siRNA的制备方法

本申请属于核酸提取技术领域，尤其涉及一种sirna的制备方法。

背景技术：

rna干扰(rnainterference，rnai)是近年发展起来的一种阻抑基因表达的新方法，该技术可以通过双链rna的介导，降解靶基因的mrna，在转录后水平上特异性地阻断或降低靶基因的表达，达到类似基因敲除的效果，而操作比基因敲除简单，有着投入少、实验周期短等优势，是一种可以大量进行基因功能检测的高效且经济的研究方法，已经被广泛用于研究特定基因的功能。

在rnai实验中，获得小干扰rna(smallinterferingrna，sirna)是沉默靶基因的首要步骤。目前有多种方法制备sirna，其中较为常用的有化学合成法、体外转录法、体内载体表达法、sirna表达框架法、rnaseⅲ体外消化dsrna(double-strandedrna，双链rna)法等。

一个基因的不同sirna对其可能会有显著不同的抑制效果，化学合成法、体外转录法、体内载体表达法、sirna表达框架法等均需要寻找和验证最有效的sirna，因而可能会消耗更多时间。而使用rnaseⅲ消化长dsrna制备法无需验证和寻找有效地特定sirna，可以很好地解决这个问题，为研究者节省不少经费及时间。该方法主要步骤为：先通过pcr制备dna模板(在pcr引物地5’端加上t7启动子序列，以启动转录)，使用加上t7启动子序列的dna模板体外转录制备dsrna，然后使用大肠杆菌rnaseⅲ消化dsrna，形成sirna片段，去除未消化的dsrna即可纯化得到sirna混合物。该方法得到的产物含有多种不同序列的sirna，不同sirna可能存在序列的重叠，几乎可以覆盖整个靶区段，不必筛选有效片段即可保证可有效降解靶mrna，适合快速经济地研究某一基因功能缺失的表型。然而rnaseⅲ消化长dsrna除了产生12-30bp的短的dsrna，也产生一些＞30bp的dsrna。在哺乳动物细胞中，长度超过30bp的长dsrna不仅无法触发细胞中的rnai，而且会激活通常由ifn诱导的dsrna依赖的激酶pkr和2'-5'-寡腺苷酸合成酶。激活的pkr通过磷酸化翻译因子真核起始因子2α来抑制翻译过程，而2'-5'-寡腺苷酸合成酶则通过激活rnasel引起非特异性mrna降解，从而对细胞会产生毒性作用。因此，需要对rnaseⅲ消化后的产物进行纯化，以获得较纯的12-30bp的sirna。

dsrna的分子量＝碱基数(bp)x680da/bp，那么30bpdsrna对应的分子量即为20.4kda。因此，目前普遍采用30kda的超滤管纯化rnaseⅲ消化后的dsrna混合物。然而，超滤管价格昂贵，不适用于需要研究多个基因的大量制备sirna；而且超滤管纯化在上样前需要将rnaseⅲ消化的混合物稀释，导致纯化的sirna浓度较低，需要再次进行sirna浓缩步骤，操作较繁琐。

因此，相关技术有待改进。

技术实现要素：

本申请的目的在于提供一种sirna的制备方法，旨在解决现有rnaseⅲ体外消化dsrna制备sirna成本高、步骤繁琐的技术问题。

为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：

本申请提供一种sirna的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

体外转录获得目的基因的dsrna；

用rnaseⅲ对所述目的基因的dsrna进行消化处理，得到消化产物；

将所述消化产物凝胶电泳后，切割核酸片段＜30bp的胶块；

将所述胶块研磨冻融后，获得sirna。

本申请构建一种简单的sirna的制备方法，该制备方法是对现有rnaseⅲ体外消化dsrna法进行改进，具体地，该制备方法基于rnaseⅲ消化体外转录获得目的基因的dsrna，然后对消化产物凝胶电泳以切割核酸片段＜30bp的胶块，通过对该胶块研磨冻融后，释放出sirna。该制备方法可以有效去除rnaseⅲ消化产物中＞30bp的dsrna片段，具有准确有效、操作简便、成本低廉的特点，为纯化sirna以及rnai研究带来极大的方便，具有很好的应用前景。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本申请实施例提供的以含t7启动子序列的完整引物扩增unigene7122含t7启动子序列dna的琼脂糖凝胶电泳图；其中：m.dl15000dnamarker，1.含t7启动子序列的unigene7122扩增结果，2.阴性对照；

图2是本申请实施例提供的以含t7启动子序列的完整引物扩增unigene12835、unigene19308含t7启动子序列dna的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m.dl2000dnamarker；1.阴性对照(t7-u12835f1、t7-u12835r1)，2.含t7启动子序列的unigene12835(t7-u12835f1、t7-u12835r1)扩增结果，3.阴性对照(t7-u12835f2、t7-u12835r2)，4.含t7启动子序列的unigene12835(t7-u12835f2、t7-u12835r2)扩增结果，5.阴性对照(t7-u19308f1、t7-u9308r1)，6.含t7启动子序列的unigene19308(t7-u19308f1、t7-u9308r1)扩增结果，7.阴性对照(t7-u19308f2、t7-u9308r2)，8.含t7启动子序列的unigene19308(t7-u19308f2、t7-u9308r2)扩增结果；两个基因后续实验分别使用引物t7-u12835f1、t7-u12835r1和t7-u19308f1、t7-u9308r1；

图3是本申请实施例提供的以含t7启动子序列的完整引物扩增unigene13423等5个基因含t7启动子序列dna的琼脂糖凝胶电泳图；其中：m.dl2000dnamarker，1.含t7启动子序列的unigene13423扩增结果，2.含t7启动子序列的cl1989.contig1扩增结果，3.含t7启动子序列的cl3290.contig2扩增结果，4.含t7启动子序列的cl3871.contig2扩增结果，5.含t7启动子序列的cl51.contig2扩增结果；

图4是本申请实施例提供的unigene12835等8个基因的dsrna及酶切后sirna产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中：m1.dl2000dnamarker，m2.20bpdnaladdermarker，1.unigene12835dsrna，2.unigene12835sirnamix，3.unigene13423dsrna，4.unigene13423sirnamix，5.unigene19308dsrna，6.unigene19308sirnamix，7.unigene7122dsrna，8.unigene7122sirnamix，9.cl1989.contig1dsrna，10.cl1989.contig1sirnamix，11.cl3290.contig2dsrna，12.cl3290.contig2sirnamix，13.cl3871.contig1dsrna，14.cl3871.contig1sirnamix，15.cl51.contig3dsrna，16.cl51.contig3sirnamix；

图5是本申请实施例提供的unigene12835、unigene19308基因的sirna纯化产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m.dl5000dnamarker，1.unigene12835未纯化的sirnamix，2.unigene12835纯化含goldview的sirna，3.unigene12835纯化不含goldview的sirna，4.unigene19308未纯化的sirnamix，5.unigene19308纯化含goldview的sirna，6.unigene19308纯化不含goldview的sirna；

图6是本申请实施例提供的cl3290.contig2、cl51.contig2基因的sirna纯化产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m.20bpdnaladdermarker，1.cl3290.contig2未纯化的sirnamix，2.cl3290.contig2纯化含goldview的sirna，3.cl3290.contig2纯化不含goldview的sirna，4.cl51.contig3未纯化的sirnamix，5.cl51.contig3纯化含goldview的sirna，6.cl51.contig3纯化不含goldview的sirna；

图7是本申请实施例提供的unigene13423基因的sirna纯化产物的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m.20bpdnaladdermarker，1.unigene13423未纯化的sirnamix，2.unigene13423纯化含goldview的sirna，3.unigene13423纯化不含goldview的sirna；

图8是本申请实施例提供的unigene12835经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以nc组为对照的相对表达量，(b)以mock组为对照的相对表达量；

图9是本申请实施例提供的unigene19308经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以nc组为对照的相对表达量，(b)以mock组为对照的相对表达量；

图10是本申请实施例提供的cl51.contig3经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以nc组为对照的相对表达量，(b)以mock组为对照的相对表达量；

图11是本申请实施例提供的unigene13423经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以nc组为对照的相对表达量，(b)以mock组为对照的相对表达量；

图12是本申请实施例提供的cl3290.contig2经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)；其中，(a)以nc组为对照的相对表达量，(b)以mock组为对照的相对表达量；

图13是用rnaseⅲ对cl3290.contig2dsrna消化后未纯化的cl3290.contig2sirnamix与本申请实施例提供的经纯化后的cl3290.contig2sirna对目的基因cl3290.contig2经过靶向干扰后的基因相对表达量(以β-actin为内参基因)对比图；其中，(a)以nc组为对照的相对表达量，(b)以mock组为对照的相对表达量；

图14是对比例1用30k超滤管纯化sirna的琼脂糖凝胶电泳图；其中，m.20bpdnaladdermarker，1.unigene13423dsrna，2.unigene13423未纯化的sirnamix，3.unigene13423sirnamix经30k超滤管流出样，4.unigene13423sirnamix经30k超滤管截留样，5.unigene7122dsrna，6.unigene7122未纯化的sirnamix，7.unigene7122sirnamix经30k超滤管流出样，8.unigene7122sirnamix经30k超滤管截留样。

具体实施方式

为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。

本申请实施例提供一种sirna的制备方法，该制备方法包括如下步骤：

s01：体外转录获得目的基因的dsrna；

s02：用rnaseⅲ对所述目的基因的dsrna进行消化处理，得到消化产物；

s03：将所述消化产物凝胶电泳后，切割核酸片段＜30bp的胶块；

s04：将所述胶块研磨冻融后，获得sirna。

本申请构建一种简单的sirna的制备方法，该制备方法是对现有rnaseⅲ体外消化dsrna法进行改进，具体地，该制备方法基于rnaseⅲ消化体外转录获得目的基因的dsrna，然后对消化产物凝胶电泳以切割核酸片段＜30bp的胶块，通过对该胶块研磨冻融后，释放出sirna。该制备方法可以有效去除rnaseⅲ消化产物中＞30bp的dsrna片段，具有准确有效、操作简便、成本低廉的特点，为纯化sirna以及rnai研究带来极大的方便，具有很好的应用前景。

步骤s01中，所述体外转录获得目的基因的dsrna的步骤包括：将总rna反转录得到cdna，用含有t7启动子的引物扩增所述cdna，然后进行体外转录，并用核酸酶消化。通过不同的含有t7启动子的引物设计，可以扩增所述cdna中不同目的基因，从而最终可以制备得到针对该目的基因的sirna。总rna的提取可以使用takara公司的rnaisoplus试剂盒进行；反转录可以通过takara公司的试剂盒primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit进行；含有t7启动子的引物可以自行设计，可以先使用软件primerpremier5设计各基因的引物，然后在正反向引物的5’端分别加上t7启动子序列，作为完整的引物扩增所研究的目的基因部分长度片段。本实施例中添加的t7启动子序列为：5'-taatacgactcactatagggaga-3'。在本申请实施例中，目的基因选用了unigene12835，unigene13423，unigene19308，unigene7122，cl1989.contig1，cl3290.contig2，cl3871.contig1，cl51.contig3等。

本申请中，为验证该sirna的提取效果，对鲤鱼上皮瘤细胞(epc)进行转录组测序，从中获得基因转录本(mrna)的部分序列编号以及功能注释：具体地，编号unigene12835预测为4f2cell-surfaceantigenheavychain-like[sinocyclocheilusrhinocerous]，编号unigene19308预测为lysosomemembraneprotein2-like[sinocyclocheilusrhinocerous]，编号unigene13423预测为niemann-pickc1protein-like[sinocyclocheilusrhinocerous]，编号unigene7122预测为aminopeptidasen-like[sinocyclocheilusrhinocerous]，编号cl1989.contig1为neuralcelladhesionmolecule1aprecursor[daniorerio]，编号cl3290.contig2为erythrocyteband7integralmembraneproteinisoformx2[daniorerio]，编号cl3871.contig1为sourceofimmunodominantmhc-associatedpeptides[ctenopharyngodonidella]，编号cl51.contig3预测为predicted:transferrinreceptorprotein1-like[sinocyclocheilusanshuiensis]，以上述为目的基因进行对应的sirna的提取。

在步骤s02中的所述消化处理中，rnaseⅲ浓度为0.5-1.5u/μl，优选0.5-1.5u/μl，这样浓度的消化反应体系消化效果更好。并通过rnaseⅲ消化dsrna获得片段较小的，包括12-30bpsirna的dsrna混合物。

在步骤s03中，所述凝胶电泳是浓度为3％的琼脂糖凝胶电泳。紫外下切下核酸片段＜30bp的sirna的胶块，从而可以有效去除rnaseⅲ消化产物中＞30bp的dsrna片段，然后经过研磨冻融即可释放出针对目的基因的sirna。

进一步地，所述研磨冻融的步骤包括：将所述胶块切碎后，依次冰冻和解冻融化，然后加水研磨。其中，所述冰冻的温度为-80℃～0℃，所述解冻融化的温度为20℃-27℃，上述温度范围可以更好地进行冰冻和解冻融化。而研磨可以使用电动研磨枪彻底研磨。所述研磨冻融的步骤重复2-4次，这样可以彻底释放目的基因的sirna，以提高提取的浓度。

进一步地，所述加水研磨后，还包括离心取上清。反复冻融融化胶块，释放出sirna，离心取上清获得纯化的sirna。在一实施例中，所述目的基因为unigene12835，得到的所述sirna为unigene12835sirna；或者，所述目的基因为unigene13423，得到的所述sirna为unigene13423sirna；所述目的基因为unigene19308，得到的所述sirna为unigene19308sirna；所述目的基因为unigene7122，得到的所述sirna为unigene7122sirna；所述目的基因为cl1989.contig1，得到的所述sirna为cl1989.contig1sirna；所述目的基因为cl3290.contig2，得到的所述sirna为cl3290.contig2sirna；所述目的基因为cl3871.contig1，得到的所述sirna为cl3871.contig1sirna；所述目的基因为cl51.contig3，得到的所述sirna为cl51.contig3sirna。

通过上述制备方法，可以获得高纯度的sirna，后续可以将得到的sirna用于转染鲤鱼上皮瘤细胞以检测靶基因沉默效果；在一实施例中，上述制备方法所述获得sirna之后，还包括配制成浓度为0.1nmol/l-0.5nmol/l的所述sirna用于转染。本申请实施例将制备的sirna转染至鲤鱼上皮瘤细胞(epc)，具体地，提取细胞rna，反转录成cdna，以cdna作为模板进行qrt-pcr反应，以β-actin作为内参，采用2^-△△ct法计算目的基因相对表达量，结果发现sirna终浓度为0.5nmol/l时靶基因相对表达量下调50％左右。通过将终浓度为0.5nmol/l未纯化的cl3290.contig2sirnamix与纯化的cl3290.contig2sirna分别转染epc细胞，比较未纯化的cl3290.contig2sirnamix与纯化的cl3290.contig2sirna对靶基因沉默效果的差异，发现通过搅碎冻融法纯化的cl3290.contig2sirna对靶基因沉默效果明显高于未纯化的cl3290.contig2sirnamix，验证了搅碎冻融法纯化sirna的有效性。

本申请通过体外转录获得靶基因的dsrna，经rnaⅲ消化获得小片段的dsrna，通过切胶回收、搅碎冻融法纯化了rnaseⅲ消化的sirna混合物，得到较纯的sirna，并用纯化的sirna转染epc细胞检测靶基因沉默效果，发现sirna终浓度为0.5nmol/l时对靶基因表达下调50％左右。因此，本申请可以实现简便、低成本并且高效纯化sirna的目的，在rnai研究中具有重要的应用价值。

下面结合具体实施例进行说明。

实验材料与试剂

主要材料：鲤鱼上皮瘤细胞(epc)；

主要试剂：sirnanc由广州锐博生物公司提供，转染试剂rnaimaxreagent购自invitrogen公司，10％fbs无双抗的mem培养基，不含双抗和fbs的mem培养基、opti-mem培养基购自gibco公司，rnaikit购自thermo公司，rnaseⅲ(e.coli)购自ambio公司，rna提取试剂盒rnaisoplus、反转录试剂盒primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit、实时荧光定量pcr试剂盒tbgreen^tmpremixextaq^tmii(tlirnasehplus)购自宝生物工程(大连)有限公司(大连takara公司)。

实施例1

一、提取epc细胞的总rna

使用takara公司的rnaisoplus试剂盒进行epc的总rna提取，具体操作步骤如下：

(1)收集细胞：吸出细胞培养基，用pbs清洗细胞一次；

(2)每10cm²生长的培养细胞加入1-2ml的rnaisoplus试剂，轻轻晃动，确保裂解液均匀分布于细胞表面；

(3)将内含细胞的裂解液转移至离心管中，用移液枪反复吹吸直至裂解液中无明显沉淀；

(4)室温静置5min，然后从核蛋白中分离rna；

(5)向上述步骤(4)的匀浆裂解液中加入氯仿(rnaisoplus的1/5体积量)，盖紧离心管盖，混合至溶液乳化呈乳白色；

(6)室温静置5min；；

(7)12,000g，4℃离心15min。从离心机中小心取出离心管，此时匀浆液分为三层，即：无色的上清液(含rna)、中间的白色蛋白层(大部分为dna)及带有颜色的下层有机相；

(8)吸取上清液转移至另一新的离心管中(切勿吸出白色中间层)；

(9)向上清中加入0.5-1倍rnaisoplus体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，置于室温下静置10分钟；

(10)12,000g，4℃离心10min。一般在离心后，试管底部会出现rna沉淀；

(11)小心弃去上清,切勿触及沉淀，残留少量异丙醇没有关系。加入与rnaisoplus等量的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤离心管管壁，7,500g，4℃离心5min后小心弃去上清，切勿触及沉淀；

(12)打开离心管盖，室温干燥沉淀几分钟。沉淀干燥后，加入适量的rnase-free水溶解沉淀即为epc的总rna；

(13)nanodrop检测所提取rna的浓度及质量，并提供琼脂糖凝胶电泳检测所提取rna的完整性。

二、rna的反转录

以上一步骤所提取的总rna为模板，使用takara公司的试剂盒primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit进行反转录，具体流程如下：

(1)按表1(变性反应液配制表)的比例成分在冰上配制反应液的预混液，分装到各反应管中，最后再分别加入模板，将模板与反应液混匀。65℃保温5min后，冰上迅速冷却；

表1

(2)按表2(反转录反应液配置表)的比例成分在冰上配制反转录反应液的预混液，然后取10μl分别添加到上述的各管变性后反应液中；

表2

轻轻混匀后，按照以下条件进行反转录反应：

30℃10min，42℃30min，95℃5min；

然后置于冰上放置，得到epc细胞的cdna，若暂时不用于下一步骤可以存放于-20℃。

三、制备dna模板

(1)使用软件primerpremier5设计各基因的引物，然后在正反向引物的5’端分别加上t7启动子序列，作为完整的引物扩增所研究的基因部分长度片段。本实验添加的t7启动子序列为：5'-taatacgactcactatagggaga-3'；

(2)以epc细胞的cdna为模板，用上述所设计的引物，按照表3(制备dna模板反应体系)配制反应液，制备dsrna的dna模板；

表3

(3)先使用基因特异引物(不包含t7启动子序列)的tm值加5℃作为退火温度反应五个循环，再使用完整引物(即基因特异引物加上t7启动子序列)的tm值加5℃作为退火温度循环35个循环进行pcr反应；

(4)琼脂糖凝胶电泳验证产物特异性其目的条带大小，并将扩增产物送公司测序验证其序列。

四、制备目的基因dsrna

(1)第一次使用megascriptrnaikit之前，往2×washsolution加入12mlacs或者更高级别的无水乙醇，即为washingsolution混合均匀后室温保存；

(2)从冰箱取出t7enzymemix直接置于冰上，因为它储存在甘油中，-20℃下不会结冰；

(3)将10×t7reactionbuffer和4种脱氧核苷酸溶液(atp,ctp,gtp,和utp)进行涡旋，一旦解冻立马将4种脱氧核苷酸溶液置于冰上，而10×t7reactionbuffer继续放在室温；

(4)按照表4(体外转录反应体系)在室温下配置反转录反应液，充分混匀反应液，轻弹反应管或者上下吹打然后短暂离心至管子底部，37℃孵育2.5h；

表4

(5)75℃孵育5min，然后自然冷却至室温退火形成dsrna，切勿放在冰上冷却；注：对于≤800nt的dsrna合成反应来说，可不进行退火反应；而对于≥800nt的dsrna合成，则需进行退火反应；

(6)使用te(10mmol/ltris，1mmol/ledta)或者loadingbuffer按1:100比例稀释dsrna，取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测双链形成的完整性及形成效率；

(7)按照表5(核酸酶消化反应体系)在冰上制备rnase消化反应液，然后37℃孵育1h，以除去dna及ssrna。

表5

五、纯化dsrna

(1)按照表6(dsrnabindingmix配方)的配方配制dsrnabindingmix，轻柔地上下吹打混匀；

表6

(2)将上述500μldsrnabindingmix加到超滤管的过滤器上，13,000rpm离心2min，弃滤液，将滤芯放到收集管中；

(3)取500μlwashingsolution到过滤器上，离心弃滤液，重复两次；弃滤液后再空管离心10-30s，以除去残留的液体；

(4)往过滤器加入50μl预热的elutionsolution(≥95℃)，然后13,000rpm离心2min；

(5)重复步骤(4)，再使用50μlelutionsolution洗脱dsrna到同一收集管中。

(7)测上述产物的rna浓度，然后保存于-20℃；

(7)使用te(10mmol/ltris，1mmol/ledta)或者loadingbuffer按1:5比例稀释dsrna，取5μl进行1％琼脂糖凝胶电泳，检测纯化的dsrna的完整性及双链形成效率。

六、rnaseⅲ消化dsrna

(1)按照表7(rnaseⅲ消化反应体系)配制反应液，混合均匀；

表7

(2)37℃孵育1.5h。

七、搅碎冻融法纯化sirna

将上述dsrna的rnaseⅲ消化产物即sirnamix进行纯化，具体步骤如下。

(1)同时配制大小一致且浓度均为3％的琼脂糖核酸胶，其中一块加入goldview，另外一块不加；

(2)将dsrna的rnaseⅲ消化产物平均分为两份，一份上样于含goldview的核酸胶，另一份上样于不含goldview的核酸胶。注意上样的孔保持一致，两块胶置于同一电泳槽中同时进行电泳；

(3)紫外照射下，含goldview的核酸胶在20bp左右可以看到有明显的条带，此为sirna的目的条带，而不含goldview的核酸胶理论上在同一位置也有相同条带；

(4)将两块胶完全重叠在一起，在紫外灯下切下20bp的目的条带，分别回收到干净的ep管中；

(5)将胶块尽可能切碎，然后置于-80℃冰冻；

(6)将冻结后的胶块取至室温(25℃)解冻融化，加入适量ddh2o，然后使用电动研磨枪进行研磨；

(7)重复步骤(5)、(6)三次，确保胶块完全捣碎；

(8)4℃，12,000rpm离心10min；

(9)用移液枪小心吸取上清转移至干净的离心管中，即为纯化好的sirna。使用nanodrop检测所纯化sirna的浓度，然后计算其摩尔浓度；

(10)琼脂糖凝胶电泳检测纯化效果。

实验结果：

将制备得到的cdna为模板，分别使用设计的含t7启动子序列的完整引物扩增各靶基因含t7启动子序列的dna，用作后续制备dsrna的dna模板，将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，验证扩增片段的大小及特异性。如图1、图2、图3所示，各基因均扩增出单一明亮的条带，扩增片段大小与预测大小相符，扩增产物测序正确。

rnaseⅲ充分消化dsrna，最终产生的小片段dsrna的介于12-30bp之间。从图4可以看到，8个研究基因的dsrna经rnaseⅲ消化后，片段大小主要为20bp左右，没有看到明显的大片段条带，可见rnaseⅲ消化较为充分，初步获得了各基因的sirna混合物。但是从图中可以看到，rnaseⅲ消化产物中仍有一些dsrna混合物处于20-100bp之间。

为避免酶切后得到的sirnamix中含有的长片段对细胞会产生毒性作用，从中挑取5个sirnamix进行琼脂糖凝胶电泳，然后将20bp左右的条带进行切胶回收，捣碎并且反复冻融，以期sirna从中释放出来，得到不含＞30bp片段的sirna。将纯化产物进行琼脂糖凝胶电泳，从图5、图6、图7中可见，未纯化的sirnamix确实存在一定较长片段，而经过纯化后，电泳条带单一而且大小为20bp左右，说明基本上去除了这些大片段，得到纯度较高的sirna。

实施例2

一、sirna转染epc

(1)前一日接种epc细胞：使用含10％fbs不含双抗的mem培养基将epc接种至24孔板，使得次日细胞贴壁后覆盖率为60％-80％。每个实验组设置3个重复孔；

(2)制备sirna-lipid复合体：

①首先使用opti-mem分别稀释rnaimaxreagent和上述制备的sirna，按照适当倍数稀释sirna，脂质体的稀释按照每孔1.5μlrnaimaxreagent+23.5μlopti-mem的比例进行稀释；

②将稀释好的sirna与脂质体按照体积比1:1的比例混合，室温孵5min。因rnaseⅲ消化得到的sirna只要较低的浓度就可以达到化学合成sirna较高浓度得到的效果，结合实验前期探索高浓度25nmol/l、10nmol/l、5nmol/l甚至1nmol/l时基因表达下降率不高，故本研究设置转染时设置较低浓度，每个基因sirna终浓度分别设置0.1nmol/l与0.5nmol/l两个浓度；

实验对照组设置如下：

a)正常细胞对照组(blank组)：未经任何转染处理的细胞，用于观测整个实验过程细胞的生长状态及分析的参考；

b)转染试剂对照组(mock组)：使用转染试剂进行转染，但是不加入sirna，用于排除转染试剂对细胞可能的影响及分析参考；

c)阴性对照组(nc组)：使用锐博生物公司提供的通用型阴性对照sirna进行转染，用于分析目的基因sirna作用的参照；

(3)每个孔加入50μlsirna-lipid复合体，最终转染体系为500μl，将细胞置于25℃、5％co2培养；

(4)收集样品：转染24h后，收集各个孔的细胞及培养液至新的ep管中。

二、rna反转录

将上述收集的样品反复冻融三次，作为反转录的模板，再使用takara公司的试剂盒primescript^tm1ststrandcdnasynthesiskit进行反转录，步骤与前面的rna反转录相同。

三、检测各基因沉默效果

使用实时荧光定量pcr(quantitativereal-timepcr，qrt-pcr)的方法检测所研究的八个基因的mrna转录水平的变化。

(1)上述反转录得到的cdna分别稀释100倍，作为qrt-pcr模板，以靶基因设计引物，使用takara公司的tbgreen^tmpremixextaqtmⅱ(tlirnasehplus)试剂盒进行qrt-pcr。实验时按照表8(qrt-pcr反应体系)的反应体系，冰上配制好试剂预混液，依次分装到384反应板中，最后加cdna模板，每个样品设置三个重复孔。

表8

(2)使用以下反应程序进行荧光定量pcr:

95℃1min

(3)各个反应体系均以β-actin的荧光定量pcr产物为内参照，计算各个目的基因的基因表达相对量，釆用2^-△△ct法计算目的基因相对表达量。

实验结果：

将各基因经搅碎冻融法纯化的sirna转染至epc细胞后，以鲤鱼的β-actin基因的表达量作为对照，分析各基因的相对表达量，以检测各sirna对其靶基因的沉默效果。

(1)unigene12835的沉默结果

如图8(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的unigene12835sirna转染epc24h后，与nc组相比，两个浓度处理的细胞的unigene12835均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

如图8(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的unigene12835sirna转染epc24h后，与mock组相比，两个浓度处理的细胞的unigene12835均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

综上，与nc和mock组相比，unigene12835在rna干扰后表达水平均出现显著下调，其中0.5nmol/l的沉默效果更好，但0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异。

(2)unigene19308的沉默结果

如图9(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的unigene19308sirna转染epc24h后，与nc组相比，两个浓度处理的细胞的unigene19308均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

如图9(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的unigene19308sirna转染epc24h后，与mock组相比，两个浓度处理的细胞的unigene19308均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

综上，与nc和mock组相比，unigene19308在rna干扰后表达水平均出现显著下调，但0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异。

(3)cl51.contig3的沉默结果

如图10(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的cl51.contig3sirna转染epc24h后，与nc组相比，两个浓度处理的细胞的cl51.contig3均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

如图10(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的cl51.contig3sirna转染epc24h后，与mock组相比，两个浓度处理的细胞的cl51.contig3均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

综上，与nc和mock组相比，cl51.contig3在rna干扰后表达水平均出现显著下调，但0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异。

(4)unigene13423的沉默效果

如图11(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的unigene13423sirna转染epc24h后，与nc组相比，两个浓度处理的细胞的unigene13423均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

如图11(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的unigene13423sirna转染epc24h后，与mock组相比，两个浓度处理的细胞的unigene13423均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

综上，与nc和mock组相比，unigene13423在rna干扰后表达水平均出现显著下调，但0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异。

(5)cl3290.contig2的沉默效果

如图12(a)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的cl3290.contig2sirna转染epc24h后，与nc组相比，两个浓度处理的细胞的cl3290.contig2均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

如图12(b)所示，分别使用搅碎冻融法纯化的终浓度0.1nmol/l和0.5nmol/l的cl3290.contig2sirna转染epc24h后，与mock组相比，两个浓度处理的细胞的cl3290.contig2均出现显著性下调(p＜0.05)，0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异；

综上，与nc和mock组相比，cl3290.contig2在rna干扰后表达水平均出现显著下调，其中0.5nmol/l的沉默效果更好，但0.1nmol/l和0.5nmol/l两个浓度的沉默效果无显著差异。

(6)比较未纯化与纯化的sirna引起的靶基因沉默效果差异

使用终浓度为0.5nmol/l未纯化的cl3290.contig2sirnamix与本申请上述实施例提供的经纯化的cl3290.contig2sirna分别转染epc24h后，如图13(a)所示，与nc组相比，纯化的cl3290.contig2sirna对靶基因沉默效果明显高于未纯化的cl3290.contig2sirnamix；如图13(b)所示，与mock组相比，纯化的cl3290.contig2sirna对靶基因沉默效果也明显高于未纯化的cl3290.contig2sirnamix。

对比例1

将rnaseⅲ消化后的dsrna混合物(步骤参见实施例1)使用30kda的超滤管进行纯化，即：将rnaseⅲ消化后的混合物稀释5倍加载到30kda超滤管中，将超滤管插入配套的微量ep管中，14000g离心20min，收集流出液，理论上即为＜30bp的sirna，将超滤管倒扣在一个干净的1.5mlep管中，1000g离心两分钟，收集截留液，理论上即为＞30bp的长dsrna。

结果如图14所示，经过30k超滤管纯化，收集的流出液与截留液中均含有＜30bp的sirna，截留液中＜30bp的sirna反而比流出液中多。并且，从图14可知：unigene13423sirnamix和unigene7122sirnamix经30k超滤管流出样中含有大部分＞30bp的sirna，可见30k超滤管截留效果不明显，因此不宜适用于sirna纯化。

综上，本申请实施例在rnaseⅲ消化dsrna获得片段大小不一的混合物的基础上，通过琼脂糖凝胶电泳、切胶后搅碎冻融纯化sirna，与30k超滤管纯化sirna相比，具有以下优点：①操作简便。纯化sirna仅需经过琼脂糖凝胶电泳，胶块研磨冻融等简单步骤，只要具备电泳仪和超低温冰箱的普通分子实验室均可进行，并且无需经过复杂sirnamix稀释以及乙醇浓缩等步骤。②成本低廉。搅碎冻融纯化sirna只需要购买琼脂糖，市售价格约为150元/100g，按照一块琼脂糖凝胶需要0.5g琼脂糖配制，可以上样11个孔进行电泳，则每纯化11个sirna成本为7.5元。30k超滤管市售价格约为1423元/24个，不考虑额外的乙醇浓缩等步骤，通过30k超滤管同样纯化11个sirna成本约为652元，远远高于搅碎冻融纯化sirna。③纯化效果好。搅碎冻融法纯化sirna通过琼脂糖凝胶电泳之后，准确切下＜30bp的sirna进行纯化，纯化的sirna绝对不含＞30bp的rnaseⅲ消化产物，纯化效果好。而经过30k超滤管纯化sirna，收集的流出液与截留液中均含有＜30bp的sirna，并且流出样中含有大部分＞30bp的sirna，纯化效果不明显。

以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。