牵牛花(矮牵牛(petunia hybrida))、康乃馨(康乃馨(dianthus caryophyllus))、一品红(一品红(euphorbia pulcherrima))和菊花。可用于本发明的松柏类包括例如松树如火炬松(火炬松(pinus taeda))、湿地松(湿地松(pinus elliotii))、杰克松(西黄松(pinus ponderosa))、美国黑松(扭叶松(pinus contotta))和辐射松(辐射松(pinus radiata))；花旗松(黄杉(pseudotsuga menziesii))；西部铁杉(加拿大铁杉(tsuga canadensis))；西加云杉(白云杉(picea glauca))；红木树(加州红木(sequoia sempervirens))；冷杉如银杉(胶冷杉(abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(abies balsamea))；和香柏如西红杉(北美乔柏(thuja plicata))和阿拉斯加柏木(黄扁柏(chamaecyparis nootkatensis))。
77.优选实施方案中的植物可选自稻属(oryza)、棉属(gossypium)、甘氨酸、葡萄属(vitis)、苜蓿属(medicago)、胡桃属(juglans)、柑橘属(citrus)、辣椒属(capsicum)、高粱属(sorghum)、玉蜀黍属(zea)、大麦属(hordeum)或小麦属(triticum)或其他合适植物物种。在某些实施方案中，所述植物是圆锥小麦(triticum turgidum)或小麦(triticum aestivum)。
78.本公开还提供通过本文所述任意方法产生的植物。
79.本公开提供调整植物中grf和gif基因表达的方法，以改进再生效率和允许在外源细胞分裂素缺乏情况下的再生。这些方法可如下实施：提高植物、植物细胞或原生质体中grf和/或gif或grf-gif嵌合体的蛋白水平和活性。
80.在一些实施方案中，所述植物或植物细胞中的grf和gif基因可通过多种方式增加，包括使用各自仅有grf基因或gif基因的载体，或有grf-gif嵌合体的载体。grf基因可突变使得其对mir396遏制不太敏感。编码生长调节因子蛋白(grf)和/或grf相互作用因子蛋白(gif)的一种或多种核酸分子可操作连接植物细胞内可操纵的调节序列。载体中的基因可由多种启动子控制，包括诱导型、组织特异性和组成型启动子。植物或植物细胞可通过多种方式转化，包括使用携带有grf和/或gif基因的载体的农杆菌或轰击。
81.基因编辑可与本发明联用。例如，有grf和/或gif或grf-gif嵌合体及cas9的载体可用于植物或植物细胞的基因编辑。植物或植物细胞能转化以瞬时或稳定表达核酸。grf和/或gif或grf-gif嵌合体蛋白可递送到植物或植物细胞以增加再生效率，采用其他研究者所述递送crispr/cas9预组装核糖核蛋白复合体(rnp)的方法(woo等,2015；subburaj等,2016；malnoy等,2016；kim等,2017；liang等,2017；svitashev等,2016；wolter等,2017)。
82.使感兴趣的分子(moi)靶向靶基因靶位点的方法可用于本方法。以下通过举例方式提供，而不是限制。引导核酸分子可指导核酸酶到基因组中特定切割位点，无论是否通过使用结合域、识别域、引导rna或其他机制。将引导核酸分子引入细胞，所处条件适合操作引导核酸分子将切割导向靶基因座。本领域技术人员可获得一些能使用的方法，最常用核酸酶切割基因靶区域，以及在靶基因座识别序列和指导切割到基因座的序列。能切割多核苷酸链中磷酸二酯键的任何核酸酶可用于本文所述方法。例如但不限于，可用的系统包括采用特异核酸酶(ssn)的那些，如zfn(锌指核酸酶)whyte,等.《细胞生物学研讨会：产生定制设计修饰的锌指核酸酶》(cell biology symposium:zinc finger nucleases to create custom-designed modifications).j anim sci 90,1111-1117(2012))；talen(转录激活
因子样效应物核酸酶)(参见carlson,d.f.等.《动物中的有效talen介导基因敲除》(efficient talen-mediated gene knockout in animals).proc natl acad sci us a 109,17382-17387(2012)；tan,w.等.《家畜中用定制核酸内切酶的有效非减数分裂等位基因基因渗入》(efficient nonmeiotic allele introgression in livestock using custom endonucleases).proc natl acad sci u s a 110,16526-16531(2013)；和crispr(规律成簇的间隔短回文重复)
–
相关(cas)核酸酶系统(hai,t.,teng,f.,guo,r.,li,w.&zhou,q.《通过受精卵注射crispr/cas系统一步式产生基因敲除猪》(one-step generation of knockout pigs by zygote injection of crispr/cas system)cell res 24,372-375(2014))允许动物基因组编辑。重组酶如美国专利号6,720,475所述flp/frt或美国专利号5,658,772所述cre/lox，能用于整合多核苷酸序列到特定染色体位点。大范围核酸酶用于将供体多核苷酸靶入特定染色体位置，如描述于puchta等,pnas usa 93(1996)第5055-5060页。zfn与结合结合域的蛋白或蛋白结构域一起运作，所述结合域由于使用锌离子而具有稳定结构。talen利用有重复氨基酸的结构域，其能特异性识别dna序列中的碱基对。关于2种系统的讨论，参见voytas等.美国专利号8,697,853，其通过引用全文纳入本文。这些系统采用就各靶序列制备的酶。
83.提到靶基因或分子，意在指基因组内任何核酸分子，其需要如所述修饰或在该处需要删除或插入核酸分子或以某些方式修饰分子。靶分子是核酸序列时，靶分子可以是例如编码基因产物(如蛋白)的序列或非编码序列(如调节多核苷酸或垃圾dna)。
84.本文所用术语“再生”指从另一植物或植物细胞产生一种植物或植物细胞。这包括从产生自植物胚或初生叶的愈伤组织生成芽。在一些实施方案中，所述植物、植物细胞或原生质体可再生自经转化从而grf和/或gif或grf-gif嵌合体表达增加的植物、植物细胞或原生质体。在一些实施方案中，所述植物、植物细胞或原生质体可用至少一种额外多肽转化，该植物、植物细胞或原生质体再生自经转化从而grf和/或gif或grf-gif嵌合体表达增加的植物、植物细胞或原生质体。
85.在多个实施方案中，所述植物或植物细胞源自多个植物物种，包括抗转化、再生效率低的那些，和小麦属、葡萄属、稻属、棉属、柑橘属、辣椒属、高粱属和胡桃属中的那些。
86.本公开还提供在没有外源细胞分裂素情况下再生植物或植物细胞的方法。在某些实施方案中，所述方法包括向植物细胞引入grf基因和/或gif基因或grf-gif嵌合体并在基本没有外源细胞分裂素的培养基中培养细胞以再生植物的方法。grf和gif基因可以是普通小麦、圆锥小麦硬粒小麦(triticum turgidum ssp.durum)或另一植物物种，包括再生效率低或抗转化的那些。
87.在多个实施方案中，所述植物可转化，使用各自仅有grf基因或gif基因的载体，有作为嵌合体的grf-gif的载体，或有非嵌合形式grf-gif的载体。
88.在某些实施方案中，所述植物难以或被视作难以再生。
89.核酸分子或多肽可与其他组分一起引入植物。如本文所用，核苷酸区段在以功能性方式与另一dna区段放置时被称作可操作连接。例如，用于信号序列的dna可操作连接多肽编码dna，此时其表达为参与多肽分泌的前蛋白；启动子或增强子可操作连接编码序列，此时其刺激序列转录。可操作连接的元件可以是连续或非连续。当指连接2个蛋白编码区时，可操作连接指编码区处于同一阅读框。或者，额外的基因能在多个表达盒提供。提供这
类表达盒，带有多个限制性位点和/或重组位点用于插入多个核苷酸以在调控区转录调节下。除了启动子，表达盒还能包括一个或多个增强子。增强子指增加启动子使用的顺式作用序列。这类增强子可以对基因而言是天然的或来自异源基因。此外，应认识到一些启动子能包含一个或多个增强子或增强子样元件。一个这种增强子示例是35s增强子，其可以是单一增强子或重复的。参见例如mcpherson等,美国专利5,322,938。
90.术语启动子、启动子区或启动子序列一般指基因的转录调节区，其可在编码区5'或3'侧发现，或在编码区内，或在内含子内。通常，启动子是dna调节区，其能够结合细胞中的rna聚合酶并起始下游(3'方向)编码序列转录。典型5'启动子序列通过转录起始位点在其3'末端结合并延伸上游(5'方向)以包含在高于背景的可检测水平上起始转录所需的最小碱基或元件数目。启动子序列内包括转录起始位点(通过核酸酶s1作图来方便地定义)以及负责rna聚合酶结合的蛋白结合域(共有序列)。
91.时空调控通常也对驱动植物中基因表达重要。例如，可选择和可打分的标志物必须在合适时间及合适组织中表达以允许筛选和控制酶，调节因子必须分别在代谢活性和生理响应性组织中生成。类似地，赋予宿主保护的基因必须在用于病原体或害虫的靶组织中表达，植物生成的蛋白产物应在适合蛋白积聚和存储的组织中表达。此外，由于某些蛋白产物在对生存及生长必需的代谢活性组织中表达时可能对植物健康和收率产生有害影响，在选定的植物存储组织中有活性，但在其他、非存储组织中显示低活性或没有活性的启动子可能是有利的。
92.在所述方法中，能采用很多指导植物中核酸分子表达的启动子。这类启动子可以选自组成型、化学调节、诱导型、组织特异性和种子优选启动子。例如，组成型启动子包括核心camv 35s启动子(odell等.(1985)nature 313:810-812)；水稻肌动蛋白(mcelroy等.(1990)plant cell 2:163-171)；泛素(欧洲专利申请号0 342 926；christensen等.(1989)plant mol.biol.12:619-632和christensen等.(1992)plant mol.biol.18:675-689)；pemu(last等.(1991)theor.appl.genet.81:581-588)；mas(velten等.(1984)embo j.3:2723-2730),rsyn7启动子的核心启动子和公开于wo 99/43838和美国专利号6,072,050的其他组成型启动子等。
93.本领域技术人员应理解启动子序列能修饰成提供一定范围的表达水平和可操作连接的异源核酸分子。可使用不到整个的启动子区且驱动表达的能力保留。然而，认识到mrna表达水平能在缺失部分启动子序列下减少。因此，启动子能修饰成弱或强启动子。一般，“弱启动子”意在指以低水平驱动编码序列表达的启动子。“低水平”意在指约1/10,000转录本到约1/100,000转录物到约1/500,000转录物的水平。相反，强启动子以高水平或约1/10转录物到约1/100转录物到约1/1,000转录物的水平，驱动编码序列表达。
94.组织偏爱启动子能用于靶向特定植物组织内的增强转录和/或表达。当涉及优选表达时，意味着特定植物组织内的表达水平高于其他植物组织。这些启动子类型示例包括种子优选表达，如菜豆素启动子(bustos等.(1989)the plant cell卷1,839-853)和玉米球蛋白-1基因belanger等.(1991)genetics 129:863-972提供的那些。
95.可用植物相容性启动子的范围包括诱导型启动子。任何诱导型启动子能用于本发明的方法。参见ward等.plant mol.biol.22:361-366(1993)。示范性诱导型启动子包括蜕皮激素受体启动子，美国专利号no.6,504,082；来自ace1系统的启动子，其响应铜(mett等
.pnas 90:4567-4571(1993))；来自玉米的in2-1和in2-2基因，其响应苯磺酰胺除草剂安全剂(美国专利号5,364,780；hershey等,mol.gen.genetics 227:229-237(1991)和gatz等,mol.gen.genetics 243:32-38(1994))来自tn10的tet阻遏物(gatz等,mol.gen.genet.227:229-237(1991)；或来自甾类激素基因，其转录活性由糖皮质类固醇激素诱导。schena等,proc.natl.acad.sci.u.s.a.88:10421(1991)；玉米gst启动子，其由用作萌前除草剂的疏水亲电化合物激活；和烟草pr-1a启动子，其水杨酸激活。其他感兴趣的化学调节启动子包括类固醇响应启动子(参见例如糖皮质激素诱导型启动子，schena等.(1991)proc.natl.acad.sci.usa88:10421-10425和mcnellis等.(1998)plant j.14(2):247-257)以及四环素诱导型和四环素抑制型启动子(参见例如gatz等.(1991)mol.gen.genet.227:229-237和美国专利号5,814,618及5,789,156)。
96.冷响应调节元件或热激调节元件，其转录能分别响应暴露于冷或热而实现(takahashi等,plant physiol.99:383-390,1992)；可由厌氧条件诱导的乙醇脱氢酶基因的启动子(gerlach等,pnas usa 79:2981-2985(1982)；walker等,pnas 84(19):6624-6628(1987))；和光诱导型启动子，衍生自pea rbcs基因或豌豆psadb基因(yamamoto等.(1997)plant j.12(2):255-265)；光诱导型调节元件(feinbaum等,mol.gen.genet.226:449,1991；lam和chua,science 248:471,1990；matsuoka等.(1993)proc.natl.acad.sci.usa 90(20):9586-9590；orozco等.(1993)plant mol.bio.23(6):1129-1138),植物激素诱导型调节元件(yamaguchi-shinozaki等,plant mol.biol.15:905,1990；kares等,plant mol.biol.15:225,1990)等。诱导型调节元件还可以是玉米in2-1或in2-2基因的启动子，其响应苯磺酰胺除草剂安全剂(hershey等,mol.gen.gente.227:229-237,1991；gatz等,mol.gen.genet.243:32-38,1994)和转座子tn10的tet阻遏物(gatz等,mol.gen.genet.227:229-237,1991)。应激诱导型启动子包括盐/水应激诱导型启动子如p5cs(zang等.(1997)plant sciences 129:81-89)；冷诱导型启动子如cor15a(hajela等.(1990)plant physiol.93:1246-1252),cor15b(wilhelm等.(1993)plant mol biol 23:1073-1077),wsc120(ouellet等.(1998)febs lett.423-324-328),ci7(kirch等.(1997)plant mol biol.33:897-909),ci21a(schneider等.(1997)plant physiol.113:335-45)；干旱诱导型启动子如trg-31(chaudhary等(1996)plant mol.biol.30:1247-57),rd29(kasuga等.(1999)nature biotechnology 18:287-291)；渗透诱导型启动子如rab17(vilardell等.(1991)plant mol.biol.17:985-93)和渗调蛋白(raghothama等.(1993)plant mol biol 23:1117-28)；和热诱导型启动子如热激蛋白(barros等.(1992)plant mol.19:665-75；marrs等.(1993)dev.genet.14:27-41),smhsp(waters等.(1996)j.experimental botany 47:325-338)及来自欧芹泛素启动子的热激诱导型元件(wo 03/102198)。其他应激诱导型启动子包括rip2(美国专利号5,332,808)和rd29a(yamaguchi-shinozaki等.(1993)mol.gen.genet.236:331-340)。某些启动子可通过创伤诱导，包括农杆菌pmas启动子(guevara-garcia等.(1993)plant j.4(3):495-505)和农杆菌orf13启动子(hansen等,(1997)mol.gen.genet.254(3):337-343)。
97.另外，可采用促进植物细胞鉴定的标志物，所述细胞含有编码标志物的多核苷酸。可打分或可筛选标志物有用，其中序列的存在生成了可测量产物且能生成植物细胞未破坏的产物。示例包括β-葡萄糖醛酸酶或uida基因(gus)，其所编码酶的多个显色底物已知(例
如美国专利5,268,463和5,599,670)；氯霉素乙酰转移酶(jefferson等.(1987)the embo journal vol.6no.13pp.3901-3907)；碱性磷酸酶。其他可筛选标志物一般包括花青素/黄酮类基因(讨论参见taylor和briggs,(1990)the plant cell 2:115-127)，包括例如r-基因座基因，其编码的产物可调节植物组织中生成花色苷色素(红色)(dellaporta等,《染色体结构和功能》(chromosome structure and function),克吕韦尔学术出版集团(kluwer academic publishers),appels和gustafson编,第263-282页(1988))；控制黄酮类色素生物合成的基因，如玉米c1基因(kao等,(1996)plant cell 8:1171-1179；scheffler等.(1994)mol.gen.genet.242:40-48)和玉米c2(wienand等,(1986)mol.gen.genet.203:202-207)；b基因(chandler等,(1989)plant cell 1:1175-1183),p1基因(grotewold等,(1991proc.natl.acad.sci usa)88:4587-4591；grotewold等,(1994)cell 76:543-553；sidorenko等,(1999)plant mol.biol.39:11-19)；bronze基因座基因(ralston等,(1988)genetics 119:185-197；nash等,(1990)plant cell 2(11):1039-1049)等。如本文所讨论，本发明使用细胞因子水平低于植物细胞再生所需的培养基时，可利用grf或gif或grf-gif嵌合体，而没有额外可选择标志物。
98.需要可纳入载体的多种其他信号序列和多聚腺苷酸化序列。
实施例
99.下列实施例仅用于说明。根据本公开，本领域技术人员会认识到这些实施例和所公开主题的其他实施方案的变化可行，而不需过度实验。提及本文实验时，参见图14，显示选定小麦grf基因grfgrf1-5的预测蛋白(seq id no:9
–
13)。小麦基因名基于chinese spring refseq v1.0。grf数字是基于水稻直系同源物。仅提供小麦a基因组同源物的序列(b和d基因组超过90％相同)。最接近小麦、水稻和拟南芥同源物的编码蛋白序列如seq id no:9
–
22所示，保守qlq和wrc结构域分别以黄色及绿色突出显示。5个水稻grf直系同源物的预测蛋白如图15所示(seq id no:13
–
18)。最接近拟南芥grf3-6的预测蛋白如图16a所示(seq id no:19
–
22)。嵌合体所用最接近葡萄grf的预测蛋白如图13b所示(seq id no:23)。
100.图17a显示拟南芥gif1和gif2的预测蛋白(seq id no:24
–
26)且17b显示普通小麦gif1、gif2和gif3的预测蛋白(seq id no:27
–
29)。小麦基因名基于chinese spring refseq v1.0。gif数字基于水稻直系同源物。仅提供小麦a基因组同源物的序列(b和d基因组超过90％相同)。最接近的拟南芥和小麦同源物的编码蛋白序列如下所示，保守snh结构域以黄色突出显示。葡萄gif如图17c所示(seq id no:30)。
101.实施例1
–
用grf-gif嵌合体转化小麦
102.为了尝试增加植物生物量以促进农业重要作物的谷物产量增加，我们测试了grf、gif和grf-gif嵌合体对小麦生长的影响。生成在玉米ubiquitin启动子下表达小麦grf-gif嵌合体的转基因植物。通过分子系统发育分析用邻接法鉴定了小麦基因组内10个grf和3个gif(图1)。为生成小麦grf-gif嵌合体，我们选择了水稻osgrf4的小麦grf同源物(图1a)，其在水稻中促进谷粒和植物生长(duan p等,2015；hu j等,2015；che r等,2015；sun p等2016；li,s.等.2018)。对于gif伴侣，我们选择了拟南芥gif1的最接近同源物(图1b)，因为此进化枝成员显示在拟南芥、水稻和玉米中控制生长(kim和kende 2004,horiguchi等,2005；shimano s等,2018；zhang d等,2018)。snh保守结构域的氨基酸序列用于进行图1b的
系统发育分析。拟南芥gif1的小麦最接近同源物以粗体突出显示。图1c中是嵌合构建体的示意图。来自拟南芥、水稻和短柄草(brachypodium)的grf及gif基因的氨基酸序列获自phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。grf及gif基因的氨基酸序列获自小麦基因组refseq v1.0。系统发育分析用mega6进行。小麦嵌合grf4-gif1的编码序列如图11a所提供且蛋白序列如图11b所提供。用于转化的构建体plc41-ubi::grf4-gif1序列如图12所提供。
103.随后我们通过农杆菌介导的转化将小麦grf4-gif1嵌合体转化入四倍体小麦kronos(圆锥小麦硬粒小麦亚种(triticum turgidum ssp.durum))。用携带grf4-gif1双元载体(构建体的示意图如图1c所示)的农杆菌感染的植物细胞再生出数量惊人的芽，显著高于用具有相同plc41骨架的载体的对照平行转化所得芽数目(图2)。grf和gif基因先前未与转基因植物中再生效率增加相关联。
104.接着我们在2个用grf4-gif1嵌合体的独立小麦转化实验和2个没有嵌合体的实验中分析愈伤组织块再生芽的频率。统计分析证明转化有grf4-gif1嵌合体的愈伤组织(92.8％
±
3.2％)中的愈伤组织块再生芽平均数比用无grf4-gif1嵌合体的构建体转化的愈伤组织(6.0％
±
2％)高15倍(p＝0.0019)。最后的数字代表kronos小麦转化，其中通常从含有25个愈伤组织的平板仅回收1或2个芽(图2，两侧)。对于小麦grf4-gif1嵌合体(图2，中间)，我们每个含有25个愈伤组织平板回收了约50个芽，转基因小麦植物的再生效率显著增加。
105.我们将26株独立t0植物转移至土壤以验证grf4-gif1嵌合体的存在。pcr扩增来自26株独立t0植物的基因组dna，使用引物fw-grf4b(5
’‑
cctccgactccaagtattgc-3’)(seq id no:104)和rev-gif1c(5
’‑
atcatcaggttggacgggta-3’)(seq id no:105)，证实了26株t0植物中的23株具有插入基因组dna的grf4-gif1转基因(图3)。转基因植物可育且显示正常表型。不受特定理论约束，这可能是因为内源mir396控制过表达grf4-gif1嵌合体在植物发育后期的水平。
106.实施例2
–
仅用grf4或gif1转化小麦
107.小麦转化实验仅用grf4(seq id no:1)或仅用gif1(seq id no:2)在同一plc41载体中进行，如就grf4-gif1嵌合体所述。也观察到相对于对照的再生效率显著增加(图4和5)。再生效率的增加低于用嵌合grf4-gif1转化实验中观察到的。所有再生植物通过pcr确认为转基因。我们还通过t1植物的qrt-pcr证实了所有再生植物过表达相应的转基因。
108.实施例3
–
仅用grf4或gif1转化其他植物物种或组织
109.在小麦中，grf4-gif1嵌合体使得再生效率显著高于任一单独的2个基因。然而，在其他植物物种或组织转化中，可能这2个基因中的仅一个足以提高再生效率到与用嵌合体转化植物类似的水平。例如，若在特定植物中这些基因中的一个以足够高水平表达，用另一个基因单独转化可能足以在该植物中达到显著更高的再生效率。
110.实施例4
–
从叶外植体的再生
111.生成5个独立gfr4-gif1 t0小麦品系与1个dsred t0对照品系的克隆并培养维持。非常幼嫩的叶片在立体显微镜下无菌解剖，移除外部的1-2轮叶片。移出内部叶片的基部(base of the inner lamina)并置于含有生长素的愈伤组织诱导培养基的平板以诱导愈伤组织形成。14天后，组织传代培养到新鲜愈伤组织诱导培养基。额外21天后，愈伤组织转
移至含有细胞分裂素的芽再生培养基。28天后，对再生芽的愈伤组织数目进行打分。
112.用grf4-gif1嵌合体转化的叶外植体显示再生效率为55％，比用无grf4-gif1嵌合体的构建体转化的叶外植体再生效率高2.8倍(图6)。
113.实施例5
–
在未达最优水平的外源细胞分裂素中的植物再生
114.在常规转化中，首先用农杆菌接种幼胚，随后将其放置于含有不同激素的不同培养基以再生转基因植物。最初，含有生长素的培养基诱导愈伤组织形成。接着，愈伤组织转至含有细胞分裂素的培养基，其促进芽发育(图7a)。有趣的是，观察到用带有小麦grf4-gif1嵌合体(seq id no:5)的农杆菌接种的胚能够在生长素培养基中再生绿芽而不需暴露于细胞分裂素(图7b)。不受任何特定理论约束，此结果的一种可能解释是通过grf4-gif1嵌合体促进内源细胞分裂素生成。此观察结果表明grf4-gif1嵌合体能够促进胚发生和芽再生，而不需加入外源细胞分裂素，这能用作鉴定转基因芽的正选择法，而不使用基于抗生素的标志物。
115.实施例6
–
构建mir396抗性grf
116.图6的结果显示grf4-gif1嵌合体表达增加可改善从小麦叶外植体再生的效率，这指示此方法用于不同植物物种和组织的潜能。然而，在一些植物物种或一些物种的特定组织中，高水平mir396能切割grf rna且可能限制grf蛋白或grf-gif嵌合体高水平表达。
117.为避免此潜在问题，我们生成了修饰的grf基因(单独和在grf-gif嵌合体中，seq id no:34)，其在mir396靶位点中具有沉默突变，使得其对mir396阻遏较不敏感(图8)。拟南芥grf3(seq id no:19)或水稻grf4(seq id no:17)中的mir396结合位点中的突变显示引起grf活性更高且器官尺寸增加(debernardi等,2014；beltramino等,2018；duan等,2015；hu等,2015；che等,2015；sun等.2016；li等.2018)。
118.实施例7
–
用诱导型系统调节表达
119.在小麦中，我们未观察到grf4-gif1嵌合体对植物表型的有害作用，可能是因为内源mir396的存在足以切割转基因表达产生的任意过量grf4。然而，可能在其他种类中，grf-gif嵌合体的存在能够以不需要的方式影响表型。这些影响在用grf变体时可能更显著，所述变体带有mir396靶位点突变，使得其对mir396阻遏不太敏感。
120.用诱导型系统控制此嵌合体在植物中表达和/或活性的能力能够解决此问题。debernardi和palatnik(专利申请wo 2016/098027 al)证明了类似grf-gif嵌合体在拟南芥中的活性可通过在grf-gif中部克隆大鼠糖皮质激素受体(gr)而外源控制。新的grf-gr-gif嵌合体仅在合成激素地塞米松存在下激活。使用此策略，生成grf-gr-gif嵌合体用于葡萄(seq id no:31)和小麦(seq id no:32及seq id no:33)，其能仅在转化培养基中选择性诱导，且不会后续在经转化的t0植物或后代中有活性，防止对植物发育的潜在影响。
121.另外，诱导型系统允许使用过度活跃形式的grf4-gif1嵌合体，而限制对植物发育的潜在影响。例如，在grf的mir396靶位点纳入同义突变会消除mir396介导的嵌合体转录后阻遏，增强其表达且可能甚至其在mir396所表达组织(如叶)中的活性。通过诱导型系统，grf4-gif1嵌合体能仅在再生期间过表达。另一种选择是应用组织特异性启动子。
122.实施例8
–
采用蛋白递送的方法
123.能递送蛋白到植物细胞。靶向诱变在许多植物物种中通过递送crispr/cas9预组装核糖核蛋白复合物(rnp)获得(woo等,2015；subburaj等,2016；malnoy等,2016；kim等,
2017；liang等,2017；svitashev等,2016；wolter等,2017)。前述方法能通过向植物细胞递送grf、gif或grf-gif嵌合蛋白来进行。例如，grf、gif或grf-gif嵌合体能与crispr/cas9 rnp一起递送，以增强经编辑植物细胞的再生。蛋白递送后，植物组织可随后在再生培养基中培养。
124.实施例9
–
用额外载体的转化
125.植物用grf、gif或grf-gif嵌合体转化并获得高再生能力后，来自此植物或其后代的细胞能进一步用于瞬时或稳定转化，采用grf、gif或grf-gif嵌合体以外的载体。植物仍具有高再生能力。植物细胞随后能在细胞分裂素水平正常或降低的再生培养基中培养。
126.实施例10
–
用其他grf和/或gif序列的转化
127.前述方法能用其他grf基因或相关核苷酸序列进行，例如其中所编码的grf蛋白的qlq和wrc结构域的氨基酸序列与小麦蛋白tagrfgrf1(seq id no:9)、tagrf2grf2(seq id no:10)、tagrf3(seq id no:11)、tagrf4(seq id no:12)或tagrf5(seq id no:13)或者拟南芥蛋白atgrf3(seq id no:19)、atgrf4(seq id no:20)、atgrf5(seq id no:21)或atgrf6(seq id no:22)的qlq和wrc结构域的序列至少约70％、约80％、约90％或约95％相同。
128.所述方法还可用grf基因实施，其中qlq和wrc结构域的编码氨基酸序列与前面段落所提供的序列至少约80％相似、约90％相似或约95％相似。
129.相同性和相似性百分比仅用本公开所示蛋白序列中的连接的(concatenated)qlq(下面带下划线)和wrc结构域(下面加粗显示)通过blastp计算。连接的qlq-wrc结构域(seq id no:96)示例如下所示是小麦tagrf4的(完整蛋白序列是seq id no:12)。
130.》tagrf4 traescs6a01g269600
[0131][0132]
5个小麦蛋白中连接的qlq-wrc结构域的成对比较如表1所示。所有成对比较大于70％相同和80％相似，确认其相似性和潜在重叠功能。
[0133]
我们将对来自小麦grf蛋白的qlq-wrc结构域与直系同源水稻(水稻)蛋白的对应结构域之间的比较作为这些蛋白保守的另一示例。所有成对比较显示》70％相同和》80％相似(表2)。这些标准排除亲缘关系远(distantly related)的grf，如osgrfgrf10(loc_os02g45570.1)、osgrfgrf11(loc_os07g28430.1)和osgrfgrf12(loc_os04g48510.1)。
[0134]
作为双子叶植物物种的参考，比较来自最接近的拟南芥grf蛋白序列atgrf3(seq id no:19)、atgrf4(seq id no:20)、atgrf5(seq id no:21)和atgrf6(seq id no:22)的连接的qlq-wrc结构域(表3)。表3显示这些拟南芥蛋白与至少一种小麦grf蛋白至少70％相同或80％相似。在高度分化的双子叶植物与单子叶植物中发现此组蛋白关键结构域之间存在相对高水平的相似性，证明这些蛋白的保守和其功能的潜在重叠。该可能性也由以下观察支持：拟南芥grf3(seq id no:19)或水稻grf4(seq id no:17)的活性更高，这归因于mir396识别位点的突变增加了这2个亲缘关系远的物种的种子尺寸(beltramino等,2018；duan等,2015；hu等,2015；che等,2015；sun等.2016；li等.2018)。
[0135]
表1.本专利包括的5个小麦(小麦)旁系同源蛋白(tagrf)的比较。连接的qlq-wrc保守结构域的相同性百分比(第一数字)和相似性百分比(第二数字)通过blastp获得。
[0136][0137][0138]
表2.本专利包括的5个小麦tagrf蛋白(序列可获自文件结尾处)与最接近的水稻直系同源物(水稻)的比较。连接的qlq-wrc保守结构域的相同性百分比和相似性百分比通过blast p获得。
[0139][0140]
表3.本专利包括的5个小麦tagrf蛋白与最接近的拟南芥(arabidopsis thaliana)直系同源物(atgrf)的比较。连接的qlq-wrc保守结构域的相同性百分比和相似性百分比通过blast p获得。序列可获自文件结尾处。
[0141][0142]
同样，本公开的方法能用其他gif基因或相关核苷酸序序列进行，如其中所编码的gif蛋白snh结构域的氨基酸序列与小麦蛋白tagif1(seq id no:27)、tagif2(seq id no:28)或tagif3(seq id no:29)的snh结构域的序列或者拟南芥蛋白atgif1(seq id no:24)、atgif2(seq id no:25)或atgif3(seq id no:26)至少约70％相同、约80％、约90％或约95％相同。
[0143]
所述方法还可用gif基因进行，其中所编码的snh结构域的氨基酸序列与前面段落所提供的序列至少约80％相似、约90％相似或约95％相似。
[0144]
拟南芥gif1中的突变，也称为angustifolia3(an3)，导致叶片和花瓣更小、更窄，细胞数目下降，与多个grf突变体中所见表型相似(kim和kende 2004；horiguchi等.2005)。单一gif2和gif3突变体与野生型植物相似，表明gif1对叶发育的影响超过其他gif家族成
员(lee等.2009)。然而，双突变体gif1,2or gif1,3和三突变体gif1,2,3的表型更剧烈，指示gif基因具有冗余功能(lee等.2009)。另外，所有3个gif的异位过量表达能回复gif1突变(lee等.2009)。
[0145]
基于上述重叠gif功能，我们预测小麦中的不同gif旁系同源物可对转基因植物再生效率提高有类似效果，其单独或作为与不同grf的蛋白嵌合体。因此，我们将拟南芥蛋白atgif1(seq id no:24)、atgif2(seq id no:25)、atgif3(seq id no:26)以及3个最接近小麦同源蛋白tagif1(seq id no:27)、tagif2(seq id no:28)和tagif3(seq id no:29)纳入此专利，以及显示与保守snh结构域至少70％的相同性或80％的相似性的任何其他植物蛋白，如在此文件结尾处所述的蛋白序列中突出显示的。3个小麦gif蛋白的snh结构域之间的比较显示至少70％的相同性或89％的相似性(表4)。
[0146]
表4.本专利包括的3个小麦(小麦)旁系同源蛋白(tagif)的比较。保守snh结构域的相同性百分比和相似性百分比通过blast p获得。
[0147][0148]
当小麦snh结构域与来自拟南芥的对应snh结构域作比较时，相同性在66％-91％之间变化且相似性在89-96％之间变化(表5)。各拟南芥snh结构域与3个小麦snh结构域中至少一个为至少70％相同或80％相似(表5)。
[0149]
表5.本专利包括的3个小麦tagif蛋白(上述序列)和最接近拟南芥同源物(atgif)的比较。保守snh结构域的相同性百分比和相似性百分比通过blast p获得。
[0150][0151]
实施例11
–
与基因组编辑联用
[0152]
本公开所提供方法可能对与基因组编辑联用是理想的，因为转基因能在编辑事件完成后隔离出来。这消除了grf-gif嵌合体会负面影响植物表型的风险。所公开方法的高转化效率可扩展植物品种列表，该品种受益于crispr筛选以在重要农艺基因的调控和编码区中测试数组突变体。我们确认了用载体jd635(grf4-gif1-grna-geneq)转化的胚的高再生效率(图9a)，所述载体包括grf4-gif1嵌合体、cas9和靶向基因q的grna(图9b)。我们测试了32个来自此转化的愈伤组织并确认其中30个的靶基因编辑(图9c)。
[0153]
实施例12
–
在缺乏选择性标志物的情况下选择转基因植物
[0154]
本文公开的方法可用于避免使用选择性标志物，所述标志物受到不同意应用转基因植物的人的反对。grf4-gif1嵌合体在缺乏细胞分裂素情况下再生的能力证明了仅通过消除或大幅降低细胞分裂素浓度，能从非转基因植物选择转基因植物。图10显示来自图9所示相同jd635构建体(grf4-gif1-cas9-grna-geneq)的愈伤组织，其在没有潮霉素且具有十
gif1克隆用作模板。引物rgrf-fw和rgrf-rev重叠17nt且在mir396靶位点内引入沉默突变。2种pcr片段都进行凝胶纯化，在第二次pcr中用作模板，采用引物fw-grf4/rev-gif1b。引物序列如表6所示。所得产物通过b/p gateway反应克隆于pdonr并转化入化学感受态大肠杆菌dh5α。载体序列通过桑格测序验证。其次，嵌合rgrf4-gif1通过l/r gateway反应克隆于双元载体plc41，其在玉米ubiquitin启动子下，并转化入化学感受态大肠杆菌dh5α。所得载体plc41:rgrf4-gif1通过限制性酶消化证实并电穿孔转化于农杆菌eha105中。塞米松诱导型形式rgrf4-gr-gif1通过重叠pcr产生。
[0161]
为产生jd635-grf4-gif1-cas9-grna-geneq载体，包括玉米ubiquitin启动子、grf4-gif1嵌合体和nos终止子的盒通过pcr扩增。pcr产物进行凝胶纯化，通过in-fusion(宝生物工程株式会社美国公司(takara bio usa,inc.))克隆入含有小麦密码子优化的cas9(tacas9)的pyp25f双元载体asci位点，并转化入化学感受态大肠杆菌dh5α。载体序列通过桑格测序验证。其次，靶向基因q编码区的引导rna构建体通过golden gate反应克隆到载体的2个aari位点，转化入化学感受态大肠杆菌dh5α。所得jd635-grf4-gif1-cas9-grna-geneq载体(seq id no:35)通过桑格测序验证并电穿孔转化于农杆菌eha105中。
[0162]
对照载体：plc41骨架中的jd518载体包含驱动lhg4表达的glossy启动子，其是在小麦中没有靶标的人工转录因子。plc41骨架中的pop:ft1载体包含pop下游克隆的ft1编码序列，其是人工启动子。中的plc41-dsred在plc41骨架含有克隆在玉米ubiquitin启动子下游的dsred编码序列。
[0163]
小麦转化。转基因小麦植物最初用来自日本烟草公司(jt)的技术产生。然而，细胞分裂素浓度在一些后续实验中下降。就各载体进行2次独立实验。各实验中，来自kronos的至少25个幼胚用农杆菌eha105转化，采用前述plc41构建体。转基因植物的选择用潮霉素实施，除非实验中细胞分裂素浓度降低(图10)，其中没有使用潮霉素或任何其他抗生素。再生植物转移至土壤且转基因插入通过dna提取和pcr验证。用于对t0植物基因分型的引物如表6所示。
[0164]
表6.用于克隆和基因分型的引物序列
[0165][0166]
植物生长条件。转基因植物生长于pgr15生长箱(conviron)，该生长箱调至16小时光照(22℃)和8小时黑暗(18℃)。在植物头部高度测量的卤化钠光强度为(～260μm m-2
s-1
)。
[0167]
系统发育分析。来自拟南芥及稻的grf和gif基因的氨基酸序列获自phytozome(phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)。小麦grf和gif基因的氨基酸序列获自小麦基因组refseq v1.0。系统发育分析用mega6进行。
[0168]
实施例13
–
用单一grf4或gif1基因的小麦转化
[0169]
小麦转化实验用grf4-gif1嵌合体(seq id no:5)、grf4(seq id no:1)或gif1(seq id no:2)，单独或在同一构建体内(图18a)实施。14次实验中(表7)，grf4-gif1嵌合体的再生效率(65.8
±
5.3％)比空载体对照(8.7
±
2.0％,p《0.0001,图18b)高》7倍。在5次单独转化实验中(表7)，观察到转化有单独grf4基因(20.4
±
11.4％)或单独gif1基因(17.2
±
6.6％)的胚再生效率显著低于grf4-gif1嵌合体(54.6
±
9.8％,图基p《0.05,图18c)。转化有单个基因的愈伤组织再生效率比对照(6.0
±
3.0％)高约3倍，但图基检验中的差异不显著(图18c)。
[0170]
然后，我们比较了在嵌合体中融合grf4和gif1或两者由单独的ubi启动子于同一构建体分开表达(未融合，seq id no:36)对再生效率的影响(图18a,表7)。在5次不同实验中，分开的grf4和gif1基因的平均再生效率(38.6
±
12.9％)显著低于(p《0.0144)grf4-gif1嵌合体的再生效率(62.6
±
10.3％,图18d)。此结果证明嵌合体中2种蛋白的受迫接近提高了其诱导再生的能力。
[0171]
实施例14
–
用包括其他grf和/或gif序列组合的嵌合体的小麦转化
[0172]
grf和gif基因家族包含数个成员(图19a,b)，其展示出重叠功能和冗余性。因此，我们预期除了grf4和gif1外，其他grf和/或gif也能促进再生。
[0173]
测试来自不同进化枝的grf基因(图19a)，包括与grf4同一进化枝中的grf5(seq id no:13,37)、最接近的进化枝(其包括拟南芥grf5,seq id no:21)中的grfgrf1(seq id no:9,38)、更远进化枝中的grf9(seq id no:39)。8种小麦蛋白中连接的qlq-wrc结构域的成对比较如表8所示，所述蛋白包括此专利中测试的4种。用于grfgrf1-grf6和grf9的所有成对比较为≥70％相同或》80相似，证实其相似性和潜在重叠功能。
[0174]
我们生成了所有选定的grf和gif1的嵌合体(图20a)(seq id no:40-42)，并在kronos中测试转化频率。由包括与gif1融合的密切相关的grf4和grf5基因的嵌合体诱导的再生效率显著高于包括与gif1融合的关系更远的grfgrf1和grf9基因的嵌合体所观察到的再生效率(对比p＝0.0368,图20b)。有趣的是，包括grfgrf1和grf9的嵌合体显示再生频率高于对照，但差异不显著(表7)。因此，来自不同进化枝的grf能促进再生，但来自grf4-进化枝的grf似乎再生活性更高。
[0175]
接着，通过产生与grf4的嵌合体(图20c)，我们比较了系统树中包括的3个小麦gif基因的活性(图19b)。如同gif1，含有gif2(seq id no:28、43、45)和gif3(seq id no:29、44、46)的嵌合体相较于用空载体转化的愈伤组织，再生频率也增加(图20d、表7)。然而，grf4-gif1组合产生的再生效率高于grf4-gif2和grf4-gif3组合(对比p＝0.0046)，所有3个嵌合体显示再生效率高于对照(图基检验p《0.05)。
[0176]
实施例15.grf4-gif1改进再生效率低或难培养的小麦和黑小麦品种的转化
[0177]
我们随后测试grf4-gif1嵌合体从商业硬质小麦、面包小麦和黑小麦品系产生转基因植物的潜能，所述品系先前不适应农杆菌介导或在ucd植物转化设施中的再生效率低(图21)。采用grf4-gif1嵌合体观察到四倍体小麦良种系desert king(63.0
±
17.0％vs.2.5
±
2.5％)和六倍体小麦fielder(54.0
±
4.0％vs.2.5
±
2.5％)的再生频率相对于对照增加。对于之前都无法生成转基因植物的六倍体小麦品种hahn和cadenza以及黑小麦繁育系uc3190，观察到grf4-gif1嵌合体的再生频率为9-19％，相比之下对照为0％(图21和表9a、b)。
[0178]
实施例16.小麦grf4-gif1改进水稻品种kitaake的转化
[0179]
我们还在水稻品种kitaake中测试了小麦grf4-gif1嵌合体。我们在2次独立转化实验中观察到，用小麦grf4-gif1嵌合体转化的愈伤组织中水稻再生效率(平均40.1
±
5.4％)相较于用对照载体转化的那些(17.6
±
5.9％,表9c)增加2-3倍。这些结果表明小麦grf4-gif1嵌合体对在另一农艺上重要的单子叶植物物种中提高再生有效。
[0180]
实施例17-用诱导型系统调节表达
[0181]
通过在grf4-gif1中间克隆大鼠糖皮质激素受体(gr)，我们生成了诱导型形式的小麦嵌合体grf4-gif1(seq id no:32、33)(图22a)。此嵌合体仅在合成激素地塞米松(dex)存在下激活。来自kronos的幼胚用此载体转化，然后接种于常规转化培养基或补充有10μm dex的培养基。没有dex时，我们从23个胚回收了1个芽，而存在dex时，从24个胚回收了4个芽(图22b)。此结果表明grf-gr-gif嵌合体具有功能且可通过加入dex而外源控制。
[0182]
实施例18-无外源细胞分裂素的转基因植物再生
[0183]
在许多植物转化系统中，再生芽需要细胞分裂素(图23a)。有趣的是，观察到接种了用小麦grf4-gif1嵌合体转化农杆菌的胚能够在没有细胞分裂素的生长素培养基中快速再生出绿芽(图23b)。随后，在没有细胞分裂素和潮霉素情况下，测试来自稳定grf4-gif1转
基因(n＝27)和非转基因(n＝26)t1姊妹系的幼胚再生效率。这些条件下，grf4-gif1转基因植物的再生效率(77.8％)显著高于非转基因姊妹系(11.5％，图24)。这些结果表明grf4-gif1嵌合体在未加入外源细胞分裂素的情况下能促进胚发生和芽再生。
[0184]
基于先前结果，我们开发了在生长素培养基中选择转基因芽的操作，不需要使用基于抗生素的标志物。我们在3次实验中用grf4-gif1无标志物载体(seq id no:47)回收了40个芽，用空载体回收了15个。基因分型显示40个grf4-gif1芽中的10个(25％)是转基因，而没有对照是阳性的(图23c)。这些过表达grf4-gif1嵌合体而不用选择标志物的高再生转基因植物能用于未来的转化实验，以使用选择性标志物纳入其他基因。此策略产生分开的插入位点用于grf4-gif1和第二转基因，这有利于在下一代中分离grf4-gif1插入。
[0185]
实施例19.grf4-gif1加速小麦转化
[0186]
小麦grf4-gif1嵌合体加速再生过程，这允许我们开发更快的小麦转化方案，就此手稿所示全部小麦实验所需的时间而言为56天，而不需91天(图25)。
[0187]
实施例20-grf-gif提高双子叶植物物种的转化
[0188]
我们进行一系列柑橘转化实验以测试grf-gif技术在再生效率有限的双子叶作物中的作用。在2个物种中生成异源柑橘(seq id no:48)和葡萄(seq id no:6-8)grf4-gif1嵌合体，使用与小麦grf4(柑橘ciclev10032065m和葡萄gsvivt01024326001)及gif1(柑橘ciclev10022144m和葡萄gsvivt01036262001)最接近的同源物(图19a和b)。在香椽砧木carrizo的3次独立转化实验中，上胚轴用柑橘和葡萄grf4-gif1嵌合体转化。用柑橘grf4-gif1嵌合体转化的上胚轴显示再生效率相对于转化有空载体对照的那些增加4.8倍(图26a和表10)。异源的葡萄grf4-gif1嵌合体产生的柑橘再生效率提高类似柑橘嵌合体(图26b和表10)。
[0189]
我们还测试了抗mir396的葡萄grf4-gif1形式的效果(此后，rgrf4-gif1，seq id no:50)，其中在用于mir396的grf结合位点引入沉默突变以避免切割(图26b-c)。在3次独立实验中，观察到葡萄rgrf4-gif1嵌合体产生最高频率的转基因事件(相较于对照增加8.4倍,p《0.05)。比较对照vs.3个组合grf-gif构建体的统计分析也是显著的(p＝0.0153,图26d和表10)。尽管其再生频率较高，rgrf-gif构建体需要额外优化(如诱导型系统)，因为一些转基因事件生成了无法产生芽的巨大愈伤组织。
[0190]
我们在葡萄转化中测试葡萄rgrf41-gif1嵌合体。葡萄转化方法缓慢且很费力，需要8-12个月来产生转基因植物品系。产生自未成熟花中花药花丝的前胚发生(pro-embryogenic)愈伤组织用携带空载体和rgrf4-gif1载体的农杆菌接种。培养6个月后，观察到87％用rgrf4-gif1转化的愈伤组织再生出芽，而仅12％对照愈伤组织生成芽(图27)。有趣的是，与柑橘rgrf4-gif1转基因不同，所有葡萄rgrf4-gif1发育出生成叶的芽。
[0191]
然后，我们在甜椒(番椒)转化中测试grf-gif技术，使用栽培品种“r&c cayenne”。在番椒中，有2个接近的grf4旁系同源物，命名为grf4.1和grf4.2，以及2个接近的gif1旁系同源物，在此命名为gif1.1和gif1.2。我们在构建grf4.1-gif1.1嵌合体(seq id no:138-139)中使用了grf4.1(loc107869915)和gif1.1(loc107870303)旁系同源物，该嵌合体克隆入携带bar选择的双元载体pearleygate100。对于转化实验，使用靠近茎尖的子叶基部，叶柄仍附着。用甜椒grf4.1-gif1.1嵌合体转化的40个子叶块显示再生效率为23.8％，比用空载体pearleygate100转化的子叶块再生效率高4.76倍(5.0％再生效率,表11,图28)。
[0192]
用于实施例13-20的方法。
[0193]
方法1.用于转化实验的载体。
[0194]
小麦载体。为产生表达grf4和grfgrf1但未融合的载体(ubi::grf4-term ubi::gif1-term,seq id no:36)，完整ubi::grf4-term盒通过pcr扩增，plc41:grf4(seq id no:1)用作模板，采用引物
[0195]
fw_hindiii gccactcagcaagctttgcagcgt(seq id no:119)和
[0196]
rev-hindiii tcacgctgcaaagctctaattcccgatctagtaac(seq id no:120)。我们在pgemt-easy中克隆pcr片段并将ubi::grf4-term片段次克隆到plc41:gif1(seq id no:2)的hindiii位点。
[0197]
为产生不同小麦grf-gif嵌合体，grfgrf1(seq id no:38)、grf5(seq id no:37)、grf9(seq id no:39)、gif2(seq id no:43)和gif3(seq id no:44)的编码序列通过基因合成获得。然后，不同嵌合体(grfgrf1-gif1、grf5-gif1、grf9-gif1、grf4-gif2、grf4-gif3)通过重叠pcr产生，遵循的策略与就产生grf4-gif1所述相同。在plc41载体中通过l/r反应克隆所有嵌合体并通过限制性酶消化确认载体，电穿孔转化于农杆菌菌株eha105中。
[0198]
我们通过基因合成和pdonr中克隆来产生柑橘grf4-gif1嵌合体(seq id no:48)。经桑格测序检查序列后，我们将其通过l/r反应克隆入pgwb14双元载体，其在病毒35s启动子下，并转化入化学感受态大肠杆菌dh5α。我们通过限制性酶消化证实所得载体pgwb14-柑橘grf4-gif1(dna,seq id no:49)并电穿孔转化于农杆菌eha105中。
[0199]
我们通过重叠pcr产生抗mir396形式的葡萄grf4-gif1(rgrf4-gif1)。实施2次pcr反应，采用引物
[0200]
fw-grf ggggacaagtttgtacaaaaaagctgccaccatgaagcaaagctttgtgg(seq id no:121)
[0201]
/rgrf-rev tcgaccggttttctagaacggttgcgg(seq id no:122)和
[0202]
rgrf-fw tctagaaaaccggtcgaatcacaaacta(seq id no:123
[0203]
/rev-gif
[0204]
ggggaccactttgtacaagaaagctgaacgtcaattcccatcttcagca(seq id no:124)使用pgbw14-葡萄grf4-gif1克隆作为模板(seq id no:8)。引物rgrf-fw和rgrf-rev重叠17个核苷酸且在mir396靶位点引入沉默突变(图26c)。pcr片段进行凝胶纯化并在第二次pcr中用作模板，引物为fw-grf/rev-gif。在pdonr中通过b/p gateway反应克隆所得产物。接着，我们通过l/r gateway反应将嵌合rgrf4-gif1克隆于双元载体pgwb14，其在病毒35s启动子下。所得载体在农杆菌eha105中通过电穿孔转化。
[0205]
我们通过基因合成产生甜椒grf4.1-gif1.1嵌合体(seq id:no:140)，并将其克隆入双元载体pearleygate100，其在35s启动子下。pearleygate100具有bar选择标志物。我们将该构建体，命名为pth1903，通过电穿孔转化于农杆菌eha105中。作为对照，我们使用了孔载体pearleygate100。
[0206]
植物转化
[0207]
方法2.小麦转化方案。小麦转化遵循先前发表的方案。简言之，在生长箱中以长日照光周期(16小时的380μm m-2
s-1
光照,26℃白天和18℃晚上)培养不同小麦和黑小麦栽培品种。开花后约2周从穗收获未成熟谷粒，70％乙醇中1分钟，然后在1.2％(v/v)次氯酸钠溶
液加5μl吐温(tween)中10分钟进行表面消毒。表面消毒后，无菌水洗涤种子3次，立体显微镜下分离幼胚。
[0208]
我们离心液体培养基中的分离的幼胚，随后用农杆菌接种。胚以盾片朝上转移至共培养培养基并在23℃避光温育。2-3天后，切除胚轴并移至无选择的愈伤组织诱导培养基，我们将其在所述培养基上25℃避光温育。5天后，胚转移至有30mg/l潮霉素的选择培养基，25℃避光温育。
[0209]
3周后，我们将愈伤组织转移至含有100mg/l潮霉素的选择培养基。另外3周后，我们将正在增殖的组织转移至含有50mg/l潮霉素的再生培养基，连续光照(30μm m-2
s-1
)下25℃温育2周。将再生芽转移至含有50mg/l潮霉素的生根培养基。生根的植物如下适应土壤：将其转移至含有36个片插入物(sheet insert)的1020托盘，填充有sunshine盆栽混合土并覆盖有11x 21x 2英寸透明塑料圆顶，在16小时100μm光照和26℃下持续10天。近期，我们开发了一个更短的转化操作以产生grf4-gif1转基因小麦植物，如图25所概括。
[0210]
方法3.水稻转化方案。水稻转化遵循先前发表的方案(ishida等.2015,第12届国际小麦遗传会议论文集(proc.12
th int.wheat genet.symp.)167-173)。简言之，我们选择新鲜稻种，将其脱壳，在含有20％(v/v)漂白剂的旋转瓶中表面消毒30分钟。随后，种子用无菌水冲洗3次。将约25-50粒种子/平板置于愈伤组织诱导培养基(msd，有维生素的1x murashige and skoog培养基，含有30g/l蔗糖、2mg/l 2,4-二氯苯氧基乙酸、1.2％(w/v)琼脂，ph 5.6-5.8)，而不让胚碰到培养基，用医用胶带包裹平板，在16小时光照/8小时黑暗，28℃下。10-14天后，我们将愈伤组织与萌发种子的其他部分分离，转移至新鲜msd琼脂板，共培养前再持续5天。
[0211]
农杆菌培养：我们从分离自平板的单一菌落中制备甘油冷冻储液。然后，接种含有适当抗生素的1ml lb以维持农杆菌和质粒，28℃,250rpm温育过夜。第二天，将300μl农杆菌培养物接入含适当抗生素和200μm乙酰丁香酮的20ml ty(ph 5.5)。培养物在振荡培养箱中28℃,250rpm温育，直至培养物的od
600
达到0.1-0.2(约2-4小时)。
[0212]
转化和共培养：我们将愈伤组织置于农杆菌悬液30分钟，摇晃悬液以确保对愈伤组织可及性一致。振荡温育后，在无菌沃特曼纸上干燥愈伤组织以去除过量细菌悬液。我们将愈伤组织转移到共培养培养基(msd+s+as，有维生素的1x murashige and skoog培养基，含有30g/l蔗糖、5％山梨醇、2mg/l 2,4-二氯苯氧基乙酸、200μm乙酰丁香酮、1.6％(w/v)琼脂，ph 5.6-5.8)上并在22℃避光温育3天。
[0213]
选择：将共培养的愈伤组织转移至选择培养基(msd+ch+ppm，有维生素的1xmurashige and skoog培养基，含有30g/l蔗糖、2mg/l 2,4-二氯苯氧基乙酸、400mg/l羧苄青霉素、200mg/l特美汀、1ml/l植物防腐混合物、80mg/l潮霉素、1.2％琼脂，ph5.6-5.8)，在连续光照下28℃温育平板。我们将这些愈伤组织在新鲜选择培养基上每8-9天继代培养。
[0214]
再生和生根：在选择培养基上4-5周后，约2-5mm宽的耐受性微愈伤组织开始出现。我们将这些从初始愈伤组织中挑去并转移到皮氏培养皿，采用再生培养基(bn+s+ch，有维生素的1x murashige and skoog培养基，含有30g/l蔗糖、5％山梨醇、3mg/lbap、0.5mg/l naa、400mg/l羧苄青霉素、200mg/l特美汀、1ml/l植物防腐混合物、50mg/l潮霉素、1.6％(w/v)琼脂，ph 5.6-5.8)，并在连续光照下28℃温育。这些愈伤组织在新鲜选择培养基上每8-9天继代培养。4-5周后，当愈伤组织开始变绿时，再生植物转移到生根培养基(ms+h，有维生
素的1x murashige and skoog培养基，含有50mg/l潮霉素、1.2％(w/v)琼脂，ph 5.6-5.)，并在16小时光照/8小时黑暗下28℃温育。当根发育良好时，我们将植物转移至土壤。
[0215]
方法4.柑橘转化操作。我们将carrizo枳橙砧木的种子置于水中以吸水且随后剥去种皮，确保不移除珠被。种子在0.6％(v/v)次氯酸钠溶液加5μl吐温20中表面消毒，这是通过将其置于50ml离心管并在100rpms振荡20分钟进行的。用150-200ml无菌蒸馏水冲洗种子3x。我们将种子置于琼脂固化的1/2x murashige and skoog基本有机培养基(1/2x mso)，所述培养基含有15g/l蔗糖、7gm tc琼脂(ph 5.6-5.8)，将种子轻轻推入培养基以更均一地发芽。26℃避光温育。
[0216]
农杆菌培养：我们从分离自平板的单一菌落制备甘油冷冻储液。然后，我们使用40μl储液接种含有适当抗生素的20ml mgl培养基(ph 7.0)从而维持农杆菌和质粒，28℃，250rpm温育过夜。第二天，移出5ml过夜生长物并转移至含有适当抗生素和200μm乙酰丁香酮的15ml ty培养基(ph 5.5)。我们将过夜培养物在28℃,250rpm温育过夜，接着将生长于ty培养基的过夜培养物稀释到o.d
600nm
0.1-0.2。
[0217]
共培养：我们收集2-5周龄的黄化上胚轴并置于皮氏培养皿，该培养皿含有10ml如上所制备的农杆菌溶液(0.1-0.2od
600
)。将上胚轴浸入0.5cm切片且浸泡10分钟。我们将上胚轴切片转移到由以下组成的共培养培养基：murashige and skoog基本有机培养基(mso)，用30g/l蔗糖、3.0mg/l bap、0.1mg/l naa和200-μm乙酰丁香酮改良(modified)，ph 5.6-5.8。23℃避光温育。
[0218]
诱导：2-3天后，将上胚轴块转移至诱导培养基，其由用30g/l蔗糖、3.0mg/l bap、0.1mg/l naa、400mg/l羧苄青霉素、150mg/l特美汀和100mg/l硫酸卡那霉素改良的mso组成，避光温育。10天后，我们将上胚轴切片在配制相同的新鲜培养基中继代培养，接着每21天继代培养。避光下第二个21天周期后，培养物转移至30μm光照和16小时光照/8小时黑暗的光周期。每21天继续转移到相同培养基的新鲜培养基，直至器官性的分化芽在切割末端发育。
[0219]
伸长：芽开始形成后，我们将正在发育的芽转移至由用30g/l蔗糖、0.1mg/l ba、400mg/l羧苄青霉素、150mg/l特美汀和100mg/l硫酸卡那霉素改良的mso组成的伸长培养基。我们将培养物如上温育且每21天按需继代培养，直至芽伸长。
[0220]
生根：芽达到2-4cm高度后，收获芽并将其转移至由用30g/l蔗糖、5mg/l naa、250mg/l头孢噻肟和100mg/l卡那霉素改良的mso组成的生根培养基。3-5天后，我们将芽转移至用30g/l蔗糖、0.0mg/l naa,400mg/l羧苄青霉素和100mg/l卡那霉素改良mso。芽在14天内开始生根。
[0221]
方法5.葡萄转化方案。为产生转基因葡萄(汤姆逊无核)，我们将体细胞胚转移至5ml液体lloyd and mccown wpm，其补充有20g/l蔗糖、1g/l酪蛋白、1mm mes、500mg/l活性炭、0.5mg/l bap、0.1mg/l naa、200μm乙酰丁香酮和12.5μl pluronic f68。我们通过把管置于45℃浴10分钟，对胚进行热激。
[0222]
我们向溶液加入农杆菌至od 0.1-0.2，随后将胚转移到含有7mm沃特曼滤纸片的空100x20mm皮氏培养皿。用石蜡膜包裹皮氏培养皿，23℃避光温育。2-3天后，收获胚并将其转移至wpm选择培养基。我们将所述培养基补充了20g/l蔗糖、1g/l酪蛋白、1mm mes、500mg/l活性炭、0.5mg/l bap、0.1mg/l naa、400mg/l羧苄青霉素、150mg/l特美汀、200mg/l卡那霉
素(或25mg/l潮霉素)、50g/山梨醇、14g/l琼脂和4ml植物防腐混合物(ppm)。
[0223]
我们将胚在26℃避光温育，7天后，我们将胚在配制相同的新鲜培养基中继代培养。14和28天后，我们将胚在新鲜培养基中继代培养。额外14天后，我们将胚转移到相同的wpm补充培养基，但没有山梨醇而有8g/l琼脂。我们在平板上将胚分成独立簇，16小时光照，26℃下温育，每2-3周继代培养。我们每14-21天持续继代培养，直至植物形成。
[0224]
为收获正在形成的(germinating)植物，切割根并将芽置于补充了30g/l蔗糖、0.01mg/l iba、150mg/l特美汀、400mg/l羧苄青霉素和100mg/l卡那霉素(或25mg/l潮霉素)的wpm上。芽生根后，我们将其转移至含有湿润土壤(1份sunshine混合物2份蛭石)的2英寸盆，并将盆置于密封的密保诺保鲜袋7天。在16小时100μm m-2s-1光照，26℃下温育，用塑料圆顶盖住苗床(flat)。1周后，打开密保诺保鲜袋以降低湿度。如果新的生长明显，从密保诺保鲜袋中移出植物且圆顶下再放置7天以完成环境适应。
[0225]
方法6.甜椒转化操作。
[0226]
我们将番椒栽培品种“r&c cayenne”种子在含5μl吐温20的1.2％(v/v)次氯酸钠溶液中表面消毒。种子在定轨摇床上100rpms搅拌20m，然后在150-200ml无菌蒸馏水中冲洗一次。将其转移至琼脂固化的1/2强度murashige and skoog基本有机培养基(1/2xmso)，所述培养基补充了16g/l葡萄糖、600mg/l mes、8gm phytoagar(plantmedia产品目录号40100072-4)(ph 5.6-5.8)。种子在16小时光周期和30μm m2 s-1光照，26℃下温育。
[0227]
10天后，我们将幼苗置于调整到o.d.600 0.1-0.2的根癌农杆菌(菌株eha 105)溶液。幼苗浸没在农杆菌溶液中时，我们将子叶顶端的2/3去除，随后从幼苗仔细去除子叶保留子叶的叶柄而不是顶端分生组织。5分钟后，将外植体转移入含有共培养培养基的100x20mm皮氏培养皿，所述培养基由用16g/l葡萄糖、600mg/l mes、10mg/l苄氨基嘌呤(bap)、1.0mg/l吲哚-3-乙酸(iaa)和200μm乙酰丁香酮改良的mso培养基组成，ph 5.6-5.8。我们将组织在23℃避光温育。
[0228]
2-3天后，我们将子叶块转移至由补充了16g/l葡萄糖、600mg/l mes、10mg/l bap、1.0mg/l iaa、300mg/l特美汀、400mg/l羧苄青霉素、8mg/l草铵膦(西格玛奥德里奇(sigma-aldrich)产品目录号45520)mso培养基组成的诱导培养基。10天后，我们将子叶在新鲜培养基中继代培养，接着每21天继代培养。
[0229]
幼芽(bud)开始形成后，我们将正在发育的幼芽转移到伸长培养基。此培养基由driver和kuniyaki walnut(dkw)培养基组成，补充了30g/l葡萄糖、1.3g/l ca葡糖酸盐、2.0mg/l meta-topolin(mt)、10mg/l赤霉酸(ga3)、2ml/l硫代硫酸银储液(sts)(1.0ml 100mg/ml agno3储液，加入1.0ml 12mm(95mg/50ml水储液)、300mg/l特美汀、400mg/l羧苄青霉素、4ml/l ppm和8mg/l草铵膦。
[0230]
随着芽开始从幼芽发育，我们将其转移到由补充了30g/l葡萄糖、1.3g/l ca葡糖酸盐、0.5mg/l mt、10mg/l ga3、2.0ml/l sts、300mg/l特美汀、400mg/l羧苄青霉素、4ml/l ppm和8mg/l草铵膦的dkw组成的伸长培养基。如上所述温育，每14天转移至新鲜培养基。我们在每次继代培养去除芽基部的任何正在发育的愈伤组织(图28)。
[0231]
连续2次14天继代培养后，将伸长的芽转移到补充了30g/l葡萄糖、1.3g/l ca葡糖酸盐、0.1mg/l mt、10mg/l ga3、1.0ml/l sts、300mg/l特美汀、400mg/l羧苄青霉素、4ml/l ppm和8mg/l草铵膦的dkw培养基，所述培养基。当芽达到2-3cm尺寸时，将其转移到由补充了
30g/l蔗糖、0.1mg/l naa、2ml/l sts、300mg/l特美汀400mg/l羧苄青霉素4ml/l ppm和4g/l草铵膦的dkw培养基组成的生根培养基。
[0232]
表7.在四倍体小麦kronos中，不同grf-gif组合相较于空载体的再生频率(17次实验)。接种了各特定构建体的胚数(n)/基因型。再生频率估计为显示至少一个再生芽的愈伤组织数目/接种的胚的总数。这是一个保守估计，因为从用grf4-gif1构建体转化的胚中生成的愈伤组织通常产生多个独立转化芽。蓝色“x”指示不同图所示纳入统计分析的实验。此表中的所有实验用常规91d方案完成。
[0233][0234]
表8.比较8个小麦(小麦)旁系同源蛋白(tagrf)。连接的qlq-wrc保守结构域的相同性百分比(第一个数)和相似性百分比(第二个数)通过blast p获得。
[0235][0236][0237]
用于比较的序列(qlq带下划线,wrc以粗体显示)
[0238]
》traescs6a01g335900tagrfgrf1
[0239][0240]
》traescs7a01g165600tagrf2grf2
[0241][0242]
》traescs6a01g269600tagrf4
[0243][0244]
》traescs2a01g435100tagrf3
[0245][0246]
》traescs7a01g049100tagrf5
[0247][0248]
》traescs4a01g291500tagrf9
[0249][0250]
》traescs4a01g255000tagrf6
[0251][0252]
》traescs6a01g257600tagrfgrf12
[0253][0254]
表9.用小麦grf4-gif1嵌合体或空载体转化的植物的再生频率。a)四倍体和六倍体小麦商业品种。b)黑小麦育种品系和c)水稻栽培品种kitaake。在所有实验中，使用plc41载体(对于小麦优化)，除了第二次水稻实验，其中采用更常用于水稻的pcambia1300载体。eha105和agl1是用于渗入的2个不同农杆菌菌株(这2个菌株之间没有观察到差异)。在接种胚数(n)中，第一个数字指示用空载体接种的那些，第二个数字指示用grf4-gif1嵌合体接种的胚。
[0255]
9a.小麦
[0256][0257][0258]
[0259][0260][0261]
9b.黑小麦
[0262][0263]
9c.水稻。水稻(水稻)栽培品种kitaake的再生频率。2个实验都用农杆菌菌株eha105进行。第一次实验使用小麦-优化的载体plc41，实验2-4使用水稻-优化的载体pcambia1300载体。接种愈伤组织中的第一个数字代表用空载体接种的愈伤组织，第二个数字代表用grf4-gif1嵌合体接种的愈伤组织。实验2-4是用同一种子储液(各100个胚)实施的3次实验。实验2包括ubi::grf4-gif1嵌合体和靶向编码酪氨酸蛋白磺基转移酶(tpst)的基因oskitaake06g041700的sgrna，实验3和4包括pcambia1300-gus，而没有嵌合体。
[0264][0265]
表10.柑橘的再生频率。实验1-3使用基于柑橘序列的grf4-gif1嵌合体，而实验4-6使用基于葡萄序列的grf4-gif1嵌合体。最后3次实验包括第二葡萄构建体，其有mir396结合位点(rgrf4-gif1)中的突变，阻碍其切割。接种愈伤组织中的第一个数字代表用空载体接种的愈伤组织，其他数字代表用不同grf4-gif1嵌合体接种的愈伤组织。
[0266][0267]
表11.番椒的再生频率
[0268]
栽培品种r&c cayenne(实验号201027/201028)，用嵌合体grf4.1-gif1.1(seq id no:140)转化40个子叶块，用空载体pearleygate100转化40个子叶块。在接种外植体数(n)中，第一个数字指示用空载体接种的那些，第二个数字指示用grf4.1-gif1.1嵌合体接种的胚。
[0269][0270]
序列标识列表
[0271]
seq id no:
[0272]
1:全载体plc41，具有tagrf4核苷酸序列
[0273]
2:全载体plc41，具有tagif1核苷酸序列
[0274]
3:tagrf4-gif1嵌合体核苷酸序列
[0275]
4:tagrf4-gif1氨基酸序列
[0276]
5:全构建体plc41小麦grf4-gif1嵌合体
[0277]
6:葡萄grf4-gif1嵌合体核苷酸序列
[0278]
7:葡萄grf4-gif1嵌合体蛋白序列
[0279]
8:全构建体pgwb14，具有葡萄grf4-gif1嵌合体
[0280]
9:tagrfgrf1氨基酸序列
[0281]
10:tagrf2grf2氨基酸序列
[0282]
11:tagrf3氨基酸序列
[0283]
12:tagrf4氨基酸序列
[0284]
13:tagrf5氨基酸序列
[0285]
14:osgrfgrf1氨基酸序列
[0286]
15:osgrf2grf2氨基酸序列
[0287]
16:osgrf3氨基酸序列
[0288]
17:osgrf4氨基酸序列
[0289]
18:osgrf5氨基酸序列
[0290]
19:atgrf3氨基酸序列
[0291]
20:atgrf4氨基酸序列
[0292]
21:atgrf5氨基酸序列
[0293]
22:atgrf6氨基酸序列
[0294]
23:用于嵌合体的葡萄grf4(svivt01024326001)
[0295]
24:atgif1氨基酸序列
[0296]
25:atgif2氨基酸序列
[0297]
26:atgif3氨基酸序列
[0298]
27:tagif1氨基酸序列
[0299]
28:tagif2氨基酸序列
[0300]
29:tagif3氨基酸序列
[0301]
30:葡萄gif1(gsvivt01036262001)
[0302]
31:地塞米松诱导型嵌合体葡萄grf4-gr-gif1蛋白
[0303]
32:地塞米松诱导型tagrf4-gr-gif1
[0304]
33:plc41全载体，带有小麦grf4-gr-gif1嵌合体
[0305]
34:小麦rgrf4-gif1，带有mir396靶位点中的4个突变
[0306]
35:全构建体jd635，带有小麦grf4-gif1嵌合体
[0307]
36:全构建体plc41，带有分开的ubi::grf4-ubi::gif1
[0308]
37:tagrf5
[0309]
38:tagrfgrf1
[0310]
39:tagrf9
[0311]
40:tagrfgrf1-gif1
[0312]
41:tagrf5-gif1
[0313]
42:tagrf9-gif1
[0314]
43:tagif2
[0315]
44:tagif3
[0316]
45:tagrf4-gif2
[0317]
46:tagrf4-gif3
[0318]
47:全载体plc41，无标志物，带有小麦grf4-gif1嵌合体48:柑橘grf4-gif1
[0319]
49:全pgwb14构建体，带有柑橘grf4-gif1
[0320]
50:葡萄rgrf4-gif1 mir396抗性嵌合体
[0321]
51tagrf4核苷酸序列
–
来自seq id no:1载体
[0322]
52tagif1核苷酸序列
–
来自seq id no:2载体
[0323]
53野生型mir396靶位点
[0324]
54:带有沉默突变的mir396靶位点
[0325]
55:成熟mir396序列
[0326]
56:图8的蛋白序列
[0327]
57:plc41的lb
[0328]
58:plc41的rb
[0329]
59:玉米ubiquitin启动子
[0330]
60:ha标签
[0331]
61:nos终止子
[0332]
62:35s启动子
[0333]
63:hpt
[0334]
64:来自seq id no:35的tacas9
[0335]
65:来自seq id no:35的tau6启动子
[0336]
66:来自seq id no:35的引导rna基因q
[0337]
67:来自seq id no:35的引导rna支架
[0338]
68:图9b中的序列
[0339]
69:来自seq id no:9的qlq结构域
[0340]
70:来自seq id no:10的qlq结构域
[0341]
71:来自seq id no:11的qlq结构域
[0342]
72:来自seq id no:12的qlq结构域
[0343]
73:来自seq id no:13的qlq结构域
[0344]
74:来自seq id no:14的qlq结构域
[0345]
75:来自seq id no:15的qlq结构域
[0346]
76:来自seq id no:16的qlq结构域
[0347]
77:来自seq id no:17的qlq结构域
[0348]
78:来自seq id no:18的qlq结构域
[0349]
79:来自seq id no:19的qlq结构域
[0350]
80:来自seq id no:20的qlq结构域
[0351]
81:来自seq id no:21的qlq结构域
[0352]
82:来自seq id no:22的qlq结构域
[0353]
83:来自seq id no:23的qlq结构域
[0354]
84:来自seq id no:9的wrc结构域
[0355]
85:来自seq id no:10的wrc结构域
[0356]
86:来自seq id no:11的wrc结构域
[0357]
87:来自seq id no:12的wrc结构域
[0358]
88:来自seq id no:13的wrc结构域
[0359]
89:来自seq id no:15的wrc结构域
[0360]
90:来自seq id no:16的wrc结构域
[0361]
91:来自seq id no:19的wrc结构域
[0362]
92:来自seq id no:20的wrc结构域
[0363]
93:来自seq id no:21的wrc结构域
[0364]
94:来自seq id no:22的wrc结构域
[0365]
95:来自seq id no:23的wrc结构域
[0366]
96:小麦tagrf4的连接的qlq-wrc结构域(完整蛋白序列是seq id no:12):
[0367]
97:来自seq id no:24的snh结构域
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