马铃薯中t-2毒素的提取方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及T-2毒素的提取方法，尤其涉及马铃薯中T-2毒素的提取方法，属于 T-2毒素的检测领域。
【背景技术】
[0002] 干腐病是影响马铃薯贮藏质量的一种真菌病害，其主要致病菌为镰刀菌。由于窖 藏过程中窖温高，湿度大，镰刀菌侵染的薯块会出现腐烂变质导致"烂窖"，对中国的马铃薯 产业造成了巨大的经济损失。在镰刀菌侵染马铃薯的同时，还会产生大量的单端孢霉烯族 毒素如T-2毒素、脱氧雪腐镰刀菌烯醇（DON，即呕吐毒素）、蛇形霉素（DAS)等，其中T-2毒 素主要影响血液、肝脏、肾脏、胰腺肌肉及淋巴细胞的功能，人和家畜若误食则会导致厌食、 呕吐、腹泻、生长停滞、繁殖和神经机能障碍，甚至死亡。
[0003] 因此，开发一种新的马铃薯中T-2毒素的提取方法，对于实现马铃薯干腐病中的 T-2毒素的准确检测显得尤为重要。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种马铃薯中T-2毒素的提取方法，该方法操 作简便、T-2毒素的提取率高。
[0005] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0006] 本发明公开了一种马铃薯中T-2毒素的提取方法，包括以下步骤：将马铃薯粉碎， 加入样品提取液，震荡，离心，取上清液，即得。
[0007] 本发明中离心后向上清液中加入稀释液进行稀释，即可用于ELISA检测。其中，上 清液与稀释液的体积比为1 :5 ;所述稀释液为甲醇和水按照体积比10 :90组成的混合液。
[0008] 本发明马铃薯中T-2毒素的提取方法，按照g/ml计，马铃薯与样品提取液的比例 为I:10-30 ;优选为 1 :20。
[0009] 所述样品提取液为甲醇和水按照体积比20-80 :20-80组成的混合液；优选为甲醇 和水按照体积比50-80 :20-50组成的混合液；最优选为甲醇和水按照体积比60 :40组成的 混合液。
[0010] 本发明对样品提取液中甲醇的浓度进行了优化实验，甲醇浓度（即样品提取液 中甲醇的体积百分比）分别为 10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、80%， 50rpm震荡3min，3000rpm离心3min，然后进行ELISA检测。结果表明，随着甲醇浓度的提 高，T-2毒素的提取量提高；当采用60 %的甲醇溶液提取，针对6种不同的镰刀菌都具有最 高的提取量；继续提高甲醇浓度，T-2毒素的提取量开始下降。其中，针对1-6号镰刀菌，采 用60%甲醇溶液提取，T-2毒素的提取量分别比55%甲醇浓度的处理提高40% -146. 2%。 因此，本发明选择60%甲醇溶液为样品提取液，即甲醇和水按照体积比60 :40组成的混合 液。
[0011] 本发明所述震荡的转数为50-200rpm，震荡的时间为3-10min;优选的，所述震荡 的转数为150rpm，震荡的时间为5min。所述离心的转数为3000-4500rpm，离心的时间为 3-10min;优选的，所述离心的转数为4000rpm，离心的时间为5min。
[0012] 本发明在确定了样品提取液的基础上，为了提高毒素的获得量，进一步对震荡的 转数和震荡时间进行优化，震荡的转数分别为50、100、150、200rpm，时间分别为3、5、8、 lOmin。结果表明，优化震荡处理可以显著提高毒素的提取率，震荡转数150rpm条件下，1-6 号菌的T-2毒素的提取量均高与其他转数；其中，在震荡转数为150rpm，震荡时间为5min 条件下，6种不同的镰刀菌T-2毒素的提取量均最高；与震荡转数150rpm，时间3min条件下 相比，1-6号菌的T-2毒素提取量分别提高了 7% -21. 4% ;继续延长震荡时间，1-6号菌的 T-2毒素提取量开始下降。因此，本发明选择震荡转数150rpm，震荡时间为5min。
[0013] 本发明进一步对离心转数和离心时间进行优化，离心的转数分别为3000、3500、 4000、4500rpm，离心时间分别为3、5、8、lOmin。结果表明，离心转数4000rpm、不同离心时间 条件下，1-6号菌的T-2毒素的提取量均高于其他转数；其中，采用离心转数为4000rpm，离 心时间为5min，6种不同的镰刀菌T-2毒素的提取量最高，与离心转数4000rpm，时间3min 条件下相比，1-6号菌的T-2毒素提取量分别提高了 2% -9. 8%;继续延长离心时间，1-6号 菌的T-2毒素提取量开始下降。因此，本发明选择离心转数4000rpm，离心时间为5min。 [0014] 综上，本发明优化了马铃薯中T-2毒素的提取方法，选择甲醇和水按照体积 比60 :40组成的混合液为样品提取液，震荡转数为150rpm，震荡时间为5min，离心转 数为4000rpm，离心时间为5min，最终6种不同的镰刀菌T-2毒素的提取率最高。其 中，黄色镰刀菌（F.culmorum)感染的马铃薯中T-2毒素的提取量为I. 23ng/g、燕麦 镰刀菌（F.avenaceum)感染的马铃薯中T-2毒素的提取量为3. 04ng/g，拟丝孢镰刀 菌（F.trichothecioides)感染的马铃薯中T-2毒素的提取量为0. 81ng/g、拟枝孢镰刀 菌（F.sporotrioides)感染的马铃薯中T-2毒素的提取量为4. 12ng/g、接骨木镰刀菌 (F.sambucinum)感染的马铃薯中T-2毒素的提取量为1.43ng/g、腐皮镰刀菌蓝色变种 (F.solanivar.coeruleum(Sacc))感染的马铃薯中T-2毒素的提取量为0? 94ng/g。
[0015] 本发明技术方案与现有技术相比，具有以下有益效果：
[0016] 本发明马铃薯中T-2毒素的提取方法，优化了薯块中T-2毒素的提取液浓度、震 荡条件和离心条件，获得较好的提取效果；该方法具有特异性强，灵敏度高，简便快速，经济 尚效等优点，为相关部门的检验检疫及植物病害检测和实践应用提供了一种尚效快捷的方 法。
【具体实施方式】
[0017] 下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而 更为清楚。但是应理解所述实施例仅是范例性的，不对本发明的范围构成任何限制。本领 域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节 和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。
[0018] 1、实验材料
[0019] 黄色镰刀菌（F.culmorum)(记为1号菌）、燕麦镰刀菌（F.avenaceum)(记 为2号菌），拟丝孢镰刀菌（F.trichothecioides)(记为3号菌）、拟枝孢镰刀菌 (F.sporotrioides)(记为4号菌）、接骨木镰刀菌（F.sambucinum)(记为5号菌）、腐皮镰 刀菌蓝色变种（F.solanivar.coeruleum(Sacc))(记为6号菌），以上菌种由发明人实验 室分离鉴定，根据闵凡祥和李凤兰等人分离鉴定方法进行（闵凡祥，王晓丹，胡林双，魏琪， 董学志，李凤兰，李鹤春，刘伟婷，郭梅，黑龙江省马铃薯干腐病菌种类鉴定及致病性，2010， 36⑷：112-115;李凤兰，蒋先锋，史丽娟，韩锋，魏琪，冯艳忠，岗凡祥，郭梅，李学湛，两株 马铃薯干腐病病原菌的分离和鉴定，作物杂志，2013,4:125-128。）；
[0020] 马铃薯品种为克新13号；
[0021]T2毒素ELISA检测试剂盒，购于北京华安麦科生物技术有限公司。
[0022] 实施例1马铃薯样品中T-2毒素的提取
[0023] 取黄色镰刀菌（F.culmorum)侵染的马铃薯薯块lg，用研钵研磨粉碎后移入50ml 锥形瓶中，用60%甲醇溶液（指甲醇和去离子水按照体积比60 :40组成的混合液）作为样 品提取液，用量为20ml，冲洗研钵收集样品残渣一并移入锥形瓶中，然后用摇床充分震荡混 匀，震荡的转数为150rpm，时间为5min;将锥形瓶中的液体移入到50ml离心管中，离心的转 数为4000rpm，离心时间为5min;离心后取上清液500y1，再加入2. 5ml的10 %甲醇溶液 (为甲醇和水按照体积比10 :90组成的混合液）于4ml离心管中，放于冰箱中2-8°C保存以 供ELISA检测。
[0024] 经ELISA检测，黄色镰刀菌感染的马铃薯中T-2毒素的提取量为I. 23ng/g。
[0025] 实施例2马铃薯样