技术特征：
1.一种组合物，其包含用于与核酸分子一起形成侵入性切割结构的寡核苷酸5'发夹报告基因，所述侵入性切割结构具有靶切割位点，所述5'发夹报告基因包含5'发夹形成区、下游双链茎以及与所述核酸分子的3'末端部分互补的3'部分，其中所述核酸分子的所述3'末端部分退火到所述5'发夹报告基因的所述3'部分上，形成侵入性切割结构的上游双链体。2.如权利要求1所述的组合物，其中所述侵入性切割结构可在所述靶切割位点被mg
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瓣测定缓冲液中的afu fen-1切割。3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述靶切割位点位于所述5'发夹报告基因的所述下游双链茎中。4.如权利要求1至3中任一项所述的组合物，其中所述下游双链茎是包含环的发夹茎。5.如权利要求1至4中任一项所述的组合物，其还包含核酸分子，所述核酸分子包含与所述5'发夹报告基因的所述3'部分互补的3'末端部分。6.如权利要求1至5中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹报告基因包含fret标记系统。7.如权利要求6所述的组合物，其中fret标记系统的第一成员附接在所述5'发夹报告基因上的第一位置，并且fret标记系统的第二成员附接在所述5'发夹报告基因上的第二位置，其中所述靶切割位点在所述第一位置与所述第二位置之间。8.如权利要求7所述的组合物，其中所述第一位置和所述第二位置沿所述5'发夹报告基因的长度间隔不超过20个寡核苷酸，优选不超过10个寡核苷酸，更优选不超过9、8、7、6、5、4或3个寡核苷酸。9.如权利要求1至8中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹报告基因还包含3'阻断剂。10.如权利要求9所述的组合物，其中所述3'阻断剂选自3'胺、3'磷酸酯、3'生物素、3'己二醇和3'双脱氧核苷酸。11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其还包含有包含阳离子的缓冲溶液。12.如权利要求11所述的组合物，其中所述包含阳离子的缓冲溶液是mg
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瓣测定缓冲液。13.如权利要求1至12中任一项所述的组合物，其还包含瓣状核酸内切酶。14.如权利要求13所述的组合物，其中所述瓣状核酸内切酶包含fen-1核酸内切酶，优选热稳定fen-1核酸内切酶，更优选来自古细菌生物体的热稳定fen-1核酸内切酶。15.如权利要求12所述的组合物，其中所述fen-1核酸内切酶包含afu fen-1、ave fen-1和pfu fen-1中的一种或多种。16.如权利要求1至15中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种pcr-瓣测定试剂。17.如权利要求16所述的组合物，其中所述pcr-瓣测定试剂包含以下中的一种或多种：-dna聚合酶；-脱氧核苷三磷酸；-瓣状寡核苷酸；-引物。18.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其还包含靶核酸。19.一种方法，其包括：
i)提供a)用于与核酸分子一起形成侵入性切割结构的寡核苷酸5'发夹报告基因，所述侵入性切割结构具有靶切割位点；和b)核酸分子；其中所述5'发夹报告基因包含5'发夹形成区、下游双链茎以及与所述核酸分子的3'末端部分互补的3'部分，并且其中所述核酸分子的所述3'末端部分退火到所述5'发夹报告基因的所述3'部分上形成侵入性切割结构的上游双链体；和ii)将所述核酸分子的所述3'末端部分退火到所述5'发夹报告基因的所述3'部分上。20.如权利要求19所述的方法，其中所述侵入性切割结构可在所述靶切割位点被mg
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瓣测定缓冲液中的afu fen-1切割。21.如权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述靶切割位点位于所述5'发夹报告基因的所述下游双链茎中。22.如权利要求19至21中任一项所述的方法，其中所述下游双链茎是包含环的发夹茎。23.如权利要求19至22中任一项所述的方法，其中所述5'发夹报告基因包含fret标记系统。24.如权利要求23所述的方法，其中fret标记系统的第一成员附接在所述5'发夹报告基因上的第一位置，并且fret标记系统的第二成员附接在所述5'发夹报告基因上的第二位置，其中所述靶切割位点在所述第一位置与所述第二位置之间。25.如权利要求24所述的方法，其中所述第一位置和所述第二位置沿所述5'发夹报告基因的长度间隔不超过20个寡核苷酸，优选不超过10个寡核苷酸，更优选不超过9、8、7、6、5、4或3个寡核苷酸。26.如权利要求19至25中任一项所述的方法，其中所述5'发夹报告基因还包含3'阻断剂。27.如权利要求26所述的方法，其中所述3'阻断剂选自3'胺、3'磷酸酯、3'生物素、3'己二醇和3'双脱氧核苷酸。28.如权利要求19所述的方法，其还包括在反应混合物中切割所述侵入性切割结构。29.如权利要求28所述的方法，其中所述反应混合物包含mg
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瓣测定缓冲液。30.如权利要求28或权利要求29所述的方法，其中所述反应混合物包含瓣状核酸内切酶。31.如权利要求30所述的方法，其中所述瓣状核酸内切酶包含fen-1核酸内切酶，优选热稳定fen-1核酸内切酶，更优选来自古细菌生物体的热稳定fen-1核酸内切酶。32.如权利要求31所述的方法，其中所述fen-1核酸内切酶包含afu fen-1、ave fen-1和pfu fen-1中的一种或多种。33.如权利要求28至32中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含一种或多种pcr-瓣测定试剂。34.如权利要求33所述的方法，其中所述pcr-瓣测定试剂包含以下中的一种或多种：-dna聚合酶；-脱氧核苷三磷酸；
‑
瓣状寡核苷酸；-引物。35.如权利要求28至34中任一项所述的方法，其还包含靶核酸。36.一种组合物，其包含用于形成具有靶切割位点的侵入性切割结构的寡核苷酸5'发夹测试底物，所述5'发夹测试底物包含5'瓣、下游双链茎和上游双链茎，从而限定可在所述靶切割位点被mg
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瓣测定缓冲液中的afu fen-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构，其中所述5'瓣包含发夹形成区，并且其中所述发夹形成区中发夹的形成抑制所述5'发夹测试底物在所述靶切割位点处的fen-1核酸内切酶切割。37.如权利要求36所述的组合物，其中所述靶切割位点位于所述5'发夹测试底物的所述下游双链茎中。38.如权利要求36或权利要求37所述的组合物，其中所述下游双链茎是包含环的发夹茎。39.如权利要求36至38中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹测试底物包含fret标记系统。40.如权利要求39所述的组合物，其中fret标记系统的第一成员附接在所述5'发夹测试底物上的第一位置，并且fret标记系统的第二成员附接在所述5'发夹测试底物上的第二位置，其中所述靶切割位点在所述第一位置与所述第二位置之间。41.如权利要求40所述的组合物，其中所述第一位置和所述第二位置沿所述5'发夹测试底物的长度间隔不超过20个寡核苷酸，优选不超过10个寡核苷酸，更优选不超过9、8、7、6、5、4或3个寡核苷酸。42.如权利要求36至41中任一项所述的组合物，其还包含有包含阳离子的缓冲溶液。43.如权利要求42所述的组合物，其中所述包含阳离子的缓冲溶液是mg
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瓣测定缓冲液。44.如权利要求36至43中任一项所述的组合物，其还包含瓣状核酸内切酶。45.如权利要求44所述的组合物，其中所述瓣状核酸内切酶包含fen-1核酸内切酶，优选热稳定fen-1核酸内切酶，更优选来自古细菌生物体的热稳定fen-1核酸内切酶。46.如权利要求45所述的组合物，其中所述fen-1核酸内切酶包含afu fen-1、ave fen-1和pfu fen-1中的一种或多种。47.如权利要求36至46中任一项所述的组合物，其中当所述组合物在室温下时，所述5'发夹测试底物的所述5'发夹形成区呈发夹形式。48.一种测试瓣状核酸内切酶的方法，其包括：i)提供用于形成具有靶切割位点的侵入性切割结构的寡核苷酸5'发夹测试底物，所述5'发夹测试底物包含：a)5'瓣，b)下游双链茎和上游双链茎，从而限定可在所述靶切割位点被mg
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瓣测定缓冲液中的afu fen-1核酸内切酶切割的侵入性切割结构，其中所述5'瓣包含发夹形成区，并且其中所述发夹形成区中发夹的形成抑制所述5'发夹测试底物在所述靶切割位点处的fen-1核酸内切酶切割；ii)将所述5'发夹测试底物暴露于反应混合物中的瓣状核酸内切酶；和
iii)检测所述5'发夹测试底物的切割存在或不存在。49.如权利要求48所述的方法，其中所述靶切割位点位于所述5'发夹测试底物的所述下游双链茎中。50.如权利要求48或49所述的方法，其中所述下游双链茎是包含环的发夹茎。51.如权利要求48至50中任一项所述的方法，其中所述5'发夹测试底物包含fret标记系统。52.如权利要求51所述的方法，其中fret标记系统的第一成员附接在所述5'发夹测试底物上的第一位置，并且fret标记系统的第二成员附接在所述5'发夹测试底物上的第二位置，其中所述靶切割位点在所述第一位置与所述第二位置之间。53.如权利要求52所述的方法，其中所述第一位置和所述第二位置沿所述5'发夹测试底物的长度间隔不超过20个寡核苷酸，优选不超过10个寡核苷酸，更优选不超过9、8、7、6、5、4或3个寡核苷酸。54.如权利要求48至53中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含有包含阳离子的缓冲溶液。55.如权利要求54所述的方法，其中所述包含阳离子的缓冲溶液是mg
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瓣测定缓冲液。56.如权利要求48至55中任一项所述的方法，其中所述瓣状核酸内切酶包含fen-1核酸内切酶，优选热稳定fen-1核酸内切酶，更优选来自古细菌生物体的热稳定fen-1核酸内切酶。57.如权利要求56所述的方法，其中所述fen-1核酸内切酶包含afu fen-1、ave fen-1和pfu fen-1中的一种或多种。58.如权利要求48至57中任一项所述的方法，其中当所述反应混合物在室温下时，所述5'发夹测试底物的所述5'发夹形成区呈发夹形式。59.一种组合物，其包含具有靶切割位点的5'发夹侵入性切割结构，所述5'发夹切割结构包含5'瓣、下游双链茎和上游双链茎，从而限定侵入性切割结构，其中所述5'瓣包含发夹形成区，并且其中所述发夹形成区中发夹的形成抑制所述5'发夹侵入性切割结构在所述靶切割位点处的fen-1核酸内切酶切割。60.如权利要求59所述的组合物，其中当切割不被所述5'瓣的所述发夹形成区中的发夹形成抑制时，所述5'发夹侵入性切割结构可在所述靶切割位点被mg
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瓣测定缓冲液中的afu fen-1切割。61.如权利要求59或权利要求60所述的组合物，其中所述靶切割位点位于所述下游双链茎中。62.如权利要求59至61中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹侵入性切割结构选自：i)包含侵入性寡核苷酸、5'发夹探针寡核苷酸和靶核酸的侵入性切割结构，其中所述5'发夹探针寡核苷酸退火到所述靶核酸上形成所述下游双链茎，并且所述侵入性寡核苷酸退火到所述靶核酸上形成所述上游双链茎；ii)包含5'发夹报告基因和核酸分子的结构，所述5'发夹报告基因包含有包含5'发夹形成区的所述5'瓣、下游双链茎以及与所述核酸分子的3'末端部分互补的3'部分，其中所述核酸分子的所述3'末端部分退火到所述5'发夹报告基因的所述3'部分上形成所述侵入性切割结构的所述上游双链体；和
iii)寡核苷酸5'发夹测试底物，所述寡核苷酸包含有包含5'发夹形成区的5'瓣、下游双链茎和上游双链茎，从而限定侵入性切割结构。63.如权利要求62所述的组合物，其中在包含5'发夹报告基因和核酸分子的所述结构中，所述核酸分子包含5'发夹形成区。64.如权利要求59至63中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹侵入性切割结构包含fret标记系统。65.如权利要求64所述的组合物，其中fret标记系统的第一成员附接在所述5'发夹侵入性切割结构上的第一位置，并且fret标记系统的第二成员附接在所述5'发夹侵入性切割结构上的第二位置，其中所述靶切割位点在所述第一位置与所述第二位置之间。66.如权利要求65所述的组合物，其中所述第一位置和所述第二位置沿所述5'发夹侵入性切割结构中的核酸长度间隔不超过20个寡核苷酸，优选不超过10个寡核苷酸，更优选不超过9、8、7、6、5、4或3个寡核苷酸。67.如权利要求59至67中任一项所述的组合物，其中所述5'发夹侵入性切割结构包含有包含3'阻断剂的寡核苷酸。68.如权利要求67所述的组合物，其中所述3'阻断剂选自3'胺、3'磷酸酯、3'生物素、3'己二醇和3'双脱氧核苷酸。69.如权利要求59至68中任一项所述的组合物，其还包含有包含阳离子的缓冲溶液。70.如权利要求69所述的组合物，其中所述包含阳离子的缓冲溶液是mg
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瓣测定缓冲液。71.如权利要求59至70中任一项所述的组合物，其还包含瓣状核酸内切酶。72.如权利要求71所述的组合物，其中所述瓣状核酸内切酶包含fen-1核酸内切酶，优选热稳定fen-1核酸内切酶，更优选来自古细菌生物体的热稳定fen-1核酸内切酶。73.如权利要求72所述的组合物，其中所述fen-1核酸内切酶包含afu fen-1、ave fen-1和pfu fen-1中的一种或多种。74.如权利要求59至73中任一项所述的组合物，其还包含一种或多种pcr-瓣测定试剂。75.如权利要求74所述的组合物，其中所述pcr-瓣测定试剂包含以下中的一种或多种：-dna聚合酶；-脱氧核苷三磷酸；-瓣状寡核苷酸；-引物。
技术总结
用于例如通过温度移动可逆抑制瓣状核酸内切酶切割的5'发夹寡核苷酸底物和使用5'发夹寡核苷酸的方法。夹寡核苷酸的方法。夹寡核苷酸的方法。
技术研发人员：Z.加拉特 M.B.马特 N.J.多米尼克 M.J.多米尼克
受保护的技术使用者：精密科学公司
技术研发日：2020.09.16
技术公布日：2022/6/21