一种云芝糖肽的制备方法与流程

本发明属于生物提取
技术领域：
，涉及一种从云芝菌丝体中提取云芝糖肽的方法，具体涉及一种用云芝发酵液分离后的滤液代替水提取云芝干料，以降低能源消耗，节约成本的提取方法。
背景技术：
：云芝糖肽，是从多孔菌科植物云芝菌丝体中提取的高分子糖肽聚合物。具有补益精气，健脾养心的，对细胞免疫功能和血象也有一定的保护作用。用于食管癌、胃癌及原发性肺癌患者放、化疗所致的气阴两虚、心脾不足症。目前，大规模工业化生产与注册工艺的云芝糖肽为分开制备。利用云芝菌粉加水提取制备云芝胞内糖，利用云芝发酵液分离得滤液制备云芝胞外糖，将云芝胞内糖与胞外糖按照一定比例混合制备成云芝糖肽。此方法分开制备云芝胞内糖与云芝胞外糖，需蒸发水量较大，蒸汽能耗大，成本高。技术实现要素：本发明的目的是克服上述不足之处提供一种降低工业化生产云芝糖肽的蒸汽消耗，减少生产成本的云芝糖肽的制备方法。该方法通过将发酵液分离后的滤液代替水提取云芝菌粉实现降低水使用，减少蒸汽消耗，节约成本，又能同时得到云芝胞内糖与云芝胞外糖。本发明的目的是通过以下方式实现的：取云芝菌粉与云芝发酵液滤液混合，煮沸提取2次，每次2～3h，每次按照1:10(kg/l)的比例进行混合，冷却至室温，离心，收集上清液，将两次上清液浓缩至原体积的1/5～1/20；加入乙醇4℃醇沉过夜；醇沉后液体离心，收集沉淀，烘干。所述的云芝菌粉是将云芝发酵液分离得到云芝菌丝体与滤液，对云芝菌丝体进行干燥，粉碎，过40～60目筛得到的；所述的云芝发酵液滤液是通过以下步骤得到的：将菌株转接到斜面培养基26～28℃常规培养7天，得活化的云芝菌株；将活化好的云芝菌株接种于种子培养基，其中种子培养基组成为葡萄糖6％，酵母粉4％，蛋白胨5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.02％，消泡剂0.1％，用水配制，ph值自然，26～28℃振荡培养3天得云芝一级种子液；将一级种子液接入二级种子培养基，其中二级种子培养基组成为葡萄糖4％，酵母粉4％，蛋白胨4％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.02％，消泡剂0.1％，用水配制，ph值自然，26～28℃培养3天，接种量1％，通气1：0.4～0.8vvm；将二级种子培养基接入发酵培养基，其中发酵培养基组成为葡萄糖3％，酵母粉4％，蛋白胨4％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.02％，消泡剂0.1％，用水配制，ph值自然，26～28℃培养4天，接种量3％，通气1：0.3～0.5vvm，发酵结束即为云芝发酵液。上述离心条件优选为4000r/min条件下离心5min。优选上述将两次上清液浓缩至原体积的1/5～1/15。优选醇沉时加入95％乙醇，使乙醇浓度为55％～75％，4℃醇沉过夜。最优选乙醇浓度为65％。优选上述烘干条件为65℃-75℃。本发明将发酵液分离得到的滤液代替水提取云芝干菌丝，节约水消耗，节约浓缩时蒸汽成本，可同时获得云芝胞内糖与胞外糖。与现有技术相比本发明有如下优点与效果：1)发酵液分离后的滤液也是水的一种，含有云芝胞外糖，本发明利用滤液代替水提取云芝菌粉，充分利用原材料，同时制备云芝胞内糖与胞外糖。2)本发明方法可节约水的使用50％，还能减少蒸汽蒸发水的能耗，显著节约成本。3)制备过程简单，易于控制，第一批云芝菌粉可以与后续生产的云芝发酵液分离得滤液进行提取，特别适用于大规模的工业生产。附图说明图1为标样与实施例1、实施例3样品的色谱图，标样购买自中国食品药品检定研究院。具体实施方式以下通过具体实施例对本发明进行进一步解释说明：云芝发酵液来源：由中国普通微生物菌种保藏管理中心提供变色栓菌(云芝)，trametes，保藏号cgmcc5.161。将菌株转接到斜面培养基26～28℃常规培养7天，得活化的云芝菌株；将活化好的云芝菌株接种于种子培养基，其中种子培养基组成为葡萄糖6％，酵母粉4％，蛋白胨5％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.02％，消泡剂0.1％，用水配制，ph值自然，26～28℃振荡培养3天得云芝一级种子液；将一级种子液接入二级种子培养基，其中二级种子培养基组成为葡萄糖4％，酵母粉4％，蛋白胨4％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.02％，消泡剂0.1％，用水配制，ph值自然，26～28℃培养3天，接种量1％，通气1：0.4～0.8vvm；将二级种子培养基接入发酵培养基，其中发酵培养基组成为葡萄糖3％，酵母粉4％，蛋白胨4％，磷酸二氢钾0.2％，硫酸镁0.02％，消泡剂0.1％，用水配制，ph值自然，26～28℃培养4天，接种量3％，通气1：0.3～0.5vvm，发酵结束即为云芝发酵液。云芝菌粉是将云芝发酵液分离得到云芝菌丝体与滤液，对云芝菌丝体进行干燥，粉碎，过40～60目筛得到的。实施例1：云芝发酵液分离后的菌粉烘干后，粉碎至过60目筛制成云芝菌粉。取云芝菌粉1kg，加10l纯化水，置于圆底烧瓶于电热套100℃煮沸提取，提取次数为2次，每次3h，将得到的提取液4000r/min条件下离心5min，得上清液，将上清液浓缩至1000ml，一共需要蒸发19l水，加入95％乙醇使醇沉时乙醇浓度为65％，4℃醇沉过夜，将醇沉后液体4000r/min条件下离心5min，收集沉淀，置于75℃下烘干。实施例2：取云芝发酵液分离后的滤液20l，浓缩至1l，需要蒸发19l水，再加入95％乙醇使醇沉时乙醇浓度为65％，4℃醇沉过夜，将醇沉后液体4000r/min条件下离心5min，收集沉淀，置于75℃下烘干。实施例3：取云芝菌粉1kg，粉碎，过40～60目筛，加入实施例2中的同批次云芝发酵液分离后的滤液(10l)，置于圆底烧瓶于电热套煮沸提取3h，冷却至室温，将得到的提取液4000r/min条件下离心5min，得上清液，残渣加入滤液(10l)置于圆底烧瓶于电热套煮沸提取3h，冷却至室温，将得到的提取液4000r/min条件下离心5min，得上清液，将两次上清液浓缩至2000ml，加入95％乙醇使乙醇浓度为65％，4℃醇沉过夜，将醇沉后液体4000r/min条件下离心5min，收集沉淀，置于75℃下烘干。表1为将实施例1-3中有效成分进行检测所得的检测结果，其中，总糖与肽的检测方法按照国家药品标准ws-xg-021-2002。表1云芝糖肽检测结果样品干得g总糖％肽％实施例1142.848.622.3实施例2102.622.725.3实施例1+实施例2245.437.823.1实施例3252.637.223.5实施例1方法制备得到的是云芝胞内糖，实施例2方法制备得到的是云芝胞外糖。实施例3制备的云芝糖肽与实施例1、实施例2制备的混合云芝糖肽在得率、总糖含量、肽含量差异看似不大，但实施例3蒸发掉的水仅19l，而实施例1与实施例2分开制备所得云芝糖肽需蒸发掉水38l，是实施例3的2倍，用滤液代替水提取云芝菌粉可显著节省水用量，节约蒸汽、电等能耗，对于工业化大生产，能显著降低成本。当前第1页12