一种从猴头菇中获取的五肽及其应用

本发明属于食用菌寡肽技术领域，特别是涉及一种从猴头菇中获取的五肽及其应用。

背景技术：

免疫调节机制异常是目前诱发各种风险疾病的主要因素之一。在食品中具有免疫调节活性的物质很多，其中多肽因结构简单，氨基酸组成明确且小剂量范围内具有功能活性而备受瞩目。

目前大多数食源性活性肽主要是从谷物、海鲜、乳品等中制备，食用菌作为一种大型真菌且营养丰富却很少有研究探究其功能活性肽，这也使得食用菌面临功能活性成分开发不足，产品研发受限。

技术实现要素：

为了解决上述问题，本发明提供了一种从猴头菇中获取的五肽及其应用。本发明提供的五肽从食用菌中提取获得，具有免疫调节活性，能够促进巨噬细胞增殖、提高巨噬细胞吞噬率、调节m1型巨噬细胞和m2型巨噬细胞的细胞因子，进而发挥免疫调节的作用。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

本发明提供了一种从猴头菇中获取的五肽，所述五肽的氨基酸序列如seqidno:1所示。

本发明还提供了上述五肽在制备调节免疫活性的药物中应用。

本发明还提供了上述五肽在制备促进巨噬细胞增殖的药物中应用。

本发明还提供了上述五肽在制备提高巨噬细胞吞噬率的药物中应用。

本发明还提供了上述五肽在制备提高巨噬细胞分泌il-1β和/或il-6和/或tnf-α细胞因子的药物中的应用。

本发明还提供了上述五肽在制备抑制m1型巨噬细胞分泌no和/或il-6细胞因子的药物中应用。

本发明还提供了上述五肽在制备促进m2型巨噬细胞分泌no和/或il-6细胞因子的药物中应用。

本发明还提供了上述五肽在制备抑制m2型巨噬细胞分泌il-10细胞因子的药物中应用。

优选的，所述药物中五肽的物质的量浓度为50～500μmol/l。

本发明还提供了上述五肽在制备具有免疫调节活性的食品中应用。

本发明提供了一种从猴头菇中获取的五肽，所述五肽的氨基酸序列如seqidno:1所示。本发明提供的五肽能够促进巨噬细胞增殖、提高巨噬细胞吞噬率，抑制m1型巨噬细胞分泌no和il-6细胞因子，促进m2型巨噬细胞分泌no和il-6细胞因子，抑制il-10细胞因子的分泌，起到免疫调节的作用。由实施例数据可知，巨噬细胞raw264.7的增殖率高达159.4％，吞噬率达高达135％；本发明提供的五肽对m1型巨噬细胞的no分泌量抑制至10.9±0.79μmol/l，il-6分泌量抑制至10.63±1.52μmol/l；对m2型巨噬细胞的no浓度促进至19.64±0.63μmol/l，il-6的分泌量促进至28.47±0.27μmol/l，il-10的分泌量抑制至5.36±0.85μmol/l。

附图说明

图1为五肽影响巨噬细胞的示意图；

图2为五肽的hplc图；

图3为五肽的esi-ms图；

图4为五肽对巨噬细胞raw264.7细胞因子分泌的影响；

图5为五肽对m1型巨噬细胞分泌细胞因子分泌的影响；

图6为五肽对m2型巨噬细胞分泌细胞因子分泌的影响。

具体实施方式

本发明提供了一种从猴头菇中获取的五肽，所述五肽的氨基酸序列如seqidno:1所示。所述seqidno:1如ksply所示，所述五肽的分子量为608.3834da，所述五肽的hplc图如图2所示，五肽的esi-ms图如图3所示。

本发明还提供了上述五肽在制备调节免疫活性的药物中应用。在本发明中，所述药物中五肽的物质的量浓度优选为50～500μmol/l，进一步优选为50～300μmol/l，最优选为100μmol/l。

本发明还提供了上述五肽在制备促进巨噬细胞增殖的药物中应用。在本发明中，所述药物中五肽的物质的量浓度优选为50～500μmol/l，进一步优选为50～200μmol/l，最优选为100μmol/l；所述巨噬细胞优选包括巨噬细胞raw264.7。经由五肽处理后，巨噬细胞raw264.7的增殖率能提高59.4％。

本发明还提供了上述五肽在制备提高巨噬细胞吞噬率的药物中应用。在本发明中，所述药物中五肽的物质的量浓度优选为50～500μmol/l，进一步优选为50～200μmol/l，最优选为100μmol/l；所述巨噬细胞优选包括巨噬细胞raw264.7。经由五肽处理后，巨噬细胞raw264.7的吞噬率增长约35％。

本发明还提供了上述五肽在制备提高巨噬细胞分泌il-1β和/或il-6和/或tnf-α细胞因子的药物中的应用。在本发明中，所述药物中五肽的物质的量浓度优选为50～500μmol/l，进一步优选为50～200μmol/l，最优选为100μmol/l；所述巨噬细胞优选包括巨噬细胞raw264.7。经由五肽处理后，所述巨噬细胞raw264.7的il-1β分泌量提高至6.99±0.38ng/ml，il-6的分泌量提高至13.23±0.95ng/ml，tnf-α的分泌量提高至6.24±0.40ng/ml。

本发明还提供了上述五肽在制备抑制m1型巨噬细胞分泌no和il-6细胞因子的药物中应用。在本发明中，所述药物中五肽的物质的量浓度优选为50～500μmol/l，进一步优选为50～200μmol/l，最优选为100μmol/l。经由五肽处理后，所述m1型巨噬细胞的no分泌量降低至10.9±0.79μmol/l，il-6的分泌量降低至10.63±1.52μmol/l。

本发明还提供了上述五肽在制备促进m2型巨噬细胞分泌no和il-6细胞因子的药物中应用。在本发明中，所述药物中五肽的物质的量浓度优选为50～500μmol/l，进一步优选为50～200μmol/l，最优选为100μmol/l。经由五肽处理后，所述m2型巨噬细胞的no分泌量提高至19.64±0.63μmol/l，il-6的分泌量提高至28.47±0.27μmol/l。

本发明还提供了上述五肽在制备抑制m2型巨噬细胞分泌il-10细胞因子的药物中应用。在本发明中，所述药物中五肽的物质的量浓度优选为50～500μmol/l，进一步优选为50～200μmol/l，最优选为100μmol/l。经由五肽处理后，所述m2型巨噬细胞的l-10的分泌量降低至5.36±0.85μmol/l。本发明提供的五肽影响巨噬细胞的示意图如图1所示。

本发明还提供了上述五肽在制备具有免疫调节活性的食品中应用。

为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的一种从猴头菇中获取的五肽及其应用进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。

制备dmem完全细胞培养基(含10％胎牛血清，0.5％双抗)，将实验细胞接种于25ml细胞培养瓶中，加入10ml培养基，置于37℃、5％co2浓度的细胞培养箱中培养24h。当细胞铺板率大于培养瓶面积的80％时，吸尽原培养基，使用4mlpbs缓冲液洗涤细胞两次，移液枪吹打细胞至完全脱落。转移细胞悬液至离心管，37℃，1000g离心5min，吸弃上清液，加1ml新鲜培养基，并吹打细胞至均匀悬液，细胞计数，根据计数结果调整细胞悬液浓度为1×10⁴个/ml，按每孔100μl加入到96孔板中，置于恒温培养箱中培养。培养24h后细胞贴壁，吸出废旧培养液，加入终体积为200μl含有不同浓度待测样品的新鲜培养液，并以pbs为阴性对照组于恒温培养箱中培养。

应用例1

给药组操作：将浓度为50～500μmol/l的五肽溶液与巨噬细胞raw264.7共育24h，24h后吸出五肽溶液，用pbs清洗数次，加入5mg/ml的mtt溶液20μl和新鲜培养液180μl，于培养箱中继续培养4h。弃去含有mtt的培养液，加入150μl的dmso于震荡器上震荡10min后，测定490nm波长下的吸光度(od)，计算细胞增殖率。

细胞增殖率如表1所示，细胞增殖率的计算公式如下所示：

巨噬细胞raw264.7增殖率(％)＝((给药组od-空白组od)-(对照组od-空白组od))/(对照组od-空白组od)×100；

空白组的od指pbs的od值，对照组od指未给药但是加入等量pbs组的od值。

表1巨噬细胞raw264.7的增殖率

由表1可知，浓度为50～500μmol/l的五肽均能提高巨噬细胞raw264.7的增殖率，其中提高增殖率最显著的是100μmol/l的五肽，能够将巨噬细胞raw264.7的增殖率提高至159.4％，与空白组相比增殖率增长了约59.4％。

应用例2

取dmem完全培养基稀释nano2标准品至不同浓度(0μmol/l、1μmol/l、2μmol/l、5μmol/l、10μmol/l、20μmol/l、40μmol/l、60μmol/l和100μmol/l)和离心后细胞上清液，按50μl/孔，在96孔板中加入不同浓度的nano2标准品和巨噬细胞raw264.7的上清液样品。取griessreagenti和ii，回复室温，按50μl/孔，向各孔中加入griessreagenti，随后各孔加入同样剂量的griessreagentii，避光反应1min，于540nm测定吸光值，由吸光度计算no的含量，no含量如表2所示。

表2巨噬细胞raw264.7培养上清液中no含量

由表2可知，浓度为50～500μmol/l的五肽均能提高巨噬细胞raw264.7培养上清液中no的含量，其中提高率最显著的是100μmol/l的五肽，能够将巨噬细胞raw264.7培养上清液中no的浓度达到13.0μmol/l，与空白组相比no浓度增长了约271.4％。no含量的提升，能够有效提高巨噬细胞的免疫作用。

应用例3

实验组操作：将浓度为50～500μmol/l的五肽溶液与巨噬细胞raw264.7共育24h，弃去培养液，重新加入新鲜培养基150μl和中性红染液50μl继续放恒温培养箱孵育4h，吸弃上清液，加入细胞裂解液，室温震荡10min，测定540nm波长下的吸光度，计算吞噬指数(吞噬指数＝实验组od/空白组od)。

表3巨噬细胞raw264.7的吞噬能力

由表3可知，巨噬细胞raw264.7与浓度为100μmol/l的五肽溶液共育时吞噬率为135％，与空白组相比吞噬率增长了约35％。

应用例4

利用试剂盒进行下列检测：

将标准品(各细胞因子)梯度稀释至不同浓度(0ng/l、10ng/l、20ng/l、40ng/l、80ng/l、160ng/l和320ng/l)，绘制标准曲线。

取酶标板，每孔添加标准品-样品稀释液50μl，标准品孔添加标品50μl，样品孔加入稀释样品15μl，然后加入50μl辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，hrp)试剂，轻摇，盖封板膜，37℃孵育60min。揭膜，弃液体，拍干，洗涤液洗涤5次，拍干。每孔依次添加显色剂(tmb溶液)a、b各50μl，轻摇混匀，37℃避光显色反应10min后，每孔加终止液50μl终止反应。酶标仪测定450nm波长处各孔吸光度值，采用elisacalc软件，选择logistic曲线(四参数)模型拟合出标准曲线，计算得出各孔目标因子浓度。阳性对照组为添加了0.1μg/ml100μl的脂多糖(lps)组。

(1)对于作用于raw264.7巨噬细胞的结果如图4、表5所示。

表4不同浓度五肽对巨噬细胞raw264.7细胞因子分泌的影响

由图3、表4可知，随着多肽浓度的提升，巨噬细胞raw264.7培养液中il-1β的含量呈现浓度依赖性增长，在浓度为100μmol/l时il-1β的含量达到最大为6.99±0.38ng/ml，il-6和tnf-α含量在100μmol/l浓度下分泌量达到13.23±0.95ng/ml和6.24±0.40ng/ml，均显著地高于多肽浓度为0的空白对照组。表明本发明提供的五肽能够促使小鼠巨噬细胞raw264.7分泌il-1β、il-6和tnf-α提高产生吞噬作用。

(2)对于作用于脂多糖(1μg/ml100μl)诱导的m1型巨噬细胞结果如图4、表5所示。

表5五肽对m1型巨噬细胞分泌细胞因子分泌的影响

由图4、表5可知，随着五肽浓度的升高，m1型巨噬细胞分泌il-6和no的水平明显低于单独使用脂多糖处理的m1型巨噬细胞的分泌水平，且具有显著的剂量依赖性。在100μmol/l时，il-6分泌量降低为10.63±1.52μmol/l，虽然高于空白组分的分泌量，但是仍发挥了显著的抑制作用。

(3)对于il-4(20ng/ml100μl)诱导的m2型巨噬细胞结果如图6、表6所示。

表6五肽对m2型巨噬细胞分泌细胞因子分泌的影响

由图5、表6可知，随着五肽的浓度加大，m2型巨噬细胞分泌no浓度逐渐升高，在100μmol/l时达到19.64±0.63μmol/l，显著高于未添加五肽的组分。

在il-6和il-10的分泌检测中，添加了五肽的组别明显提高了il-6的分泌量达到28.47±0.27μmol/l；降低了il-10水平，从未加入五肽的20.73±0.91μmol/l降低至5.36±0.85μmol/l。

综上所述，本发明提供的多肽能够促使小鼠巨噬细胞raw264.7增殖，分泌no、il-1β、il-6和tnf-α，在提高巨噬细胞吞噬作用的同时还可以抑制m1型巨噬细胞分泌no和il-6细胞因子，促使m2型巨噬细胞分泌no和il-6细胞因子，抑制il-10的分泌，在不同极性巨噬细胞中发挥不同的免疫效应，表现出免疫调节活性。

虽然本发明已以较佳的实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可以做各种改动和修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

序列表

<110>南京财经大学

<120>一种从猴头菇中获取的五肽及其应用

<160>1

<170>siposequencelisting1.0

<210>1

<211>5

<212>prt

<213>人工序列(artificialsequence)

<400>1

lysserproleutyr

15