桑黄发酵液多糖在抗禽流感病毒药物中的应用

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种桑黄发酵液多糖在抗禽流感病毒药物中的应用。

背景技术：

随着我国养殖业的飞速发展，特别是近年来集约化养殖业发展很快，目前，畜禽疾病防治也面临很多问题。畜禽传染病根据其病原特性大体可分为病毒性疾病、细菌性疾病、真菌性疾病、支原体病等。而病毒性疾病是目前尚无特效药物和治疗方法的“疑难”。而目前针对病毒性传染疾病主要采取的措施是注射疫苗、运用抗病毒药物等治疗方法。这两种方法都存在一定的缺陷，疫苗注射只是针对于某一种病毒有效，不具有广谱性，而运用抗病毒药物进行治疗也具有一定的局限性，它们可以抑制普通的病毒，但对有些病毒的抗性却不够理想，而且长期使用会产生耐药性。

研究报道，桑黄多糖已被发现具有多种生物学活性，目前已经公开报道的活性包括桑黄多糖具有抗氧化、抗肿瘤、降血脂等活性，桑黄多糖具有原料来源丰富，生产成本低，制备工艺简单等若干优势，且其对动物体没有伤害，并同时具有提高动物免疫力、抗病毒、抗氧化、抗菌等功效。但是有的桑黄多糖是从桑黄的子实体中提取，例如cn110642958a公开了一种桑黄多糖的提取方法及应用，涉及的菌种为phellinuslinteus、phellinusbaumii和phellinusigniarius，包括：（1）将成熟的桑黄子实体粉碎，过筛，制备培养基；（2）将纤维素降解菌和多粘类芽孢杆菌paenibacilluspolymyxa接种至步骤（1）中的培养基中，发酵一定时间；（3）发酵结束后，固液分离菌体和不溶于水的杂质，得到溶有多糖的发酵液；洗涤固液分离的沉淀，将洗涤液合并至溶有多糖的发酵液中；（4）将步骤（3）获到的混合液进行超滤；（5）采用乙醇溶液沉淀，得到桑黄多糖产品。采用本公开的方法得到的桑黄多糖产品得率和纯度均比较高，而且抗氧化能力较高。cn105777924a也公开了一种桑黄子实体抗癌活性多糖pbpp及其制备方法，涉及的菌种为phellinusbaumii；有的桑黄多糖是从桑黄菌丝体中提取，例如cn104910289a公开一种连续制备桑黄菌丝体多糖的方法，涉及的菌种为phellinuslinteus，属于生物工程技术领域。包括以下步骤：将脱脂处理后的桑黄菌丝体，95℃热水回流提取8h，离心，浓缩，乙醇沉淀，除蛋白，透析，冷冻干燥，得水提桑黄菌丝体多糖；水提残留物溶于1%草酸铵溶液，95℃回流提取8h，离心，浓缩，乙醇沉淀，除蛋白，透析，冷冻干燥，得酸提桑黄菌丝体多糖；酸提残留物溶于1.25mol/l氢氧化钠和0.05%硼氢化钠溶液，常温提取3h，离心，浓缩，加乙酸，乙醇沉淀，除蛋白，透析，冷冻干燥，得碱提桑黄菌丝体多糖。利用本发明连续制备的桑黄菌丝体多糖具有明显的清除自由基能力和抗氧化活性，且本发明的提取制备方法简单、易行、成本低、能规模化生产，并能应用于其他真菌菌丝体如灵芝、冬虫夏草、灰树花等。cn110627917a也公开了采用桑黄菌丝体作为提取原料，极大的节约了成本，且该方法步骤简单，操作方便，能够有效的对桑黄菌丝体中的多糖进行提取，多糖得率高。但是对于从桑黄发酵液中提取桑黄多糖还未见报道，对于桑黄多糖作为免疫增强剂，尤其是其在预防和治疗禽流感病毒方面的用途也未见报道。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明公开了一种桑黄发酵液多糖在抗禽流感病毒药物中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种保藏编号为cgmccno.21068的桑黄（sanghuangporussanghuang）发酵液多糖在抗禽流感病毒药物中的应用

优选地，所述的桑黄发酵液多糖通过以下方法提取：

（1）提取：取振荡培养8-10d后所得桑黄发酵液，浓缩至原体积的1/20-1/10，加2-5倍75-95%乙醇，静置醇沉12-48h后，5000rpm离心10-30min得醇沉物，冷冻干燥后粉粹，过40-80目筛网，备用；

（2）过滤：取适量上述醇沉物干粉末，加50-100倍体积的蒸馏水溶解后，30-60℃超声波震荡溶解1-3h后，磁力搅拌溶解15-30min，5000rpm离心10-30min；滤渣继续用10-50倍体积的蒸馏水重复溶解两次并离心，合并3次离心上清液并浓缩，冷冻干燥后即得桑黄发酵液多糖粗提物，标记为eps；

（3）纯化：取eps样品，用100倍蒸馏水溶解后，8000rpm离心10-30min除去不溶物，上清液通过葡聚糖凝胶sephadexg-100进行分级纯化；

（4）收集：收集纯化后的样品，干燥得到桑黄多糖；

其中所述桑黄菌株（sanghuangporussanghuang）保藏编号为cgmccno.21068。

优选地，所述的桑黄发酵液由以下方法获得：

（1）平板菌种培养方法：无菌操作，从斜面母种中取面积0.25cm²的菌种块，转接到冷却至28℃以下的平板培养基中央，置25-28℃恒温培养箱中，避光，倒置，静置培养6-10d，既得平板菌种。

（2）液体菌种培养方法：无菌操作，500毫升三角瓶，装液量200ml，接入6-8块菌龄一致，面积0.25cm²经活化的平板菌种，28℃、150rpm，避光振荡培养6d，即得液体菌种；

（3）液体发酵培养方法：无菌操作，将液体菌种接种到液体发酵罐中，接种量5-15%，25-30℃，120-150rpm，避光振荡培养6-10d后，终止发酵并用60-200目纱网过滤得桑黄发酵液。

优选地，所述液体菌种培养基以百分比计：葡萄糖1-2%，酵母抽提物0.2-0.5%，kh2po40.05-0.1%，mgso4·7h2o0.02-0.05%，ph自然；

所述液体发酵培养基以百分比计：玉米粉0.3-0.4%，葡萄糖1-2%，蛋白胨0.1-0.3%，酵母抽提物0.2-0.5%，kh2po40.05-0.1%，mgso4·7h2o0.02-0.08%，麸皮1-3%，ph5-ph7。

有益效果

本发明提供了桑黄发酵液多糖在抗禽流感病毒药物中的应用，为防治禽流感病毒扩宽了途径，具有十分重要的意义。

本申请中采用了液体发酵的形式，得到桑黄发酵液，通过醇提，凝胶柱过滤纯化提取桑黄发酵液中的桑黄发酵液多糖，该多糖经纯化后所得多糖组分eps1和eps2抗禽流感h5n1毒株的效果好。

桑黄发酵液多糖eps1的半数中毒浓度cc50为17.324ug/ml，最大安全浓度cmax为7.6ug/ml。桑黄发酵液多糖eps2的半数中毒浓度cc50为2.511ug/ml，最大安全浓度cmax为2.0ug/ml。采用所得到的最大安全浓度范围内对样品eps1在mdck细胞水平上进行对(aiv)h5n1毒株的攻毒实验，病毒的抑制率为30.4%，此时si为1.64。采用所得到的最大安全浓度范围内对样品eps2在mdck细胞水平上进行对(aiv)h5n1毒株的攻毒实验，病毒的抑制率达100%，此时si为2.686。

菌种保藏信息

保藏时间：2021年1月4日；

保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；

保藏编号：cgmccno.21068；

保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所；

分类命名：sanghuangporussanghuang。

附图说明

图1桑黄发酵液多糖（eps）葡聚糖凝胶g-100柱层析洗脱图。

具体实施方式

下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。

实施例1

本申请采用的菌种是从贵州省安顺市山区桑树活立木上采集新鲜子实体后通过组织分离和菌种纯化而得到，该菌株分类命名为桑黄(sanghuangporussanghuang)，已于2021年1月4日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为cgmccno.21068。

子实体形态特征：担子果多年生，无柄盖形，通常单生，新鲜时具酸味，木栓质，干后木质；菌盖马蹄形，向外伸出达5cm，宽11cm，基部厚6cm；菌盖表面黄褐色至灰褐色，被纤细的绒毛至光滑，具明显的环区和环沟；边缘钝，鲜黄色；孔口表面新鲜时黄色，干后褐色，略具折光反应；不育边缘明显，宽达3mm；孔口多角形至圆形，每毫米6-7个；孔口边缘薄，全缘；菌肉黄色，比菌管颜色浅，硬木栓质，环区明显，具黑线，厚达5cm；菌管褐色，木栓质，长达4mm。

显微结构特征：菌丝系统二体系；所有隔膜无锁状联合；菌丝组织在koh中变黑。菌肉中生殖菌丝无色至淡黄色，薄壁至稍厚壁，多分枝，频繁分隔，直径2-3μm；菌肉中骨架菌丝金黄色，厚壁，具宽或窄的内腔，不分枝，多分隔，近规则排列，直径3-4μm。菌管中生殖菌丝无色至淡黄色，薄壁至稍厚壁，少分枝，多分隔，直径2-2.5μm；菌管中骨架菌丝金黄色，厚壁，具宽或窄内腔，不分枝，不分隔，近规则排列，直径为2.5-3.7μm；子实层刚毛常见，多为腹鼓状，暗褐色，厚壁，末端尖，大小为17-30×7-11μm；子实层中无囊状体和拟囊状体；担子桶状，具4个小梗，基部具一简单分隔，大小为6-9×4-5μm。担孢子广椭圆形，黄色，厚壁，平滑，iki–，cb–，大小为(3.4-)3.6-4.6(-4.8)×(2.8-)3-3.5(-3.7)μm，平均长l=4.03μm，平均宽w=3.18μm，长宽比q=1.27(n=30/1)。

菌种分子鉴定：子实体及菌丝体经试剂盒提取dna，并以its5/its4引物扩增和测序，子实体和菌丝体共同的rdna-its序列如下：

cgatgggtactgcggaggtcattatcgagttttgaaagcgagacctgctgctggtgcgaaatcgcgcatgtgcacggtcttcgcgctcaaatccaactcaaacccctgtgcaccttatatatcgcgagtcgaagttagtagcctgaggtcttgtaagtaattagtagaagggcgaaagcgagtcttgctcgttaggtagcctttcgaaaatgaaagcgagtgcgtcgggtgaagacttcggcttgtcgttacaaaacaccttatattgtctttgtgaatgtaatgctccttgtgggcgaaaataaatacaactttcaacaacggatctcttggctctcgcatcgatgaagaacgcagcgaaatgcgataagtaatgtgaattgcagaattcagtgaatcatcgaatctttgaacgcaccttgcgccccttggtattccgaggggcatgcctgtttgagtgtcatgtttatctcaaaccgctcgtctttcttaattgaagggcttgaggtttggacttggaggtttactgctggcgcctttcgaggggtcggctcctcttaaatacattagctgggctttggctcgcgtttacggtgtaatagttgattccattcaccaacgagcgcttgcctgacgagcttgcttctagccgtccgcgtcgtcggacaaggagtcacctccttcttgacacctttgacctcaaatcaggtaggattacccgccgacttactaattaaagggggggggggggggaagaaattgaa

1.培养基配方

斜面母种培养基（pda）：马铃薯（去皮）20%，葡萄糖2%，琼脂2%，ph自然。

液体菌种培养基以百分比计：葡萄糖2%，酵母抽提物0.5%，kh2po40.1%，mgso4·7h2o0.05%，ph自然。

液体发酵培养基以百分比计：玉米粉0.3%，葡萄糖2%，蛋白胨0.1%，酵母抽提物0.5%，kh2po40.1%，mgso4·7h2o0.05%，麸皮1%，ph6。

2.培养方法

平板菌种培养方法：无菌操作，从斜面母种中取面积0.25cm²的菌种块，转接到冷却至28℃以下的平板培养基中央，置25-28℃恒温培养箱中，避光，倒置，静置培养6-10d，既得平板菌种。

液体菌种培养方法：无菌操作，500毫升三角瓶，装液量200ml，接入6-8块菌龄一致，面积约0.25cm²经活化的平板菌种，28℃、150rpm，避光振荡培养6d，即得液体菌种。

液体发酵培养方法：无菌操作，接种量10%，28℃，150rpm，避光振荡培养10d后，终止发酵并用200目纱网过滤得发酵液。

3.桑黄胞外粗多糖样品的制备

取振荡培养10d后所得桑黄发酵液，浓缩至原体积的1/10，加5倍95%乙醇，静置醇沉24h后，5000rpm离心5min得醇沉物，冷冻干燥后粉粹，过80目筛网，备用。

取适量上述醇沉物干粉末，加100倍体积的蒸馏水溶解后，50℃超声波震荡溶解3h后，磁力搅拌溶解30min，5000rpm离心10min。滤渣继续用40倍体积的蒸馏水重复溶解两次并离心，合并3次离心上清液并浓缩，冷冻干燥后即得桑黄发酵液多糖粗提物，标记为eps。

4.桑黄发酵液多糖样品的分离、纯化

取适量eps样品，用100倍蒸馏水溶解后，8000rpm离心10min除去不溶物，上清液通过葡聚糖凝胶sephadexg-100进行分级纯化。

4.1sephadex葡聚糖凝胶预处理和装柱

称取sephadexg-100葡聚糖凝胶干粉约18.0g于大烧杯中，加入蒸馏水600ml，混匀后于100℃水浴中加热溶胀1-3h，使凝胶充分溶胀的同时，杀灭其中的微生物，赶出凝胶中的气泡。后倾去上层水及漂浮的凝胶颗粒，使下层树脂稠度均匀。选用26mm×46cm凝胶柱，洗涤、平衡均采用蒸馏水进行。把层析柱垂直固定在铁架台上，先加入约1/3柱体积的蒸馏水，除去死区及塑料管内的气泡，接着将溶胀好的凝胶边搅匀边连续装入，使它们沿管壁流入在柱内自然沉降，避免产生气泡，如有气泡应排除或重装。同时打开下口慢速流出水溶液，待液面快接近凝胶面时，继续倒入凝胶，同时用玻璃棒轻轻搅拌表面层，以避免两次加入的凝胶之间形成分界层。装好后，用蒸馏水平衡2-3h至柱床体积不变为止，即可进行加样分离操作。

4.2.洗脱与收集

上样量5ml，用蒸馏水作洗脱剂，流速控制在0.5-1ml/min。分管连续收集洗脱液，每管收集10min，共收集40管，测定各奇数收集管多糖及蛋白质含量测定吸光值并绘制峰值图，根据分离结果，分别合并多糖高峰部分，冷冻干燥后保存备用。

4.3.葡聚糖凝胶柱的再生、保存

将使用过的葡聚糖凝胶用0.1mol/lnaoh和0.5mol/lnacl的混合液中浸泡0.5-1h，然后用蒸馏水反复洗至中性备用。若试验结束，则继续依次用50%乙醇、75%乙醇、95%乙醇、无水乙醇和乙醚浸泡后布氏漏斗抽干，各重复两次，然后37℃烘干后，长期保存。

5结果与分析

5.1.桑黄发酵液多糖的葡聚糖凝胶柱分离纯化

经葡聚糖凝胶g-100过柱，分离纯化，eps样品出现两个吸收峰，分别收集7-13管合并为eps1，30-32管合并为eps2。根据多糖含量测定和可溶性蛋白质含量测定的结果来看，eps1中少量蛋白质存在，可能属多糖肽类组分，为eps样品中的主成分，多糖含量为59.53%。eps2中糖峰出现处几乎检测不到蛋白质存在，多糖含量为7.07%。

实施例2抗禽流感病毒试验内容

1材料与方法

1.1供试样品

桑黄发酵液多糖eps1，eps2，由山东省应用真菌重点实验室制备并提供。

1.2供试毒株及细胞

禽流感病毒(aiv)h5n1毒株。mdck细胞。

1.3实验条件

生物安全三级实验室。

1.4细胞增殖的测定

细胞增殖的测定采用经典的mtt法。

mtt法操作步骤如下：测定前1小时，弃96孔板孔内上清，每孔100μl加入含5mg/mlmtt溶液，37℃培养。孵育时间截止后，迅速翻转96孔板，弃mtt溶液，用pbs洗96孔板，每孔100μl，弃pbs液体后，加细胞裂解液（dmso：乙醇=1:1,v/v），每孔100μl，室温振荡3-5min，待紫色晶体完全溶解，置于酶联免疫检测仪测492nm处的od值。通过公式计算细胞抑制率和病毒抑制率。

a：试验组od值，b：细胞对照组od值，c：病毒对照组od值。

1.5桑黄菌株不同提取物在mdck细胞水平的最大安全浓度测定

制备生长良好单层的mdck细胞的96孔细胞培养板。提取物母液经0.22μm滤器过滤滤菌，用维持液作为稀释液，采用2倍稀释法，稀释成5个浓度梯度。加入100μl/孔不同浓度的含样品维持液，每个浓度重复3孔，设置正常细胞对照（只加维持液），置37℃，5%co2培养箱中，继续培养72h。采用mtt法终止试验，测定od值。当加样组od值不显著低于细胞对照组od值时，即为提取物最大安全浓度。利用spss回归分析计算半数毒性浓度（cc50）。

1.6桑黄菌株提取物在mdck细胞水平的抗禽流感活性试验

体外抗aiv细胞模型中，设置正常细胞对照组（只加胞维持液），病毒对照组（只加病毒液）和无细胞的空白调零组，选取最大质量浓度2倍稀释4个浓度，设置3孔重复。弃96孔细胞培养板孔内上清，加入10000tcid50病毒液100μl/孔，设置3个重复。37℃吸附1.5h，弃病毒液上清，加入不同浓度的样液100μl/孔。置37℃，5%co2培养箱中继续培养48h。培养48h后，采用mtt法终止试验，测定od值，根据病毒抑制率公式计算病毒抑制率。当加样组的od值显著大于病毒对照组od值时，表明此样液能够显著抑制病毒感染mdck，具有一定的抗病毒活性。利用spss回归分析计算半数有效浓度（ec50）。

1.3数据分析

计算样品cc50和ec50得到si=cc50／ec50，采用选择指数（si）作为评价指标来衡量各提取物对aiv抑制的效力。用统计软件spss17.0进行duncan’s和t-test多重分析，比较试验组和病毒对照组细胞病变的差异，p<0.05表明数据存在显著差异，计量数据采用均值±标准差（±sd）表示。

2结果

表1桑黄发酵液多糖eps1和eps2细胞毒性及体外抗禽流感病毒h5n1毒株药效学结果

采用细胞水平的h5n1禽流感病毒活性检测方法测试了桑黄发酵液多糖eps1和eps2对h5n1禽流感病毒的抑制活性，其ec50分别为10.578ug/ml和0.935ug/ml（表1）。

上述2个样品对犬肾mdck细胞表现出不同强度的细胞毒性，其半数细胞死亡浓度cc50分别为17.324ug/ml和2.511ug/ml，最大安全浓度分别为7.6ug/ml和2.0ug/ml（表1）。

实验结果表明，桑黄发酵液多糖eps1和eps2的选择系数si分别为1.64和2.686，均具有良好的体外抗h5n1禽流感病毒活性，具备进一步开发新型抗禽流感病毒药物的潜力。

显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。

序列表

<110>青岛农业大学

<120>桑黄发酵液多糖在抗禽流感病毒药物中的应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>764

<212>dna

<213>桑黄(sanghuangporussanghuang)

<400>1

cgatgggtactgcggaggtcattatcgagttttgaaagcgagacctgctgctggtgcgaa60

atcgcgcatgtgcacggtcttcgcgctcaaatccaactcaaacccctgtgcaccttatat120

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