品中T-2毒素的提取
[0026] 取燕麦镰刀菌（F.avenaceum)侵染的马铃薯薯块lg，用研钵研磨粉碎后移入50ml 锥形瓶中，用20%甲醇溶液（指甲醇和水按照体积比20 :80组成的混合液）作为样品提取 液，用量为l〇ml，冲洗研钵收集样品残渣一并移入锥形瓶中，然后用摇床充分震荡混匀，震 荡的转数为50rpm，时间为3min;将锥形瓶中的液体移入到50ml离心管中，离心的转数为 3000rpm，离心时间为3min;离心后取上清液500y1，再加入2. 5ml的10%甲醇溶液于4ml 离心管中，放于冰箱中2-8°C保存以供ELISA检测。
[0027] 实施例3马铃薯样品中T-2毒素的提取
[0028] 取接骨木镰刀菌（F.sambucinum)侵染的马铃薯薯块lg，用研钵研磨粉碎后移入 50ml锥形瓶中，用80%甲醇溶液（指甲醇和去离子水按照体积比80 :20组成的混合液）作 为样品提取液，用量为30ml，冲洗研钵收集样品残渣一并移入锥形瓶中，然后用摇床充分震 荡混匀，震荡的转数为200rpm，时间为IOmin;将锥形瓶中的液体移入到50ml离心管中，离 心的转数为4500rpm，离心时间为IOmin;离心后取上清液500y1，再加入2. 5ml的10%甲 醇溶液于4ml离心管中，放于冰箱中2-8°C保存以供ELISA检测。
[0029] 实验例1T-2毒素提取条件的优化实验
[0030] 1、实验方法
[0031] I. 1马铃薯块茎的消毒处理
[0032] 将马铃薯块茎用自来水冲洗干净，然后用70%酒精浸泡30s，然后转入5%次氯酸 钠溶液中浸泡5min，最后用无菌水冲洗3次，晾干备用。
[0033] 1. 2超净工作台的试验前处理
[0034] 用70 %酒精棉将操作台的工作区域擦拭干净，然后开启紫外灯杀菌30min，最后 打开通风设施，再用镊子夹住被酒精灯点燃的酒精棉擦拭工作区域进行高温消毒，才可进 行马铃薯块茎的接菌试验。
[0035] I. 3薯块接毒
[0036] 将6种镰刀菌各保存在PDA平板上，于25°C恒温暗室中培养IOd后取出备用。 将培养好的镰刀菌打成Icm菌饼分别接种于马铃薯薯片上（将马铃薯用打孔器打出直径 1-1. 5cm的圆孔，薯片厚度lcm，放入垫有滤纸的培养皿中），将6种镰刀菌分别接种到马铃 薯克新13号的薯片上面，3次实验重复，最后在薯片周围用胶头滴管加入3ml灭菌水进行润 湿，封口膜密封处理，并用记号笔做好标记，置于25°C恒温培养箱中暗室培养10d。
[0037] 1. 4薯块中T-2毒素提取条件优化
[0038] 1. 4. 1样品提取液的优化
[0039] 分别取不同镰刀菌侵染的薯块lg，用研钵研磨粉碎后移入50ml锥形瓶中，用不同 浓度的甲醇溶液（溶液是指甲醇与去离子水按照体积比配制，下同）作为样品提取液，浓度 分别为 10%、20%、30%、40%、50%、55%、60%、65%、70%、80% 甲醇溶液，用量为 20ml， 冲洗研钵收集样品残渣一并移入锥形瓶中，然后用摇床充分震荡混匀，50rpm震荡3min。将 锥形瓶中的液体移入到50ml离心管中，3000rpm离心3min，离心后取上清液500y1，再加入 2. 5ml的10%甲醇溶液于4ml离心管中，该提取液直接用于ELISA检测，以确定最佳提取液 浓度。
[0040] 1.4. 2震荡条件的优化
[0041] 在样品提取液的优化实验基础上，分别取不同镰刀菌侵染的薯块lg，用研钵研磨 粉碎后移入50ml锥形瓶中，用最佳浓度的甲醇溶液20ml，冲洗研钵收集样品残渣一并移入 锥形瓶中，然后用摇床充分震荡混匀，对不同的震荡的转数和时间进行优化，转数设为50、 100、150、200rpm，时间设为3、5、8、IOmin进行组合，然后3000rpm离心3min，离心后取上清 液500y1，再加入2. 5ml的10 %甲醇溶液于4ml离心管中，该提取液直接用于ELISA检测， 以确定最佳的震荡转数和震荡时间。
[0042] 1. 4. 3离心条件的优化
[0043] 分别取不同镰刀菌侵染的薯块lg，用研钵研磨粉碎后移入50ml锥形瓶中，用最 佳浓度的甲醇溶液20ml，冲洗研钵收集样品残渣一并移入锥形瓶中，然后用摇床采用最佳 震荡转数和时间，充分震荡混匀，将锥形瓶中的液体移入到50ml离心管中，采用离心的方 法进行提取，对离心的转数和离心时间进行优化，离心的转数分别设为3000、3500、4000、 4500rpm，离心时间设为3、5、8、IOmin;离心后取上清液500y1，再加入2. 5ml的10%甲醇 溶液于4ml离心管中，用于ELISA检测，以确定最佳的离心转数和离心时间。
[0044] 2、实验结果
[0045] 2. 1T-2毒素的样品提取液的优化结果
[0046] 本发明采用不同浓度的甲醇溶液对薯块中的T-2毒素进行提取，通过ELISA检测， 检测结果见表1。
[0047] 结果表明，采用不同浓度的甲醇溶液进行提取都可以检测出T-2毒素的存在；随 着甲醇浓度的提高，T-2毒素的提取量提高；当采用60%的甲醇溶液提取，针对6种不同的 镰刀菌都具有最高的提取量；继续提高甲醇浓度，T-2毒素的提取量开始下降。
[0048] 其中，采用60%甲醇溶液提取，针对1号菌，T-2毒素的提取量比55%甲醇浓度的 处理提高70. 9% ;针对2号菌，T-2毒素的提取量比55%甲醇浓度的处理提高45. 4% ;针 对3号菌，T-2毒素的提取量比55%甲醇浓度的处理提高146. 2%;针对4号菌，T-2毒素 的提取量比55%甲醇浓度的处理提高40% ;针对5号菌，T-2毒素的提取量比55%甲醇浓 度的处理提高82. 9% ;针对6号菌，T-2毒素的提取量比其他处理提高95. 7%。因此，本发 明选择60%甲醇溶液为样品提取液，即甲醇和水按照体积比60 :40组成的混合液。
[0049] 表I T-2毒素的检测结果
[0050]
【主权项】
1. 一种马铃薯中T-2毒素的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：将马铃薯粉碎，加 入样品提取液，震荡，离心，取上清液，即得。
2. 按照权利要求1所述的提取方法，其特征在于：按照g/ml计，马铃薯与样品提取液 的比例为I:10-30 ;优选为1 :20。
3. 按照权利要求1或2所述的提取方法，其特征在于：所述样品提取液为甲醇和水按 照体积比20-80 :20-80组成的混合液；优选为甲醇和水按照体积比50-80 :20-50组成的混 合液；最优选为甲醇和水按照体积比60 :40组成的混合液。
4. 按照权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述震荡的转数为50-200rpm，震荡 的时间为3-10min;优选的，所述震荡的转数为150rpm，震荡的时间为5min。
5. 按照权利要求1所述的提取方法，其特征在于：所述离心的转数为3000-4500rpm，离 心的时间为3-10min;优选的，所述离心的转数为4000rpm，离心的时间为5min。
6. 按照权利要求1所述的提取方法，其特征在于，还包括：向上清液中加入稀释液进行 稀释，即可用于ELISA检测。
7. 按照权利要求6所述的提取方法，其特征在于：上清液与稀释液的体积比为1 :5 ;其 中，所述稀释液为甲醇和水按照体积比10 :90组成的混合液。
【专利摘要】本发明公开了一种马铃薯中T-2毒素的提取方法，属于T-2毒素的检测领域。本发明公开了一种马铃薯中T-2毒素的提取方法，包括以下步骤：将马铃薯粉碎，加入样品提取液，震荡，离心，取上清液，即得。本发明通过对样品提取液、震荡转数和时间、离心转数和时间进行筛选优化，最终获得较好的T-2毒素提取效果，使6种不同镰刀菌感染的马铃薯中T-2毒素的提取量均达最高。本发明方法具有特异性强，简便高效等优点，为相关部门的检验检疫及T-2毒素的准确检测提供了一种快捷有效的方法。
【IPC分类】C07D493-10
【公开号】CN104788468
【申请号】CN201510154941
【发明人】李凤兰, 徐永清, 胡宝忠, 蒋先锋, 冯艳忠, 付瑶, 孙美丽, 单韦钰
【申请人】东北农业大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年4月2日