本发明属于多肽制备
技术领域：
，涉及一种核桃仁多肽及其制备方法。
背景技术：
：我国核桃资源非常丰富，产量居世界之首，核桃食用价值很高，保健功能非常突出。核桃仁的蛋白质含量为14％～17％，其中含人体所需的8种必需氨基酸接近联合国粮农组织(fao)和世界卫生组织(who)规定的标准，是一种很好的植物蛋白。核桃所含的核桃蛋白是一种极优质的植物蛋白，除用于初级食品的制作外，还可作为食品基料或食品添加剂使用，应用前景广阔。目前，具有高附加值的核桃多肽已成为核桃蛋白的主要加工方向之一。生物活性肽是现今研究的热点活性物质之一，具有多种生理活性，而且与其它蛋白质类药物相比，它被机体吸收的效率更高，因此受到越来越多的关注。目前核桃多肽生产主要以脱油核桃粕为原料，利用化学法或酶法降解而成。酶法与传统酸法、碱法加工相比，具有不可比拟优点，如不会有任何有害残留物质，具有高度专一性和高效性，酶制剂用量小，反应条件温和，营养成分损失少，易操作，能耗低等，但酶法提取时间长，易生微生物，且酶解之后会产生苦味，所以亟需开发出一种能够有效地提取保存核桃多肽的方法。专利文献cn103468773a公开了一种核桃仁多肽的提取方法，包括以下步骤：(1)球磨粉碎：取脱油核桃粉，加入水，并加木瓜蛋白酶，采用球磨机对脱油核桃粉进行湿法粉碎得到超细粉体悬浊液；(2)酶水解：将悬浊液与球罐分离，向溶液中补充水，调整ph至6.0-7.0，继续加入木瓜蛋白酶，在55-65℃条件下，超声波处理20-30min，之后60℃条件下搅拌酶水解10-30min后离心即得。该发明通过将球磨超微粉碎、超声提取、木瓜蛋白酶酶解三者联合，对脱油核桃粉进行超微粉碎，颗粒细化，细胞破碎，蛋白质等大分子物质暴露溶解释放，超声处理进一步促使核桃蛋白从破碎的细胞中释放溶解，使多肽转化率大幅度提高。专利文献cn103652314a公开了一种微囊化核桃肽及其制备方法，该微囊化核桃肽以冷榨核桃粕为原料，经酶解后包埋而得，所述的包埋壁材是质量比为1：0.1-5的羧甲基纤维素钠和β-环糊精。本发明制备的微囊化核桃肽蛋白质含量≥85％、肽含量≥80％、黄曲霉素b1≤4.0ug/kg。并且，本发明的制备方法操作简单，所生产的核桃肽具有溶解性好，稳定性高的特点。技术实现要素：本发明技术主要提供一种核桃仁多肽，通过超声波辅助复合酶提取核桃仁多肽的方法能够有效地提高核桃仁多肽的提取率，同时通过将核桃仁多肽与壳聚糖溶液、离子型交联剂进行反应，将核桃仁多肽制备成微粒，能够有效地掩盖核桃仁多肽存在的苦味，抑制微生物的生长，提高对核桃仁多肽的载量，进一步增强核桃仁多肽的作用效果，拓宽其应用范围。本发明是通过以下技术方案以实现上述目的：一种核桃仁多肽的制备方法，包括以下步骤：s1、核桃仁浸泡后，去皮、均浆10～30min，调节ph值为7～8，利用超声波辅助搅拌，浸泡过夜后离心，去油层和下层沉淀，调节ph值为4～5，搅拌静置后离心，取沉淀层水洗至中性，在真空干燥箱中冷冻干燥，制得核桃蛋白粉；s2、将步骤s1制得的核桃蛋白粉在复合酶的作用下进行酶解，得到酶解产物；s3、将步骤s2得到的酶解产物进行沸水浴灭酶5～15min，之后进行离心，得到酶解液，利用凝胶电泳法对核桃仁多肽进行分离纯化，即得核桃仁多肽初产物；s4、称取配方量的壳聚糖溶于水中形成壳聚糖溶液，之后加入配方量步骤s3制备得到的核桃仁多肽初产物和离子型交联剂，在室温下进行搅拌，然后将得到的产物进行离心，冷冻干燥，最终得到核桃仁多肽。优选地，所述步骤s1中超声波辅助搅拌时间为1～2h，浸泡过夜后离心时间为0.5～1.5h，搅拌静置后离心时间为0.5～1h。优选地，所述步骤s2中所述复合酶为碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和protamex酶。优选地，所述复合酶的重量为核桃饼粕的1％～5％。优选地，所述酶解过程中的酶解温度为45～55℃，酶解时间为30～60min。优选地，所述离子型交联剂为三聚磷酸钠。优选地，所述核桃仁多肽初产物、壳聚糖与离子型交联剂的重量份数之比为(2～3)：(3～6)：1。进一步地，所述核桃仁多肽初产物、壳聚糖与离子型交联剂的重量份数之比为2：4：1。相应地，本发明还请求保护上述核桃仁多肽制备方法所制得的核桃仁多肽。因此，与现有技术相比，本发明的优势在于：(1)在本发明中，通过超声波辅助复合酶酶解的提取方法，有效地提高了对核桃仁多肽的提取率，并且通过凝胶电泳法使得最终能够得到较纯净的核桃仁多肽。(2)本发明以壳聚糖作为载体，三聚磷酸钠为交联剂，通过壳聚糖中带正电的基团与三聚磷酸钠中带负电的基团间的静电作用相互吸引，使壳聚糖长链团聚形成纳米粒，之后将核桃仁多肽承载于纳米粒中，制备得到核桃仁多肽，该核桃仁多肽能够有效解决蛋白质酶解过程中产生苦味的问题，同时提高对核桃仁多肽的载量，增强核桃仁多肽的抗氧化作用，进一步拓宽其应用范围。具体实施方式下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1、本发明核桃仁多肽及其制备方法配方：碱性蛋白酶10g、木瓜蛋白酶10g、protamex酶10g、核桃仁多肽初产物10g、壳聚糖15g和三聚磷酸钠5g。制备方法：s1、核桃仁浸泡后，去皮、均浆10min，调节ph值为7，利用超声波辅助搅拌1h，浸泡过夜后离心0.5h，去油层和下层沉淀，调节ph值为4，搅拌静置后离心0.5h，取沉淀层水洗至中性，在真空干燥箱中冷冻干燥，制得核桃蛋白粉；s2、将步骤s1制得的核桃蛋白粉在复合酶的作用下进行酶解，酶解温度为45℃，酶解时间为30min，得到酶解产物；s3、将步骤s2得到的酶解产物进行沸水浴灭酶5min，之后进行离心，得到酶解液，利用凝胶电泳法对核桃仁多肽进行分离纯化，即得核桃仁多肽初产物；s4、称取配方量的壳聚糖溶于水中形成壳聚糖溶液，之后加入配方量步骤s3制备得到的核桃仁多肽初产物和三聚磷酸钠，在室温下进行搅拌，然后将得到的产物进行离心，冷冻干燥，最终得到核桃仁多肽。实施例2、本发明核桃仁多肽及其制备方法配方：碱性蛋白酶10g、木瓜蛋白酶5g、protamex酶15g、核桃仁多肽初产物10g、壳聚糖20g和三聚磷酸钠5g。制备方法：s1、核桃仁浸泡后，去皮、均浆20min，调节ph值为8，利用超声波辅助搅拌1.5h，浸泡过夜后离心1h，去油层和下层沉淀，调节ph值为5，搅拌静置后离心0.75h，取沉淀层水洗至中性，在真空干燥箱中冷冻干燥，制得核桃蛋白粉；s2、将步骤s1制得的核桃蛋白粉在复合酶的作用下进行酶解，酶解温度为50℃，酶解时间为45min，得到酶解产物；s3、将步骤s2得到的酶解产物进行沸水浴灭酶10min，之后进行离心，得到酶解液，利用凝胶电泳法对核桃仁多肽进行分离纯化，即得核桃仁多肽初产物；s4、称取配方量的壳聚糖溶于水中形成壳聚糖溶液，之后加入配方量步骤s3制备得到的核桃仁多肽初产物和三聚磷酸钠，在室温下进行搅拌，然后将得到的产物进行离心，冷冻干燥，最终得到核桃仁多肽。实施例3、本发明核桃仁多肽及其制备方法配方：碱性蛋白酶20g、木瓜蛋白酶15g、protamex酶25g、核桃仁多肽初产物15g、壳聚糖30g和三聚磷酸钠5g。制备方法：s1、核桃仁浸泡后，去皮、均浆30min，调节ph值为8，利用超声波辅助搅拌2h，浸泡过夜后离心1.5h，去油层和下层沉淀，调节ph值为4，搅拌静置后离心1h，取沉淀层水洗至中性，在真空干燥箱中冷冻干燥，制得核桃蛋白粉；s2、将步骤s1制得的核桃蛋白粉在复合酶的作用下进行酶解，酶解温度为55℃，酶解时间为60min，得到酶解产物；s3、将步骤s2得到的酶解产物进行沸水浴灭酶15min，之后进行离心，得到酶解液，利用凝胶电泳法对核桃仁多肽进行分离纯化，即得核桃仁多肽初产物；s4、称取配方量的壳聚糖溶于水中形成壳聚糖溶液，之后加入配方量步骤s3制备得到的核桃仁多肽初产物和三聚磷酸钠，在室温下进行搅拌，然后将得到的产物进行离心，冷冻干燥，最终得到核桃仁多肽。对比例1与实施例2相比，本对比例的区别仅在于，不含有protamex酶，相应地将木瓜蛋白酶的含量提高至20g。制备方法参考实施例2。对比例2与实施例2相比，本对比例的区别仅在于，不含有碱性蛋白酶，相应地将木瓜蛋白酶的含量提高至15g。制备方法参考实施例2。对比例3与实施例2相比，本对比例的区别仅在于，制备步骤s1中核桃仁不进行超声处理。对比例4与实施例2相比，本对比例的区别仅在于，不含三聚磷酸钠。制备方法参考实施例2。试验例一、核桃仁多肽含量测定一、实验样品：实施例1～3制备得到的核桃仁多肽、对比例1～3制备得到的核桃仁多肽二、实验方法采用甲醛滴定法来测定水解度，通过测定水解前后氨基氮含量的变化，可以排除氨基氮变化的影响，从而更准确地判断多肽的得率。吸取10ml酶解液，加入蒸馏水60ml后搅拌均匀，用0.05mol/l氢氧化钠标准溶液滴定至ph8.2时停止搅拌，记录体积；加入中性甲醛10ml，再用naoh标准溶液滴定至ph9.2，记下加入甲醛后消耗的氢氧化钠体积v。同时做空白实验，记录消耗的氢氧化钠体积v0。并用以下公式计算水解度。dh(％)＝c×(v-v0)×0.014m×100式中：dh为水解度，％；c为naoh溶液浓度，mol/l；v为滴定消耗naoh溶液体积，,ml；v0为空白滴定消耗naoh溶液体积，ml；0.014为氮毫克当量；m为样品中总氮含量，g。三、实验结果实验结果如表1所示。表1核桃仁多肽的提取率从表1中的数据可以反映出，本发明实施例1～3提取得到的核桃多肽有着较高的提取率，且均比对比例1～3高；由实施例1～3与对比例1～2的数据可以得出本发明利用复合酶，碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和protamex酶的联合酶解核桃仁蛋白，能够有效地提高核桃仁多肽的提取率；由实施例1～3与对比例3的数据可以得出本发明以超声波辅助复合酶酶解提取核桃多肽能够显著提高最终的核桃仁多肽提取率。试验例二、体外抗氧化活性研究一、实验样品：实施例1～3、对比例1～3制备的核桃仁多肽。二、实验方法2.1dpph自由基清除能力的测定称取样品，用蒸馏水溶解后于25ml容量瓶中定容至刻度线，然后稀释成不同浓度的多肽样品溶液。分别取1ml不同浓度的多肽样品溶液加入到2ml的dpph(0.1mm，甲醇溶)溶液中，混匀后于黑暗中室温下放置30min，在517nm处测吸光度。以蒸馏水为空白组，用抗坏血酸(vc)为阳性对照，所有样品平行测三组取平均值计算。清除能力由清除率表示，计算公式如下：清除率(％)＝[a0-(ai-a1)]/a0×100％(1)式中，a0——空白组的吸光度(1ml蒸馏水代替多肽样品)；ai——样品溶液的吸光度；a1——2ml甲醇代替dpph的吸光度。2.2abts自由基清除能力的测定abts自由基储备液的配置：取10ml浓度为7.4mmol/l的abts溶液和10ml浓度为2.6mmol/l的k2s2o8溶液混合，在黑暗中室温下氧化反应12h，得储备液。abts储备液使用前用pbs(0.2m，ph＝7.4)稀释，并使其吸光度值在734nm下为0.80±0.02。按2.1中的方法配制不同浓度的多肽样品溶液。取2mlabts溶液，加1ml不同浓度的多肽样品溶液，混合后，室温条件下静置6min，于734nm下测吸光度。用抗坏血酸(vc)为阳性对照，所有样品平行测三组取平均值计算。abts清除能力由清除率表示，计算公式如下：清除率(％)＝[a0-(ai-a1)]/a0×100％(2)式中，a0——空白对照(1ml蒸馏水代替多肽样品)；ai——样品溶液的吸光度；a1——样品对照(2ml0.2m缓冲液替代abts)。2.3羟基自由基清除能力的测定按2.1中的方法配制不同浓度的多肽样品溶液。分别取1ml不同浓度的多肽样品溶液，依次加入1ml的水杨酸-乙醇溶液(9mm)，1ml的硫酸亚铁溶液(9mm)和1ml的双氧水(9mm)，待混合后，37℃水浴下反应30min，选择3000r/min离心10min。以蒸馏水为空白组，用抗坏血酸(vc)为阳性对照，在510nm处测定吸光度，所有样品平行测三组取平均值计算。清除率的计算公式如下：清除率(％)＝[a0-(ai-a1)]/a0×100％(3)式中，a0——空白对照(1ml蒸馏水代替多肽样品)；ai——样品溶液的吸光度；a1——样品对照(取1ml不同浓度的多肽样品溶液，加入3ml蒸馏水)。三、实验结果各样品的抗氧化能力如表2所示。表2核桃多肽的抗氧化活性研究从表2中的数据可以得知，本发明实施例1～3制备出的核桃仁多肽具有较高的dpph自由基、abts自由基、羟基自由基清除率，且相比于对比例1～3的实验数据可以得出，本发明通过超声辅助复合酶对核桃仁进行提取的方法能够有效提高提取核桃仁多肽的含量，同时将核桃仁多肽制备成微粒的形式能够有效地增大对核桃仁多肽的载量，进一步增强其具有的抗氧化能力。试验例三、核桃仁多肽的口感评价一、实验样品：实施例1～3、对比例1～2、对比例4对应制得的产品。二、实验结果各样品对应制得的产品的口感评价结果如表3所示：表3各样品口感评价结果组别口味实施例1无苦味实施例2无苦味实施例3无苦味对比例1较苦对比例2较苦对比例4苦涩由表3中的结果可以得出，本发明实施例1～3最终制备出的核桃仁多肽口感上不具有苦味；由实施例1～3与对比例1～2的结果可以得出本发明通过核桃仁在复合酶碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶和protamex酶的作用下进行酶解，能够有效地减少酶解过程中产生的苦味；由实施例1～3与对比例4的结果可以得出，本发明将核桃仁多肽与壳聚糖在离子型交联剂的作用下制备成核桃仁多肽，能够有效地掩盖苦味，给消费者带来更好的服用体验。试验例四、抑制微生物生长实验一、实验样品：实施例1～3制备得到的核桃仁多肽、对比例4制备得到的核桃仁多肽二、实验方法将实施例1～3与对比例4制备得到的核桃仁多肽置于室温下放置1个月，之后取相同剂量的受试样品，分别加入融化并冷至50℃左右的定量mh琼脂中，制成含不同受试样品浓度的平板，之后接种大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，在适合细菌生长的环境条件下进行培养，观察大肠杆菌和金黄色葡萄球菌在培养皿中的生长情况，并对平板中的菌落数量进行统计。三、实验结果各样品对微生物生长的抑制情况如表4所示。表4样品抑制微生物生长实验由表4中的数据可以得知，本发明实施例1～3制备得到的核桃仁多肽在放置1个月的时间之后具有的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌数量与放置前不具有差异性的变化，由此可以证明本发明制备出的核桃仁多肽能够有效地抑制微生物的生长，同时由实施例1～3与对比例4的实验结果可以得出，本发明通过壳聚糖与离子型交联剂的相互作用制备出的核桃仁多肽，能够有效的抑制微生物的生长。从以上实验可以得出本发明通过超声波辅助复合酶提取核桃仁多肽的方法能够有效地提高核桃仁多肽的提取率，同时通过将核桃仁多肽与壳聚糖溶液、离子型交联剂进行反应，将核桃仁多肽制备成微粒，能够有效地掩盖核桃仁多肽存在的苦味，抑制微生物的生长，提高对核桃仁多肽的载量，进一步增强核桃仁多肽的作用效果，拓宽其应用范围。对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。当前第1页12