一种红曲糟抗热肽剂及其制备方法与应用

本发明属于酵母菌剂热保护剂技术领域，更具体地涉及一种红曲糟抗热肽剂、微细化红曲糟定向酶解的制备方法及酵母热保护应用。

背景技术：

在菌剂产业化生产实践中，提高干制菌剂菌体的存活率，是长期以来保护剂选择、改良及优化的主要目的。喷雾干燥、流化床等热干燥方式是产业化、规模化批量制备工业微生物菌剂的常用手段。较高的干燥温度可以给发酵工业带来更有利的经济效益，并能大幅降低水电资源消耗、缩短生产周期、降低成本。干燥过程中，菌剂和热空气充分接触，高温和脱水导致菌体死亡，活菌量降低。因此，在热干燥过程中采用保护剂以提高菌体存活率具有重要意义。

菌剂在脱水过程中，热会造成菌体dna、rna、蛋白质(包括酶类)、细胞膜和核糖体等物质内在损伤，从而导致细胞失活。在热干燥过程中，抗热保护剂可通过不同途径在一定程度上减少菌体细胞的热损害。目前，常用的保护剂主要有以下几类：调节渗透压的添加剂主要为碱金属缓冲盐、糖类、多元醇、氨基酸等；乳化剂主要有司盘类、吐温类；抗氧化剂包括二丁基羟基甲苯(bht)、丁基丁基羟基茴香醚(bha)和没食子酸内脂(pc)、维生素c、酚类等；还有一些大分子保护剂如阿拉伯胶、可溶性淀粉、脱脂乳、酪蛋白、乳清蛋白、β-环糊精、微晶纤维素等。在如下文献中还可以发现更多与上述技术方案相关的信息。

中国发明专利cn104068371b“一种豆瓣辣酱促熟增香发酵菌剂及其制备方法”中以6-10％蔗糖、1-5％明胶与2-5％甘油作为短小芽胞杆菌(bacilluspumilus)、发酵乳杆菌(l.fermentum)、双发酵乳杆菌(l.bifermentans)、鲁氏酵母(zygosaccharomycesrouxii)、米曲霉(aspergillusoryzae)扩繁培养、混合发酵得到的促熟增香发酵菌剂的抗热保护剂。中国发明专利申请cn103283975a“一种用喷雾干燥制备益生菌微胶囊的方法”中以脱脂奶粉作为益生菌的抗热保护剂。中国发明专利申请cn107889888a“一种喷雾干燥制备抗氧化益生菌羊奶粉的方法”中以脱脂乳粉、蔗糖、葡萄糖、海藻糖、明胶和甘油溶液作为羊奶粉中干酪乳杆菌的抗热保护剂。

近年来，生物活性肽因其来源广泛、易吸收利用、具有多种生理功能，成为蛋白领域新兴研究热点。生物活性肽不仅能促进生长，还可提高微生物低温、高渗透压等耐受性。目前，肽类对益生菌及酵母菌的热保护作用尚属研究空白。

红曲黄酒是福建特产，黄酒生产的主要副产物是红曲糟，它是发酵酒醪经压榨、分离去酒液后的留下的固形物。红曲黄酒在生产过程中能产生20～30％的酒糟，以此推算，每年可产生2.5万吨以上的红曲糟。红曲糟干基中含有20-40％的蛋白质、20-30％的粗淀粉、10％左右的纤维素及少量的糖分、糊精、灰分等物质，其热能比较低，含有不溶性物质多，难以直接利用，一般酒厂将其作为普通的饲料低价出售或作为垃圾直接丢弃，利用率很低。这不仅污染生态环境，也造成酒糟中大量的可利用资源成为废物。因此，将红曲糟开发成为对益生菌及酵母菌具有热保护作用的抗热肽剂，提供了红曲糟利用的新途径，可极大地提高红曲糟的附加值，具有很好的经济和社会效益。

技术实现要素：

鉴于背景技术存在的上述技术问题，需要提供一种红曲糟抗热肽剂、微细化红曲糟定向酶解制备红曲糟抗热肽剂的制备方法及酵母热保护应用，所述红曲糟抗热肽剂具备热保护作用、使干制酵母菌存活率得以提高的功效，所述微细化定向酶解制备红曲糟抗热肽剂的制备方法能大大提高红曲糟中的蛋白利用率和水解度，所述红曲糟抗热肽剂的酵母热保护应用能为干制酵母菌剂提供有效热保护，提高干制酵母菌剂时酵母存活率。

为实现上述目的，在本发明的第一方面，发明人提供了一种红曲糟抗热肽剂的制备方法，包括以下步骤：

取新鲜红曲糟烘干，然后进行超微粉碎，得到红曲糟粉；

将所述红曲糟粉用去离子水配制成质量百分比分数为6-10％的红曲糟悬浊液，调节所述红曲糟悬浊液ph值为4-5，用质量百分比分数为1-1.5％的纤维素酶降解8h以上，然后在高温反应釜中反应，之后用微射流进行均质，得到微细化红曲糟；

将所述微细化红曲糟的ph值调节为5.8-6.5，用淀粉酶降解之后在ph值为4.5时进行沉淀，得到沉淀物；

将所述沉淀物用蛋白酶复合物进行酶解，得到红曲糟抗热肽剂初品，所述蛋白酶复合物由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例(405-495)：(315-385)：(180-220)配制而成；

将所述红曲糟抗热肽剂初品灭酶，然后离心收集上清液，将所述上清液旋蒸蒸发浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液冷冻干燥，得到红曲糟抗热肽剂。

在本发明的第二方面，发明人提供了一种红曲糟抗热肽剂，采用本发明第一方面所述的制备方法制备得到。

在本发明的第三方面，发明人提供了一种如本发明第二方面所述的红曲糟抗热肽剂在提高酵母菌剂的菌体存活率的应用，包含：60℃干制20min制备酵母菌剂条件下，1g酵母菌剂的新鲜菌坭添加1.5-7.5mg所述红曲糟抗热肽剂的步骤。

区别于现有技术，上述技术方案至少具有以下有益效果：

采用工业化生产红曲黄酒的废弃物红曲糟为原料，利用微细化定向酶解技术制备酵母抗热肽剂，不仅是对现有干制菌剂抗热保护剂种类的丰富，更提供了一种对红曲糟资源的有效回收利用途径。经测试发现，本发明提供的所述红曲糟抗热肽剂相比于采用普通酶解方法制备得到的红曲糟抗热保护剂的蛋白利用率提高17％以上，水解度提高13％以上。将所述红曲糟抗热肽剂用于60℃干制20min制备酵母菌剂时，酵母的存活率可达50.65％以上。而在同等条件下，加入相同添加量的其他抗热保护剂时，本发明提供的所述红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母的热激存活促进作用显著高于其他抗热保护剂。

附图说明

图1为具体实施方式所述蛋白酶复合物中三种酶的配比优化设计试验的响应面图；

图2为具体实施方式所述蛋白酶复合物中三种酶的配比优化设计试验的等高线图；

图3为采用本发明提供的所述红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母热激存活率的影响柱状图；

图4为采用本发明提供的所述红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母热激存活量的影响平板培养图示；

图5为采用本发明提供的所述红曲糟抗热肽剂与常用抗热保护剂对酿酒酵母热激存活率的热保护作用曲线图。

具体实施方式

下面详细说明本发明第一方面所述的红曲糟抗热肽剂的制备方法、本发明第二方面所述的红曲糟抗热肽剂以及本发明第三方面所述的红曲糟抗热肽剂在提高酵母菌剂的菌体存活率的应用。

首先说明本发明第一方面所述的红曲糟抗热肽剂的制备方法。该制备方法可更具体地描述成微细化红曲糟定向酶解制备红曲糟抗热肽剂的制备方法。

一种红曲糟抗热肽剂的制备方法，包括以下步骤：

取新鲜红曲糟烘干，然后进行超微粉碎，得到红曲糟粉；

将所述红曲糟粉用去离子水配制成质量百分比分数为6-10％的红曲糟悬浊液，调节所述红曲糟悬浊液ph值为4-5，用质量百分比分数为1-1.5％的纤维素酶降解8h以上，然后在高温反应釜中反应，之后用微射流进行均质，得到微细化红曲糟；

将所述微细化红曲糟的ph值调节为5.8-6.5，用淀粉酶降解之后在ph值为4.5时进行沉淀，得到沉淀物；

将所述沉淀物用蛋白酶复合物进行酶解，得到红曲糟抗热肽剂初品，所述蛋白酶复合物由碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例(405-495)：(315-385)：(180-220)配制而成；

将所述红曲糟抗热肽剂初品灭酶，然后离心收集上清液，将所述上清液旋蒸蒸发浓缩，得到浓缩液，将所述浓缩液冷冻干燥，得到红曲糟抗热肽剂。

作为本发明优选的技术方案，所述进行超微粉碎为将烘干后的红曲糟粉碎至d50为40-50μm，90％以上的红曲糟粉粒径小于150μm。

作为本发明优选的技术方案，所述在高温反应釜中反应的条件为：温度110-130℃，反应时间10-20min。

作为本发明优选的技术方案，所述用微射流进行均质时压力为60-150mpa，均质操作次数大于或等于3次。

作为本发明优选的技术方案，所述用淀粉酶降解的条件为：淀粉酶以质量百分比为1-1.5％的添加量加入所述微细化红曲糟，反应温度为50℃，降解时间为3h。

作为本发明优选的技术方案，所述沉淀物用蛋白酶复合物进行酶解的条件为：所述蛋白酶复合物以质量百分比为1-1.5％的添加量加入所述沉淀物，ph值7.5-9.5，温度45-55℃，降解时间为2-4h。

作为本发明优选的技术方案，所述红曲糟抗热肽剂初品灭酶的温度为90℃以上，所述离心的转速为10000g/min，离心时间15min，所述上清液旋蒸蒸发浓缩的温度为30-55℃。

区别于现有技术，本发明提供的红曲糟抗热肽剂的制备方法，可使红曲糟的蛋白质利用率高达70％以上，显著优于采用普通方法制备的红曲糟抗热保护剂的蛋白质利用率。导致该种显著差异的具体原因为超微粉碎、高温反应和微射流均质操作以及蛋白酶复合物的定向酶解作用。

接着说明本发明第二方面所述的红曲糟抗热肽剂。

一种红曲糟抗热肽剂，采用本发明第一方面所述制备方法制备得到。

优选地，所述红曲糟抗热肽剂的蛋白质含量≥50wt％，水解度≥38％，分子量≤5000da的肽含量≥70％。

最后说明本发明第三方面所述的红曲糟抗热肽剂在提高酵母菌剂的菌体存活率的应用。

一种如本发明第二方面所述的红曲糟抗热肽剂在提高酵母菌剂的菌体存活率的应用，包含：60℃干制20min制备酵母菌剂条件下，1g酵母菌剂的新鲜菌坭添加1.5-7.5mg所述红曲糟抗热肽剂的步骤。本发明所指的这种应用具体操作步骤包括：

将选育出的酵母菌接入培养基中控温发酵，使菌体生物量达10⁸cfu/ml以上，采用压滤机压榨成菌坭，添加本发明提供的红曲糟抗热肽剂，搅拌均匀，经造粒机造粒，于沸腾炉中60℃干燥脱水20min，制成菌剂。

为详细说明技术方案的技术内容、构造特征、所实现目的及效果，以下结合具体实施例并配合附图详予说明。应理解，这些实施例仅用于说明本申请而不用于限制本申请的范围。

本发明中蛋白利用率和蛋白质含量采用凯氏定氮法测定；水解度采用ph-stat法进行测定；5000da以下多肽含量测定参照国标gb/t22492-2008大豆肽粉的方法进行测定。

水解度的计算公式如下:

dh(％)＝b(mb)(1/a)(1/mp)(1/htot)×100

其中:b－naoh的体积，ml；mb－naoh的浓度，mol/l；1/a－在ph9.0，55℃的实验条件下，对于大米蛋白，1/a为1.01；mp－蛋白的质量，g；htot－每克原料蛋白质中肽键的毫摩尔数，对于大米蛋白，取7.40mmol/g。

实施例1

一种红曲糟抗热肽剂的制备方法，具体采取以下步骤：取适量新鲜红曲糟于60℃烘干，然后进行超微粉碎，超微粉碎至d50为40-50μm，并且90％以上的红曲糟粉粒径小于150μm，即得到红曲糟粉。经超微粉碎后，红曲糟蛋白的利用率为67.23％，这一数值显著优于采用普通粉碎手段得到的60.78％。将所述红曲糟粉用去离子水配制成质量百分比分数为8％的红曲糟悬浮液，调节所述红曲糟悬浊液ph值为4.5，加质量百分比分数为1％的纤维素酶降解24h，然后在高温反应釜中于120℃高压反应20min后，用微射流反应器在压力100mpa均质3次，获得微细化红曲糟，经过这个步骤，红曲糟蛋白的利用率进一步得以提高到84.34％。将所述微细化红曲糟的ph值调节到6，以淀粉酶酶解，酶解反应条件为：温度50℃、加淀粉酶量1.5％、酶解时间3h，于等电点(ph值为4.5)进行沉淀获得沉淀物。将所述沉淀物用蛋白酶复合物进行酶解，得到红曲糟抗热肽剂初品。其中，所述蛋白酶复合物采用scheffe单纯型格子设计优化复合蛋白酶混料配比为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例449：348：203配制而成。蛋白酶复合物进行酶解的反应条件为：温度50℃、ph值为8.5、时间3h、蛋白酶复合物添加量1.5％。

将所述红曲糟抗热肽剂初品于90℃以上灭酶，以终止水解反应，然后以10000g/min离心15min后收集上清液在30-55℃下旋蒸蒸发浓缩，得到浓缩液。将所述浓缩液经过冷冻干燥，得到本发明所述的红曲糟抗热肽剂。经测定，本发明提供的红曲糟抗热肽剂的制备方法红曲糟的蛋白利用率为84.34％，采用本实施方式提供的红曲糟抗热肽剂，蛋白质含量为52.3％，水解度为48.91％，相对分子量在5000da以下多肽含量为88.9％。

实施例2

与实施例1的不同之处在于，将所述红曲糟粉用去离子水配制成质量百分比分数为6％的红曲糟悬浮液，调节所述红曲糟悬浊液ph值为4.0，用纤维素酶降解之后，在高温反应釜中于110℃高压反应20min后，用微射流反应器在压力150mpa均质3次，获得微细化红曲糟，经过这个步骤，红曲糟蛋白的利用率进一步得以提高到76.43％。将所述微细化红曲糟的ph值调节到6.5，以淀粉酶酶解时的反应条件为：淀粉酶以质量百分比为0.5％的添加量加入所述微细化红曲糟。将所述沉淀物用蛋白酶复合物进行酶解，采用的蛋白酶复合物为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例495：385：219配制而成(在不同的具体实施方式中，蛋白酶复合物为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例为(405-495)：(315-385)：(180-220)中的任意比值配制而成)，蛋白酶复合物进行酶解的反应条件为：温度55℃、时间4h、蛋白酶复合物添加量1％、ph值为7.5，得到红曲糟抗热肽剂初品。将所述红曲糟抗热肽剂初品灭酶、离心、蒸发浓缩和冷冻干燥等操作都与实施例1相同。经测定，本发明提供的红曲糟抗热肽剂的制备方法红曲糟的蛋白利用率为76.43％，采用实施例2提供的红曲糟抗热肽剂，蛋白质含量为50.35％，水解度为39.00％，相对分子量在5000da以下多肽含量73.40为％。

实施例3

与实施例1的不同之处在于，将所述红曲糟粉用去离子水配制成质量百分比分数为10％的红曲糟悬浮液，调节所述红曲糟悬浊液ph值为5.0，用纤维素酶降解之后，在高温反应釜中于130℃高压反应20min后，用微射流反应器在压力60mpa均质3次，获得微细化红曲糟，经过这个步骤，红曲糟蛋白的利用率进一步得以提高到70.46％。将所述微细化红曲糟的ph值调节到5.8，以淀粉酶酶解时的反应条件为：淀粉酶以质量百分比为0.8％的添加量加入所述微细化红曲糟。将所述沉淀物用蛋白酶复合物进行酶解，采用的蛋白酶复合物为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例405：330：190配制而成(在其他不同的具体实施方式中，蛋白酶复合物为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例为(405-495)：(315-385)：(180-220)中的任意比值配制而成)，蛋白酶复合物进行酶解的反应条件为：温度45℃、时间4h、蛋白酶复合物添加量1％、ph值为9.5，得到红曲糟抗热肽剂初品。其他操作都与实施例1相同。经测定，本发明提供的红曲糟抗热肽剂的制备方法红曲糟的蛋白利用率为70.46％，采用实施例3提供的红曲糟抗热肽剂，蛋白质含量为43.68％，水解度40.45％，相对分子量在5000da以下多肽含量为71.65％。

实施例4

与实施例1的不同之处在于，将所述红曲糟粉用去离子水配制成质量百分比分数为7％的红曲糟悬浮液，调节所述红曲糟悬浊液ph值为4.7，用纤维素酶降解之后，在高温反应釜中于115℃高压反应20min后，用微射流反应器在压力80mpa均质3次，获得微细化红曲糟，经过这个步骤，红曲糟蛋白的利用率进一步得以提高到78.94％。将所述微细化红曲糟的ph值调节到6.0，以淀粉酶酶解时的反应条件为：淀粉酶以质量百分比为0.7％的添加量加入所述微细化红曲糟。将所述沉淀物用蛋白酶复合物进行酶解，采用的蛋白酶复合物为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例420：345：200配制而成(在其他不同的具体实施方式中，蛋白酶复合物为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例为(405-495)：(315-385)：(180-220)中的任意比值配制而成)，蛋白酶复合物进行酶解的反应条件为：温度55℃、时间4h、蛋白酶复合物添加量1.5％、ph值为8.5，得到红曲糟抗热肽剂初品。其他操作都与实施例1相同。经测定，本发明提供的红曲糟抗热肽剂的制备方法红曲糟的蛋白利用率为78.94％，采用实施例4提供的红曲糟抗热肽剂，蛋白质含量为50.98％，水解度为42.54％，相对分子量在5000da以下多肽含量为70.98％。

实施例5

与实施例1的不同之处在于，将所述红曲糟粉用去离子水配制成质量百分比分数为9％的红曲糟悬浮液，调节所述红曲糟悬浊液ph值为4.9，用纤维素酶降解之后，在高温反应釜中于125℃高压反应20min后，用微射流反应器在压力100mpa均质3次，获得微细化红曲糟，经过这个步骤，红曲糟蛋白的利用率进一步得以提高到83.64％。将所述微细化红曲糟的ph值调节到6.5，以淀粉酶酶解时的反应条件为：淀粉酶以质量百分比为0.9％的添加量加入所述微细化红曲糟。将所述沉淀物用蛋白酶复合物进行酶解，采用的蛋白酶复合物为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例450：385：200配制而成，在其他不同的具体实施方式中，蛋白酶复合物为碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶以重量份比例为(405-495)：(315-385)：(180-220)中的任意比值配制而成，蛋白酶复合物进行酶解的反应条件为：温度50℃、时间3h、蛋白酶复合物添加量1.5％、ph值为8.5，得到红曲糟抗热肽剂初品。其他操作都与实施例1相同。经测定，本发明提供的红曲糟抗热肽剂的制备方法红曲糟的蛋白利用率为83.64％，采用实施例5提供的红曲糟抗热肽剂，蛋白质含量为55.89％，水解度为47.64％，相对分子量在5000da以下多肽含量为86.69％。

1、蛋白酶复合物中三种酶的配比优化试验

(1)scheffe单纯型格子设计

以水解度为考察指标，采用scheffe单纯型格子设计进行蛋白酶复合物研究，a、b、c分别表示混料系统中碱性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶各占的百分比，混料条件a+b+c＝1。混料设计试验方案和结果见表1。

表1混料设计试验方案及结果与预测值

(2)回归模型建立与方差分析

利用designexpert8.0.5软件，对响应值进行多元回归拟合分析，不完全三次回归模型方程：

y＝40.0a+38.56b+31.98c+18.46ab+23.11ac+18.31bc+28.12abc

方差分析结果见表2。由表2中数据可知，不完全三次回归模型及相助(p＜0.0001)，决定系数r-squared＝0.9924，校正决定系数adjr-squared＝0.9873，均大于0.9，说明该不完全三次回归模型能够很好的拟合各指标与蛋白酶复合物中三种酶的比例。

表2不完全三次回归模型方程方差分析

(3)蛋白酶复合物中最佳三种酶混合配比预测

蛋白酶复合物中三种酶的配比优化设计试验的等高线图如图1所示，蛋白酶复合物中三种酶的配比优化设计试验的响应面图如图2所示。图1和图2显示响应面坡度非常陡峭，表明水解度

对三种酶混合比例的改变非常敏感。通过利用designexpert8.0.5软件模型进行优化，计算得出最佳的混合酶配比为：碱性蛋白酶44.9％，中性蛋白酶34.8％，木瓜蛋白酶20.3％，在此条件下，水解度为45.06％。

(4)蛋白酶复合物中最佳三种酶混合配比验证

为了验证模型预测结果的准确性，在模型优化的工艺参数下进行3次平行试验，红曲糟的水解度分别为45.53％、45.02％、44.99％，平均值45.18％，实测值与模型预测值相对误差ξ为0.67％，说明designexpert8.0.5软件模型的拟合度较好。

2、蛋白酶复合物酶解条件正交试验

为确定蛋白酶复合物的最佳酶解条件，对蛋白酶复合物酶解的温度、时间、蛋白酶复合物添加量、ph值采用四因素三水平l9(3⁴)正交试验设计。以水解度为考察指标，设计因素水平的正交试验方案见表3，该正交试验结果见表4。

表3l9(3⁴)正交试验设计因素及水平

表4正交试验结果与分析

从表4结果可以看出，酶解时间和蛋白酶复合物添加量分居第一、二位，是影响水解度的关键因子。方差分析见表5。

表5方差分析表

由表5所示结果可以看出，酶解温度、时间、蛋白酶复合物添加量、ph值均对水解度达极显著水平(p＜0.01)。酶解各因素对水解度的影响主次顺序为b＞c＞d＞a，即酶解时间＞蛋白酶复合物添加量＞酶解ph值＞酶解温度。酶解的最适条件为：a2b2c3d2，即温度50℃、时间3h、蛋白酶复合物添加量1.5％、ph值8.5。

为了验证正交试验结果的准确性，最优组合条件下进行3次重复试验，水解度分别为48.12％、49.68％、48.94％，平均值48.91％。

3、红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母的热耐受性影响

(1)菌种活化

将实验室选育的酿酒酵母jh301接入ypd液体培养基，30℃培养24h，传代培养3次，菌体生物量达10⁷cfu/ml^-1以上，备用。

(2)红曲糟抗热肽剂热激存活试验

将活化的酿酒酵母jh301分别以1％接种至50ml灭菌ypd培养基(起始od600≈0.1)，30℃培养5h(对数生长中期，od600≈1)。以纯水为对照，离心后重悬于实施例1提供的红曲糟抗热肽剂溶液(该溶液的红曲糟抗热肽质量浓度为1mg/ml，在不同的应用中该数值可以选自0.05-5mg/ml)，依次稀释菌体10、10²、10³、10⁴、10⁵倍。分别取5ul于孟加拉红平板上，放入50℃培养箱热激60min后转入30℃培养1d，考察红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母耐热性的影响，结果如图3所示。从图3可以看出，以纯水菌体稀释液ck为对照，本发明实施例1提供的红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母jh301耐热性具有明显的促进作用，随着红曲糟抗热肽剂添加量的增加，酿酒酵母jh301的热激存活率随之增加。随着红曲糟抗热肽剂添加量的增加，酿酒酵母jh301的热激存活率呈先上升后趋于平缓的趋势。当红曲糟抗热肽剂添加量为0.1mg/ml时，酿酒酵母jh301热激存活率由10.42％提高至41.22％，与ck对照组和红曲糟抗热肽剂添加量为0.05mg/ml处理的差异极显著，与红曲糟抗热肽剂添加量0.5、1和5mg/ml处理的差异不显著(p＞0.05)。

取菌体稀释液，涂布后放入50℃培养箱热激60min后转入30℃培养2d进行菌落计数，结果如图4所示。通过菌落计数定量测定，也证实了红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母jh301耐热性具有显著的促进作用。

(3)本发明提供的所述红曲糟抗热肽剂与常用抗热保护剂对酿酒酵母的热保护作用中试试验

为了对比红曲糟抗热肽剂与常用抗热保护剂对酿酒酵母的热保护作用，发明人进行了酿酒酵母菌剂制备的中试试验。将酿酒酵母于28-30℃控温发酵18-20h，菌量达10⁸cfu/ml，用压滤机将其压榨成菌坭，分别添加不同的抗热保护剂——本发明提供的红曲糟抗热肽剂、微晶纤维素、司盘60、吐温、脱脂乳粉、环状糊精、海藻糖和酪蛋白，搅拌均匀，经造粒机造粒，于沸腾炉中60℃干燥脱水20min，制成菌剂。

经测定，本发明提供的所述红曲糟抗热肽剂与常用抗热保护剂对酿酒酵母的热保护作用(即提升酿酒酵母的存活率)结果如图5所示。从图5中，可以很明显看到，采用本发明提供的所述红曲糟抗热肽剂作为酿酒酵母的抗热保护剂具有非常显著的热保护作用。当红曲糟抗热肽剂的添加量为1.5-4.5mg/g时，红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母的热保护作用处于平台期，菌剂中酿酒酵母存活率的差异表现为不显著，为50.68-52.76％之间。当红曲糟抗热肽剂的添加量为6mg/g和7.5mg/g时，菌剂中酿酒酵母的存活率急剧升高，分别为65.96％和93.47％。所有的红曲糟抗热肽剂处理组酵母存活率均显著高于无保护剂对照组。并且，红曲糟抗热肽剂的添加量仅为1.5mg/g时，对酿酒酵母的热保护作用就可相当于10mg/g吐温或脱脂乳粉，用量大大减少。

从以上试验结果可知，本发明提供的红曲糟抗热肽剂对红曲糟的水解度很高，蛋白质含量≥50wt％，水解度≥38％，分子量≤5000da的肽含量≥70％，将其用于60℃干制制备酵母菌剂时酵母存活率可达50.65以上，对于酵母具有显著的热保护作用。并且该红曲糟抗热肽剂在较低添加量的情况下就能够使酿酒酵母得到比常见抗热保护剂6倍添加量以上才能达到的存活率；在同样的添加量的情况下，红曲糟抗热肽剂对酿酒酵母存活率的提升远远胜过常见的抗热保护剂，例如微晶纤维素、司盘60、吐温、脱脂乳粉、环状糊精、海藻糖和酪蛋白。

需要说明的是，尽管在本文中已经对上述各实施例进行了描述，但并非因此限制本发明的专利保护范围。因此，基于本发明的创新理念，对本文所述实施例进行的变更和修改，或利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，直接或间接地将以上技术方案运用在其他相关的技术领域，均包括在本发明的专利保护范围之内。