一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法及其应用

本产品涉及生物工程领域，尤其涉及一种重组丝氨酸蛋白酶的制备及其应用。

背景技术：

蛋白酶是水解蛋白质、多肽的一类酶的总称，应用非常广泛(食品、洗涤、医药、饲料等)，占全球酶制剂销量总额的六成以上。蛋白酶按来源可分为动植物和微生物来源蛋白酶，其中，微生物来源蛋白酶由于具有制备简便、制备成本低等特点，应用最为广泛。近年，我国水产养殖行业发展迅猛，但精加工产品较少以及综合利用率和附加值低等问题，造成了大量蛋白质资源的浪费。因此，寻找可用于鱼肉水解生产活性肽的微生物来源蛋白酶非常必要。

技术实现要素：

本发明提供了一种新型丝氨酸蛋白酶的制备及其应用，该蛋白酶可以实现对花鲢鱼肉蛋白的水解，并制备了具有抗氧化活性的酶解产物，为利用微生物蛋白酶进行水产品精深加工提供了理论方法和基础。

本发明基于planococcusdechangensisxj11的基因组获得了一种重组丝氨酸蛋白酶，其基因序列如seqidno.1，基因大小为990bp，其氨基酸序列seqidno.2所示，由329个氨基酸残基组成。

本发明主要包括planococcusdechangensisxj11基因组的提取、工程菌的构建、酶的表达与纯化、花鲢鱼肉蛋白水解及酶解产物活性检测等程序，具体工艺如下：

一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法，按照下述步骤进行：

(1)取菌株planococcusdechangensisxj11经活化培养后，离心收集菌体，用ctab法提取planococcusdechangensisxj11的基因组dna；

(2)基于丝氨酸蛋白酶(pmspr)的基因序列，设计特异性pcr扩增引物seqidno.3(上游引物)和seqidno.4(下游引物)，下划线标注的上游引物中catatg和下游引物中ctcgag分别为bamhi和xhoi酶切位点，上游引物和下游引物中波浪线标注的taagaaggagatata和gtggtggtggtggtg分别为pet-22b(+)质粒的上下游同源臂；

以步骤(1)中获得的planococcusdechangensisxj11基因组dna为模板，pcr扩增使用酶为q5超保真聚合酶(购自neb公司)，来扩增丝氨酸蛋白酶(pmspr)基因序列，得到pcr扩增产物；

(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测步骤(2)中pcr扩增产物的大小，利用胶回收的方式将990bp的条带进行回收，得到回收的pcr产物；

(4)利用一步克隆的方法将步骤(3)中回收的pcr产物与线性化(bamhi、xhoi酶切)后的质粒pet-22b(+)进行连接，构建得到重组表达质粒(pet-pmspr)，并将重组质粒(pet-pmspr)导入大肠杆菌bl-21(de3)化学感受态细胞中，以获得重组工程菌(bl21/pet-pmspr)；

(5)将重组工程菌(bl21/pet-pmspr)接种至luria-bertani(lb)液体培养基中，培养至od600为0.6～1.0时，加入诱导剂iptg进行过夜诱导；取诱导后的菌液，离心收集菌体，并将菌体重悬于tris-hcl缓冲液，得到菌体悬浮液；然后在冰浴条件下对菌体悬浮液进行超声破碎，超声破碎处理后离心收集上清液，利用亲和层析ni-nta柱对上清液进一步纯化，获得重组丝氨酸蛋白酶；

进一步的，步骤(1)中所述菌株planococcusdechangensisxj11分离自中国山东传统虾酱工厂生产的虾酱，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，编号为cgmccno.17059。

进一步的，步骤(1)中所述活化培养的流程为：从-80℃冰箱中取出甘油保藏的菌株planococcusdechangensisxj11，用接种环蘸取菌液，划线于gibbons固体培养基平板上，将平板倒置于15℃的恒温培养箱中培养48h；培养后用接种环从平板上挑取单菌落，接种至50ml的gibbons液体培养基中，于15℃，180rpm条件下培养48h，完成活化培养。

进一步的，步骤(1)中所述离心的条件为：10000rpm离心2min。

进一步的，步骤(2)中所述pcr扩增程序如下：预变性：95℃、5min，变性：94℃、30s，退火：55℃、30s，延伸：72℃、15s，终延伸：72℃、10min，34个循环。

进一步的，步骤(5)中所述重组工程菌的接种量为1％-2％(v/v)；。

进一步的，步骤(5)中所述培养的条件为：35-37℃，180-200rpm；所述诱导剂iptg加入后的终浓度为0.5mm；所述过夜诱导的条件为：温度25℃，转速120rpm；所述tris-hcl缓冲液浓度为50mm，ph为8.0。

进一步的，步骤(5)中所述诱导后的菌液，离心的条件为：8000rpm离心10min；所述超声破碎的操作为：超声功率40％，超声3s，间隙5s，超声时间共15min；所述超声破碎处理后的离心条件为：温度4℃，10000rpm离心10min。

本发明得到的重组丝氨酸蛋白酶应用于鱼肉蛋白水解并制备具有抗氧化活性的酶解产物：

(1)称取5～10g花鲢鱼肉，加入1：10(w/v)的蒸馏水进行匀浆，向匀浆液中加入重组丝氨酸蛋白酶，浓度为1000～10000u/g蛋白，在35℃酶解5h，离心后收集酶解上清液备用。

(2)dpph自由基清除实验，具体方法为：取2ml酶解上清液与等体积0.1mm的dpph溶液混合，得到混合物作为实验组；以2ml的50mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液和同体积0.1mm的dpph溶液混合，得到混合物作为空白组；以2ml的酶解上清液与同体积乙醇混合，得到混合物作为对照组。将各组在室温下避光反应30min，于517nm处测定各组的吸光值，并计算dpph自由基清除率，计算公式如下：

注：as代表样品组在517nm处的吸光值，ac为对照组在517nm处的吸光值，ab为空白组在517nm处的吸光值。

有益效果：

本发明使用基因工程技术，利用大肠杆菌表达系统大量制备了一种重组丝氨酸蛋白酶，并且利用重组丝氨酸蛋白酶对花鲢鱼肉蛋白进行酶解，获得了具有抗氧化活性的酶解产物。该蛋白酶的应用不仅解决了水产品加工利用程度低的问题，也为水产品的精加工提供了新思路，而且对食品医药行业也有重要意义。

附图说明

图1为重组丝氨酸蛋白酶的纯化图；其中1为空白对照组，2为超声破碎后的上清液，3为超声破碎后的沉淀，4-6为重组丝氨酸蛋白酶。

具体实施方式

下面结合具体实施实例对本发明做进一步说明。

本发明所用的菌株planococcusdechangensisxj11分离自中国山东传统虾酱工厂生产的虾酱，保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏地址：中国北京，保藏日期为2019年1月2日，编号为cgmccno.17059。

实施例1：planococcusdechangensisxj11基因组提取

(1)菌株活化培养：从-80℃冰箱中取出甘油保藏的菌株planococcusdechangensisxj11，用接种环蘸取菌液，划线于gibbons固体培养基平板上，将平板倒置于15℃的恒温培养箱中培养48h；用接种环从平板上挑取2环单菌落，接种至50ml的gibbons液体培养基中，于15℃，180rpm条件下培养48h；

取5ml培养后的菌液，10000rpm离心2min收集菌体，用ctab法提取planococcusdechangensisxj11的基因组dna；

工程菌的构建

(2)基于丝氨酸蛋白酶(pmspr)的基因序列，设计特异性pcr扩增引物seqidno.3(上游引物)和seqidno.4(下游引物)，上游引物和下游引物中下划线部分为bamhi和xhoi酶切位点，上游引物和下游引物中波浪线标注部分为pet-22b(+)质粒的上下游同源臂；

以步骤(1)中获得的planococcusdechangensisxj11基因组dna为模板，pcr扩增使用酶为q5超保真聚合酶(购置neb公司)，来扩增丝氨酸蛋白酶(pmspr)的基因序列；其中pcr扩增程序如下：预变性：95℃、5min，变性：94℃、30s，退火：55℃、30s，延伸：72℃、15s，终延伸：72℃、10min，34个循环；

(3)采用琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物大小，利用胶回收的方式将大小为990bp的条带进行回收；

(4)利用一步克隆的方法将步骤(3)中回收获得的pcr扩增产物与线性化(即bamhi、xhoi酶切)后的质粒pet-22b(+)进行连接，构建成重组表达质粒(记为pet-pmspr)，并将重组质粒(记为pet-pmspr)导入大肠杆菌bl-21(de3)化学感受态细胞中，以获得重组工程菌(记为bl21/pet-pmspr)。

酶的表达与纯化

(5)按1％(v/v)的接种量，将重组工程菌(bl21/pet-pmspr)接种至luria-bertani(lb)液体培养基中，于37℃，200rpm条件下培养至od600为0.6～1.0时，加入终浓度为0.5mm的诱导剂iptg，于25℃，120rpm条件下过夜诱导，以不加诱导剂的重组菌株为空白对照；

取诱导后的菌液，8,000rpm离心10min收集菌体，并将菌体重悬于50mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液中，在冰浴条件下对菌体悬浮液进行超声破碎，10,000rpm，4℃离心10min，收集上清液；

利用亲和层析ni-nta柱对上清液进一步纯化，以获得重组丝氨酸蛋白酶。

结果检测：利用10％的sds-page胶检测重组蛋白的表达情况和纯化情况。

结果如图1所示，与空白组1(lane1)相比，2(lane2)和3(lane3)在30-40kda之间有明显差异条带，pmspr的理论分子量大小为35.3kda，与电泳图上显示的蛋白大小相符，说明pmspr在重组工程菌中获得了表达，且上清液中有大量可溶性蛋白；另外，4-6中的条带比较单一，说明纯化效果较好，获得了单一的pmspr酶液。

丝氨酸蛋白酶pmspr基因信息学分析

其基因序列如seqidno.1所示，基因大小为990bp。

seqidno.1：

atgaaaaatattcatttgattccctatcgtgttgaacaagtgacggccgcaccgccgagcattccagaaggcgtacagatgatccaggcccctgaagcatgggaaagcgccgaatatggggaaggcaacgtggtggccgtcttggataccggttgccagagcgatcaccccgatctgtccacccggattgtgggcggccgcaatttcacgcacgatgacgctggagaccctgaacagttcgaggattataacggccacggcacccatgttgccgggaccatcgccgcttcgcttgaaaacaaagtgggagtggtcggtgtcgcgccgctcgcccatttacttgtcgtcaaagtgcttgataaacaaggcagcggcagttatgaaggcattattgccggcattcattatgccatcgattggcgcggcccgaatggggaaaaaaccacgattatttcgatgtcgctcggaggccctgaagaccacccggagttatatgaagcggtcaagcgggcagtggacgccggaatcccggtcatttgcgcagccggcaatgaaggggacgatgcgtacgatacggatgaattcgcttatccgggtgcttacggcgaagtcattcaagtgggcgctgtcgatttcgaccgccgcatcgccccgttcagcaataccaataacgaaatcgatttagtggcaccgggcattaatatctactcgacgtacttggaagggaaatatgccagcttatccggcacttcgatggcaacgccgcatgtatcgggagctttagcattgatccgcaatatttccgagcgtgagtttgaccgggagctgaccgaggcagaattatatgcccagcttgtccggcgcacgattcctcttggctacccgaagacggcggaaggcaatggcttgctggcgctcgatattttgaataaattcgagcaattgttcaagattctcagcaattcctatggcaatggctcgggccgttaa

其氨基酸序列seqidno.2所示，由329个氨基酸残基组成。

seqidno.2：

mknihlipyrveqvtaappsipegvqmiqapeawesaeygegnvvavldtgcqsdhpdlstrivggrnfthddagdpeqfedynghgthvagtiaaslenkvgvvgvaplahllvvkvldkqgsgsyegiiagihyaidwrgpngekttiismslggpedhpelyeavkravdagipvicaagnegddaydtdefaypgaygeviqvgavdfdrriapfsntnneidlvapginiystylegkyaslsgtsmatphvsgalalirniserefdrelteaelyaqlvrrtiplgypktaegngllaldilnkfeqlfkilsnsygngsgr

实施例1得到的重组丝氨酸蛋白酶应用于鱼肉蛋白水解并制备具有抗氧化活性的酶解产物：

应用试验1：

(1)称取5g花鲢鱼肌肉，加入50ml的蒸馏水进行匀浆，向匀浆液中加入重组丝氨酸蛋白酶(1000u/g蛋白)，35℃酶解5h，离心收集酶解上清液备用。

(2)dpph自由基清除实验，具体方法为：取2ml酶解上清液与等体积0.1mm的dpph溶液混合，得到混合物作为实验组；以2ml的50mm，ph8.0的tris-hcl缓冲液和同体积0.1mm的dpph溶液混合，得到混合物作为空白组；以2ml的酶解上清液与同体积乙醇混合，得到混合物作为对照组。将各组在室温下避光反应30min，于517nm处测定各组的吸光值，并计算dpph自由基清除率，计算公式如下：

注：as代表样品组在517nm处的吸光值，ac为对照组在517nm处的吸光值，ab为空白组在517nm处的吸光值。

酶解产物的dpph的ic50值为1.518mg/ml。

应用试验2：

(1)称取10g花鲢鱼肉，加入100ml的蒸馏水进行匀浆，向匀浆液中加入(2000u/g蛋白)，35℃酶解5h，离心收集酶解上清液备用。

(2)dpph自由基清除实验，具体方法为：取2ml酶解上清液与等体积0.1mm的dpph溶液混合，以2ml的50mmtris，ph8.0缓冲液和同体积的dpph溶液混合物作为空白组，以2ml的酶解上清液与同体积乙醇混合物作为对照组。将各组在室温下避光反应30min，于517nm处测定各组的吸光值，并计算dpph自由基清除率，计算公式如下：

注：as代表样品组在517nm处的吸光值，ac为对照组在517nm处的吸光值，ab为空白组在517nm处的吸光值。

酶解产物的dpph的ic50值为1.473mg/ml。

应用试验3：

(1)称取7.5g花鲢鱼肉，加入75ml的蒸馏水进行匀浆，向匀浆液中加入重组丝氨酸蛋白酶(4000u/g蛋白)，35℃酶解5h，离心收集酶解上清液备用。

(2)dpph自由基清除实验，具体方法为：取2ml酶解上清液与等体积0.1mm的dpph溶液混合，以2ml的50mmtris，ph8.0缓冲液和同体积的dpph溶液混合物作为空白组，以2ml的酶解上清液与同体积乙醇混合物作为对照组。将各组在室温下避光反应30min，于517nm处测定各组的吸光值，并计算dpph自由基清除率，计算公式如下：

注：as代表样品组在517nm处的吸光值，ac为对照组在517nm处的吸光值，ab为空白组在517nm处的吸光值。

酶解产物的dpph的ic50值为1.259mg/ml。

应用试验4：

(1)称取7g花鲢鱼肉，加入70ml的蒸馏水进行匀浆，向匀浆液中加入重组丝氨酸蛋白酶(6000u/g蛋白)，35℃酶解5h，离心收集酶解上清液备用。

(2)dpph自由基清除实验，具体方法为：取2ml酶解上清液与等体积0.1mm的dpph溶液混合，以2ml的50mmtris，ph8.0缓冲液和同体积的dpph溶液混合物作为空白组，以2ml的酶解上清液与同体积乙醇混合物作为对照组。将各组在室温下避光反应30min，于517nm处测定各组的吸光值，并计算dpph自由基清除率，计算公式如下：

注：as代表样品组在517nm处的吸光值，ac为对照组在517nm处的吸光值，ab为空白组在517nm处的吸光值。

酶解产物的dpph的ic50值为1.119mg/ml。

应用试验5：

(1)称取9g花鲢鱼肉，加入90ml的蒸馏水进行匀浆，向匀浆液中加入重组丝氨酸蛋白酶(8000u/g蛋白)，35℃酶解5h，离心收集酶解上清液备用。

(2)dpph自由基清除实验，具体方法为：取2ml酶解上清液与等体积0.1mm的dpph溶液混合，以2ml的50mmtris，ph8.0缓冲液和同体积的dpph溶液混合物作为空白组，以2ml的酶解上清液与同体积乙醇混合物作为对照组。将各组在室温下避光反应30min，于517nm处测定各组的吸光值，并计算dpph自由基清除率，计算公式如下：

注：as代表样品组在517nm处的吸光值，ac为对照组在517nm处的吸光值，ab为空白组在517nm处的吸光值。

酶解产物的dpph的ic50值为1.087mg/ml。

应用试验6：

(1)称取5.5g花鲢鱼肉，加入55ml的蒸馏水进行匀浆，向匀浆液中加入重组丝氨酸蛋白酶(10000u/g蛋白)，35℃酶解5h，离心收集酶解上清液备用。

(2)dpph自由基清除实验，具体方法为：取2ml酶解上清液与等体积0.1mm的dpph溶液混合，以2ml的50mmtris，ph8.0缓冲液和同体积的dpph溶液混合物作为空白组，以2ml的酶解上清液与同体积乙醇混合物作为对照组。将各组在室温下避光反应30min，于517nm处测定各组的吸光值，并计算dpph自由基清除率，计算公式如下：

注：as代表样品组在517nm处的吸光值，ac为对照组在517nm处的吸光值，ab为空白组在517nm处的吸光值。

酶解产物的dpph的ic50值为1.179mg/ml。

根据应用试验1-6可以看出酶解产物均展现出了不错的抗氧化活性，因此，本发明制备的重组丝氨酸蛋白酶可应用于鱼肉蛋白水解并制备具有抗氧化活性的酶解产物。

说明：以上实施例仅用以说明本发明而并非限制本发明所描述的技术方案；因此，尽管本说明书参照上述的各个实施例对本发明已进行了详细的说明，但是本领域的普通技术人员应当理解，仍然可以对本发明进行修改或等同替换；而一切不脱离本发明的精神和范围的技术方案及其改进，其均应涵盖在本发明的权利要求范围内。

序列表

<110>江苏大学

<120>一种重组丝氨酸蛋白酶的制备方法及其应用

<160>4

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>990

<212>dna

<213>planococcusmaritimus

<400>1

atgaaaaatattcatttgattccctatcgtgttgaacaagtgacggccgcaccgccgagc60

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<211>329

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<213>planococcusmaritimus

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151015

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210215220

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260265270

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275280285

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290295300

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305310315320

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325

<210>3

<211>49

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>3

taagaaggagatatacatatgatgaaaaatattcatttgattccctatc49

<210>4

<211>39

<212>dna

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>4

gtggtggtggtggtgctcgagttaacggcccgagccatt39