一株绿针假单胞菌MN225969及其应用的制作方法

一株绿针假单胞菌mn225969及其应用
技术领域
1.本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株绿针假单胞菌mn225969及其应用。


背景技术：

2.我国作为农林大国，小麦、果树和蔬菜是重要的经济作物。但常年受到多种病害的危害，每年因病害造成的经济损失难以估计。目前农药是防控病虫害的最有效手段之一，但是因化学农药的广泛使用而引起的各种问题也随之而来，如化学杀菌剂的长期使用已导致使用次数和用药浓度增加，也提高了病原菌对杀菌剂的抗性。同时，由于化学杀菌剂的广谱性，大量使用不但破坏微生态环境，还会导致非靶标抗性。因此，禁止和限制大量高毒、高残留农药的使用，开发和使用生物源农药已成为保护环境和促进农业发展的重要研究课题。
3.生物防治是指利用生物及其代谢产物防治植物病虫害方法。它的实质就是利用生物种间关系、种内关系，调节有害生物种群密度，即生物群防治生物群。与传统的防治技术相比，生物防治技术具有不污染环境、对人和其他生物安全、产品无残留、易于同其他植物保护措施协调配合并能节约能源等优点，在有害生物综合防治中发挥着越来越重要的作用。到目前为止，真菌、细菌、放线菌、酵母菌都可用于生物防治。利用细菌防治有害微生物是开发和利用微生物资源的重要研究领域之一，亦是最具有潜力、应用前景最为广阔的有效途径之一。细菌防治优势主要有以下几点：一是繁殖速度快、培养成本低廉；二是对病原菌的作用方式较广，如细菌素、抗生素、胞外裂解酶、脂肽类等多种形式；三是有些细菌具有防病、促生的双重作用。
4.近年来，生物防治迅速发展，其中假单胞菌在植物病虫害防治中发挥了非常重要的作用。主要通过营养竞争、分泌降解病原菌的酶及抗生作用等实现其生物防治作用。在我国，绿针假单胞菌主要用于多种蔬菜作物病原真菌、细菌引起的病害的有效防治，而同时针对果树及大田作物多种真菌、细菌病害的绿针假单胞菌较少报道。如专利cn103509740a公开了一种用于防治作物镰刀菌病害的绿针假单胞菌及其应用，其提供的绿针假单胞菌主要是对于镰刀菌、灰霉病菌、纹枯病菌、玉米小斑病菌、终极腐霉、根霉等植物病原真菌有一定的拮抗作用，但对青枯病菌等植物病原细菌的拮抗效果很弱。又如专利cn107099474a公开了一种具有广谱抗菌活性的绿针假单胞菌及其应用，该绿针假单胞菌ytbta14及其发酵液均具有较强的广谱的果树真菌病害抗菌活性。


技术实现要素：

5.针对现有技术存在的不足，本发明要解决的技术问题是提供一株绿针假单胞菌mn225969，对多种作物、果树、蔬菜的植物病原菌均有很好的拮抗作用，能防治由这些病菌侵染引起的多种植物病害；同时还能促进小麦发芽和黄瓜生长，起到防病、促生的双重作用。
6.为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
7.一方面，本发明提供一株绿针假单胞菌mn225969，所述的绿针假单胞菌
(pseudomonas chlororaphis)mn225969于2020年8月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no：61155。
8.本发明通过田间筛选和病原菌拮抗菌筛选得到的绿针假单胞菌mn225969，对禾谷镰刀菌的防治效果能达到39.60％，对黄瓜立枯病菌的相对防效率能达到26.71％，对柑橘溃疡病菌的相对防效能达到100％，对番茄青枯病菌的相对防效能达到97.3％，说明该菌株能有效防治由这些病菌侵染引起的多种植物病害。
9.此外，相比于仅接种了禾谷镰刀菌的小麦的发芽率为47.97
±
7.52％，同时接种禾谷镰刀菌和绿针假单胞菌mn225969的小麦的发芽率提高至78.05
±
5.59％，表明绿针假单胞菌mn225969能拮抗禾谷镰刀菌的同时，促进小麦发芽。相比于采用化学杀菌剂处理的黄瓜的增长率为3.13％，采用绿针假单胞菌mn225969处理的黄瓜的增长率提高至30.13％，表明绿针假单胞菌mn225969能拮抗黄瓜立枯病菌的同时，促进黄瓜生长。
10.因此，另一方面，本发明还提供上述绿针假单胞菌mn225969在拮抗禾谷镰刀菌中的应用。
11.又一方面，本发明还提供上述绿针假单胞菌mn225969在拮抗黄瓜立枯病菌中的应用。
12.又一方面，本发明还提供上述绿针假单胞菌mn225969在促进小麦发芽和/或黄瓜生长中的应用。
13.又一方面，本发明还提供上述绿针假单胞菌mn225969在拮抗柑橘溃疡病菌中的应用。
14.又一方面，本发明还提供上述绿针假单胞菌mn225969在拮抗番茄青枯病菌中的应用。
15.又一方面，本发明还提供一种含有上述绿针假单胞菌mn225969的生防菌剂，所述绿针假单胞菌mn225969的浓度为1
×
107‑1×
109cfu/ml。
16.又一方面，本发明还提供上述生防菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
17.s1.将所述的绿针假单胞菌mn225969接种于lb液体培养基中，于28
‑
32℃条件下培养至od
600
＝1.0，获得种子液；
18.s2.将1.5％
‑
2.5％种子液接种于kb发酵培养基中，于28
‑
32℃条件下扩大培养1
‑
2d，调节发酵液中绿针假单胞菌mn225969的浓度至1
×
107‑1×
109cfu/ml，即得生防菌剂。
19.优选地，步骤s1中所述培养温度为30℃；步骤s2中所述种子液的接种量为2％，培养温度为30℃，培养时间为1
‑
2d。
20.相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
21.(1)本发明提供的绿针假单胞菌mn225969对禾谷镰刀菌的防治效果能达到39.60％，对黄瓜立枯病菌的相对防效率能达到26.71％，对柑橘溃疡病菌的相对防效能达到100％，对番茄青枯病菌的相对防效能达到97.3％，该菌株能有效防治由这些病菌侵染引起的多种植物病害，可用于制备新型、高效、广谱生防菌剂，为微生物应用于生物防治的开发提供了新的途径。
22.(2)相比于仅接种了禾谷镰刀菌的小麦的发芽率为47.97
±
7.52％，同时接种禾谷镰刀菌和绿针假单胞菌mn225969的小麦的发芽率提高至78.05
±
5.59％，表明本发明的绿针假单胞菌mn225969能拮抗禾谷镰刀菌的同时，促进小麦发芽。
23.(3)相比于采用化学杀菌剂处理的黄瓜的增长率为3.13％，采用绿针假单胞菌mn225969处理的黄瓜的增长率提高至30.13％，表明本发明的绿针假单胞菌mn225969能拮抗黄瓜立枯病菌的同时，促进黄瓜生长。
附图说明
24.图1为不同菌株在r2a平板上第一次盖章培养和第二次盖章培养的图片。
25.图2为菌株mn225969的系统发育树。
26.图3为各处理小麦盆栽生长效果。
27.图4为各处理小麦的生长情况。
28.图5为mn225969处理黄瓜的生长情况。其中，
“‑
1”为第一次重复试验，
“‑
2”为第二次重复试验，
“‑
3”为第三次重复试验；“0、1、2、3、4”代表黄瓜立枯病的病级分级。
29.图6为各处理柑橘叶片发病情况。
30.图7为各处理黄瓜种子发芽后的平均根长。
31.图8为各处理番茄生长情况。
具体实施方式
32.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
33.实施例1菌株mn225969的获得
34.一、田间筛选：
35.土壤样品采集于广东省广州市增城区朱村种植基地小白菜根际土壤，然后称取10g加入到装有90ml无菌水的250ml三角瓶中，摇床30℃、180rpm振荡30min，取1ml溶液依次进行梯度稀释，分别吸取10
‑4‑
10
‑6各梯度稀释液100μl均匀涂布于la平板上，每个样品梯度设3个重复，用封口膜将培养皿封好，30℃恒温培养。
36.当平板长出菌落后，用接种针挑取菌落转移到新的培养基中，进行纯化。筛选拮抗小麦茎基腐病菌、黄瓜立枯病菌、柑橘溃疡病菌、番茄青枯病菌的菌株，得到的菌株分别编号为mn226281、mn224796、mn225921、mn225969、mn225849、mn226302、mn226283、mn225946，并进一步验证稳定性。
37.二、菌株mn225969的稳定性
38.1、实验材料
39.(1)试剂：0.9％生理盐水。
40.(2)培养基：r2a固体培养基。
41.2、试验方法
42.将在r2a平板上培养1d的mn225969用棉棒和生理盐水进行刮板，得到od
600
为1的菌液，用生理盐水在96孔板中进行梯度稀释，然后盖章于r2a培养皿中，37℃进行培养，7d后进行第二次盖章。试验重复三次。
43.3、试验结果
44.如表1和图1所示。结果表明，第二次盖章后，菌株mn225969的活性与稳定性最好。
45.表1菌数减少率
46.菌株编号log菌数减少率(％)mn2259690.00％
47.实施例2菌株mn225969的鉴定与保藏
48.对筛选出的菌株mn225969依据其菌落形态、个体形态学特征、生理生化特征、16s rdna序列等均进行鉴定。
49.菌株mn225969个体形态与菌落特征如下：菌体为杆状，(0.3μm
‑
0.8μm)
×
(1.0μm
‑
1.1μm)，革兰氏染色阴性，无芽孢，单极生鞭毛，能运动，在r2a培养基上培养24h后可形成1.2mm菌落，菌落可产生橙色色素，圆形，表面凸起，光滑，较粘稠，易挑起，边缘整齐。
50.菌株mn225969生理生化特征为：能产生荧光色素，能水解精氨酸双水解酶、脂酶、氧化酶、过氧化氢酶、柠檬酸盐、明胶，不水解淀粉，也不产生h2s，都不能利用聚β
‑
羟基丁酸盐作碳源。最适培养温度为28℃
‑
30℃，最适生长ph值为7.0
‑
7.5，可产生橙色非荧光色素，能利用卵磷脂酶，可把蔗糖转化为果聚糖，不产生脓青素，也不进行反硝化作用。
51.通过16srdna同源性分析：以菌株mn225969的基因组dna为模板，利用27f，1492r引物进行16s rdna基因的pcr扩增。引物序列为：27f(5
’‑
agagtttgatcctggctcag
‑3’
)和1492r(5
’‑
ggttaccttgttacgactt
‑3’
)。pcr产物为单一条带，扩增产物回收纯化后进行测序。该菌株的16s rdna序列如seq id no:1序列所示。同时将该菌株的16s rdna序列与genbank数据库收录的代表菌株的16s rdna基因核苷酸序列进行同源性比对，结果与绿针假单胞菌的同源性均高达99.928％。用软件分析得到系统发育树，结果见图2，菌株mn225969与pseudomonas属的pseudomonas chlororaphis细菌处于一个大的分支内，结合形态学和生理生化性状，同源性及系统发育分析，可确定筛选出的菌株mn225969为绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)。
52.菌株mn225969的16s rdna序列(seq id no:1)：
53.agtcgagcggtagagagaagcttgcttctcttgagagcggcggacgggtgagtaatgcctaggaatctgcctggtagtgggggataacgttcggaaacggacgctaataccgcatacgtcctacgggagaaagcaggggaccttcgggccttgcgctatcagatgagcctaggtcggattagctagttggtgaggtaatggctcaccaaggcgacgatccgtaactggtctgagaggatgatcagtcacactggaactgagacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattggacaatgggcgaaagcctgatccagccatgccgcgtgtgtgaagaaggtcttcggattgtaaagcactttaagttgggaggaagggtacttacctaatacgtgagtattttgacgttaccgacagaataagcaccggctaactctgtgccagcagccgcggtaatacagagggtgcaagcgttaatcggaattactgggcgtaaagcgcgcgtaggtggttcgttaagttggatgtgaaatccccgggctcaacctgggaactgcatccaaaactggcgagctagagtatggtagagggtggtggaatttcctgtgtagcggtgaaatgcgtagatataggaaggaacaccagtggcgaaggcgaccacctggactgatactgacactgaggtgcgaaagcgtggggagcaaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgtcaactagccgttgggagccttgagctcttagtggcgcagctaacgcattaagttgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggccttgacatccaatgaactttccagagatggattggtgccttcgggaacattgagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgtaacgagcgcaacccttgtccttagttaccagcacgtcatggtgggcactctaaggagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatggccct
tacggcctgggctacacacgtgctacaatggtcggtacagagggttgccaagccgcgaggtggagctaatcccataaaaccgatcgtagtccggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagtcggaatcgctagtaatcgcgaatcagaatgtcgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatgggagtgggttgcaccagaagtagctagtctaaccttcgggaggac
54.将绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis)mn225969于2020年8月21日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(gdmcc)，保藏编号为gdmcc no：61155。保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
55.一种含有绿针假单胞菌mn225969的生防菌剂，绿针假单胞菌mn225969的浓度为1
×
107‑1×
109cfu/ml。
56.上述生防菌剂的制备方法，包括以下步骤：
57.s1.将所述的绿针假单胞菌mn225969接种于lb培养基中，于30℃条件下培养至od
600
＝1.0，获得种子液；
58.s2.将2％种子液接种于kb发酵培养基中，于30℃条件下扩大培养1
‑
2d，调节发酵液中绿针假单胞菌mn225969的浓度至1
×
107‑1×
109cfu/ml，即得生防菌剂。
59.实施例3菌株mn225969对禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病的防治能力
60.1、试验材料
61.(1)病原菌：来自于菌库保藏的禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)，保藏编号为pa20190090，先用pda对菌株进行活化，28℃培养5d后，再用cmc培养基在25
‑
28℃、200rpm条件下培养7d后用纱布过滤得到孢子悬液，用血球计数板计数，然后配制成浓度为106个/ml的孢子悬液。
62.(2)测试作物：小麦。
63.(3)土壤：基质土。
64.(4)测试菌株：
65.①
pc60(pseudomonas chlororaphis)即绿针假单胞菌pc60。pc60s代表pc60上清液；pc60b代表pc60菌悬液。
66.②
ps969(pseudomonas chlororaphis)即绿针假单胞菌mn225969。ps969s代表ps969上清液；ps969b代表ps969菌悬液。
67.(5)上述材料及处理见表2。
68.表2不同处理的具体配方
69.处理编号有效成分配方施用方式ck水
‑‑
fg禾谷镰刀菌106个/ml fg孢子悬液20ml/盆
‑
fghfg/恶霉灵106个/ml fg孢子悬液/1500
×
恶霉灵50ml/盆浇灌blankfg/水106个/ml fg孢子悬液/水(40μl/20g小麦)包衣拌土种植pc60sfg/pc60上清液106个/ml fg孢子悬液/pc60上清液(40μl/20g小麦)包衣拌土种植pc60bfg/pc60菌悬液106个/ml fg孢子悬液/pc60菌体悬液(40μl/20g小麦)包衣拌土种植ps969sfg/ps969上清液106个/ml fg孢子悬液/ps969上清液(40μl/20g小麦)包衣拌土种植ps969bfg/ps969菌悬液106个/ml fg孢子悬液/ps969菌体悬液(40μl/20g小麦)包衣拌土种植
70.2、试验方法
71.(1)菌株处理：将待测菌株活化之后，把pc60和mn225969在30℃、200rpm条件下摇
瓶培养24h，然后将菌液调至od
600
＝1，离心分别收集上清液和菌体，菌体用pbs重悬至109cfu/ml。
72.(2)种子处理：处理组blank、pc60s、pc60b、ps969s、ps969b按上表配方利用种衣剂对种子进行处理(种衣剂：360μl/20g小麦)，使种子带有待测菌株。
73.(3)土壤准备：将基质土121℃灭菌60min，然后处理fg、fgh、blank、pc60s、pc60b、ps969s、ps969b分别用孢子浓度为106个/ml的禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)与土壤拌匀进行种植(20ml/盆)。
74.(4)处理fgh加入1500
×
恶霉灵50ml/盆，ck采用不加病原菌的土壤。
75.(5)发芽后统计小麦发芽率，14d后统计小麦病情。
76.其病情分级情况具体为：
77.0级，未发病；
78.1级，第一叶鞘出现轻度症状(第一叶鞘出现褐色条纹至黑化，但黑化程度不超过50％)；
79.2级，第一叶鞘发病严重(第一叶鞘黑化程度超过50％以上)；
80.3级，第二叶鞘出现轻度症状(第二叶鞘出现褐色条纹至黑化，但黑化程度不超过50％)；
81.4级，第二叶鞘发病严重(第二叶鞘黑化程度超过50％以上)；
82.5级，第三叶鞘轻度发病(第三叶鞘出现褐色条纹至黑化，但黑化程度不超过50％)；
83.6级，第三叶鞘发病严重至植株接近死亡。
84.3、试验结果
85.试验结果如表3和图3
‑
4所示，试验发现禾谷镰刀菌严重影响了小麦的生长，所测菌株pc60、mn225969均能减轻禾谷镰刀菌对小麦毒性的影响。通过对比菌悬液和上清液单独施用对禾谷镰刀菌病害的防治效果，发现菌悬液防治效果较好，其中mn225969菌悬液防效最高为61.96％，pc60菌悬液防效为36.80％；而mn225969上清液的防效为30.75％，pc60上清液的防效为15.22％；但均低于恶霉灵的防效，其防效为64.60％。
86.综上，本试验中fg致病力较高，病情指数为79.51％，试验数据表明菌株mn225969无论是菌悬液还是上清液均对fusarium graminearum防效较好，菌株mn225969的菌悬液对禾谷镰刀菌引起的小麦茎基腐病的防治效果与恶霉灵相当，能有效防治该病害。
87.表3小麦接种禾谷镰刀菌(fusarium graminearum)各处理生长指标
88.处理编号病情指数(％)防治效果(％)相对发芽率(％)ck
‑‑
100.00
±
0.00abcfg79.51
±
2.38a
‑
57.58
±
3.85efgh28.15
±
2.25d64.60116.16
±
3.23ablank65.80
±
4.07ab17.2475.76
±
2.57depc60s67.41
±
7.92ab15.2276.77
±
7.73depc60b50.25
±
5.99c36.8090.91
±
4.44bcdps969s55.06
±
4.28bc30.7581.82
±
4.63cdps969b30.25
±
4.15d61.96109.09
±
5.88ab
89.实施例4菌株mn225969对黄瓜立枯防治能力以及生长促生效果
90.1、试验方法
91.将已灭菌翠筠靓土按土：水为1kg：1000ml水的比例拌匀后，将灭菌土放入小花盆中，放入3颗种子(每盆3株)，再平铺一层土(适当多育苗，防止不发芽)。全部育好后用保鲜膜包起来，遮光，待种子发芽后揭开并浇水。待作物生长至第一片真叶初展时开始处理。
92.待选菌株培养：la培养基上培养2
‑
3天后，用一次性接种环从平板上取适量菌株接种到100ml lb培养基中，置于30℃、200r/min条件下的恒温振荡器摇瓶培养1天，利用分光光度计在600nm波长下测量od值，每盆浇灌6
×
108个孢子，稀释到900ml。
93.待选菌株接种：将稀释好的菌株每盆浇灌50ml，每个处理3组重复，每重复6盆黄瓜苗。
94.立枯病菌接种：待选菌株接种24h后，打孔器经酒精灯灼烧冷却后，在培养7天后的立枯病菌培养基上打孔，得到直径5mm的菌饼，在3株黄瓜苗根部附近用园艺小花铲插三次进行伤根，并在每盆相对位置上各戳一个孔，每两个孔将菌饼接种到小孔中并盖上土，每孔接一个菌饼，置于31℃度的温室中，每个3天浇一次水保持高湿环境，7天后第二次接种，试验操作与第一次相同，第二次接种病菌后，将黄瓜苗放入高温高湿的温室盆中发病5天。
95.黄瓜立枯病的病级分级：
96.0级：黄瓜苗茎基部无病斑；
97.1级：黄瓜苗茎基部病斑所占比例小于1/4；
98.2级：黄瓜苗茎基部病斑所占比例在1/4
‑
1/2之间；
99.3级：黄瓜苗基部病斑所占比例大于1/2，但未破坏整个茎围；
100.4级：黄瓜苗根茎相接处出现凹陷或断裂，腐烂变褐等症状。
101.发病率(％)＝(发病株数/调查总株数)
×
100％；
102.发病指数＝(∑(各级病株数
×
各病级代表数值)/(调查总株数
×
发病最高级数值))
×
100；
103.相对防效(％)＝(对照组病级指数
‑
处理组病级指数)/对照组病级指数
×
100％。
104.2、试验结果
105.试验结果如表4和图5所示，菌株mn225969对黄瓜立枯病菌有一定的防治效果，同时还能促进黄瓜的生长。
106.表4黄瓜各处理生长指标
107.处理增长率(％)相对防效率(％)病情指数(％)甲基托布津3.13％53.44％25mn22596930.13％26.72％39.35
108.实施例5菌株mn225969对柑橘溃疡病的防治能力
109.1、实验方法
110.(1)菌液制备
111.mn225969菌液制备：吸取500μlod
600
＝4.01的mn225969菌液至1500mltween80溶液中，制成od
600
为1的菌液。
112.(2)化药制备
113.中生菌素：取5g中生菌素加入45ml无菌蒸馏水中，制成10倍稀释液；重复此步骤至
制成1000倍稀释液。
114.(3)农药施用
115.将采摘的叶片用自来水冲洗除去表面灰尘，用1％次氯酸钠浸泡2分钟，用无菌蒸馏水再次清洗。将柑橘叶片针刺后，将准备好的不同浓度的菌株稀释液、化药稀释液以喷雾形式喷至叶片上，以叶片表面均匀湿润为准，并放置使其自然风干。
116.(4)病原菌接种
117.风干后吸取10μl浓度为od
600
为0.2的病原菌菌液至针刺位，每叶共接种六次。将叶片背面朝上，放在水琼脂上，用封口膜封口并放入28℃，16h光照，8h无光照的温室中培养。
118.2、试验结果
119.试验结果如表5和图6所示，菌株mn225969对柑橘溃疡病菌的防治效果较好，能有效防治该病害。
120.表5柑橘叶片各处理发病情况
[0121] ck中生菌素mn225969发病率100.00％a5.56％b0.00％b标准误差
‑
5.56％0％方差
‑
92.590相对防效
‑
94.44％a100.00％a
[0122]
实施例6菌株mn225969对黄瓜种子发芽的影响
[0123]
1、试验材料
[0124]
发芽纸、黄瓜种子(粤秀三号)、塑料托盘等。
[0125]
2、试验方法
[0126]
(1)摇菌
[0127]
用接种环挑取平板上的菌体，接种到lb液体培养基，30℃振荡培养12
‑
16h，制成od
600
为1.0的菌液。
[0128]
(2)浸种
[0129]
称取5g黄瓜种子于100ml锥形瓶，加入15ml mn225969菌液，浸泡4h，以清水为对照。将种子捞出置于吸水纸上。
[0130]
(3)发芽纸种植
[0131]
将发芽纸用清水浸泡，取出沥干水，数50颗黄瓜种子，均匀排列在发芽纸上，再盖一张发芽纸，使2张发芽纸对齐。将发芽纸卷成纸卷，上下2头用橡皮筋绑住，以保证种子不滑落和有一定生长空间。每个处理3个重复。
[0132]
(4)发芽计数
[0133]
从发芽纸种植的第3天开始每天同时间进行发芽计数，以胚根长度超过种子长度为种子萌发的标志。
[0134]
(5)黄瓜发芽纸收苗
[0135]
种植7d后测量黄瓜根长，计算活力指数。发芽指数gi＝∑gt/dt；活力指数vi＝s
×
gi。式中dt为发芽试验第几日、gt为第几日的发芽数、s为种苗生长量(长度或重量)，本试验s选取根长。
[0136]
3、试验结果
[0137]
试验结果如表6和图7所示，经菌液处理后的黄瓜种子发芽率低于清水对照组，发芽指数和活力指数也较对照组低，菌株mn225969对于黄瓜种子发芽有轻微的抑制现象。
[0138]
表6各处理黄瓜种子发芽情况
[0139]
处理发芽率(％)givick94.001.001.00mn22596989.330.920.59
[0140]
实施例7菌株mn225969对番茄青枯病防治能力
[0141]
1、实验材料
[0142]
番茄种子(品种为新星101，广东科农生物科技)、新植霉素。
[0143]
病原菌：青枯劳尔氏菌(ralstonia solanacearum)。
[0144]
2、实验方法
[0145]
(1)待筛菌株扩繁：
[0146]
摇床上培养至菌数为108(od
600
为0.8
‑
1.0)，根据od值将待测菌株稀释至108，备用。
[0147]
(2)青枯病原菌株活化：
[0148]
配制培养基：
[0149]
2,3,5
‑
氯化三苯基四氮唑(ttc)培养基：称取葡萄糖2g，蛋白胨4g，水解酪蛋白0.4g，琼脂5g，加入水400ml。混合灭菌后冷却至60℃左右。称取ttc 20mg至2ml离心管中，加入2ml的怡宝水(即ttc浓度为10mg/ml)，在超净工作台中用注射器吸取2ml离心管中的全部ttc液体，注入0.22μm的过滤柱(品牌millex，生产批号r8pa40112，2018/11)中，用新的2ml离心管接住滤液，吸取200μl至已降温的灭菌培养基中，即：使培养基中ttc终浓度为0.005％(w/v)。
[0150]
spa液体培养基：称取蔗糖10.0g，蛋白胨2.5g，k2hpo
4 0.25g，mgso
4 0.125g，加入水500ml，调至ph为7.0
‑
7.2，混合灭菌后备用。
[0151]
实验开始前4天，将青枯病原菌丛甘油管中活化到ttc平板上，培养2天后选取活性高的青枯平板转接至spa液体培养基中，摇床上培养8
‑
16h至菌数为108(od
600
为0.8
‑
1.0)，根据od值将青枯病原菌稀释至107，备用。
[0152]
(3)剪叶：
[0153]
番茄播种后第11天，对番茄进行间苗至10株苗/盆。番茄播种后第12天，进行处理如下：
[0154]
待筛菌浓度为108的孢子悬液：青枯病原菌107孢子悬液＝1：1，即mn225959组。
[0155]
阳性对照：新植霉素1000倍稀释液：青枯病原菌107孢子悬液＝1：1，即新霉菌素组。
[0156]
阴性对照：清水：青枯病原菌107孢子悬液＝1：1，即p.a组。
[0157]
空白对照：清水，即ck组。
[0158]
各处理按照上述比例进行混合至40ml处理，用干净的剪刀浸泡在混合液中，然后剪掉番茄一个子叶的一半，每次剪叶子前都要重新浸泡一次剪刀，每个处理进行三次重复，每处理30*3株番茄苗进行测试。处理好的番茄苗放置在高温高湿的小棚内培养7天。
[0159]
3、数据采集
[0160]
从第4天起，每天记录番茄存活死苗数，并计算存活率。
[0161]
4、试验结果
[0162]
试验结果如表7和图8所示，菌株mn225969对番茄青枯病原菌的防治效果较好，能有效防治该病害。
[0163]
表7各处理番茄的存活情况
[0164] 7d存活率(％)7d死亡率(％)相对p.a防效(％)相对p.a防效(％)ck100.000.001.00100.00p.a58.8941.110.000.00新植霉素93.336.670.8483.78mn22596998.891.110.9797.30
[0165]
最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。