一种方格星虫三肽、方格星虫三肽金属螯合物及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种方格星虫三肽、方格星虫三肽金属螯合物及其应用。


背景技术：

2.随着生活水平的提高，工作压力的增大，人体自由基产生愈来愈多，对人类的身体健康威胁也愈来愈严重。
3.自由基(ros)是一种缺乏电子的物质，当人体中自由基过量时，自由基会抢夺原有健康细胞的电子，导致健康细胞失衡继而产生破坏的连锁反应，从而引起加速衰老，表现在皮肤上，皮肤老化，出现皱纹、斑点；表现在头部，引起脂溢性皮炎，引起脱发；表现在心血管系统，导致冠心病、三高等病理状态，对健康身体造成各种各样的伤害。而人类每一天都不自觉的接受自由基的伤害，例：阳光中紫外线照射、电脑辐射、亚健康疲劳感、糖尿病、心血管系统疾病、三高等。所以清除自由基成为人类毕生中的任务。
4.自由基从产生到衰亡的过程就是电子转移的过程，损害人体健康的自由基几乎都与那些活性较强的含氧物质有关，因此自由基对人体的损害实际上是一种氧化过程，要降低自由基的损害，就要从抗氧化做起。
5.沙虫是湛江的特产海产品，学名为方格星虫。方格星虫可入药。药性：味甘、咸，性寒。入脾、胃经。功能与主治：滋阴降火。主治阴虚盗汗，骨蒸潮热，肺痨咳嗽，牙龈肿痛。《中国药用海洋生物》：“滋阴降火。用于骨蒸潮热，阴虚盗汗，肺痨咳嗽，胸闷痰多等症。”《中国药用动物志》：“健脾。主治夜尿症。”方格星虫富含蛋白质，多肽成分，17种氨基酸，其中人体必需的氨基酸含量很高，除此之外还含有钙、磷、铁、锌、锰、镁等12种微量元素以及虫草素等具有抗氧化、抗菌、抗辐射、抗病毒、抗疲劳、防癌、调节免疫、延缓衰老作用的营养成分。
6.因此，以方格星虫为研究对象，开发一种具有抗氧化作用的多肽具有重要的应用价值。


技术实现要素：

7.为了克服现有技术中存在的至少之一的技术问题，本发明首先提供了一种方格星虫三肽。该方格星虫三肽可以通过方格星虫经酶解得到；也可以通过人工合成方法合成得到。研究表明，所述的方格星虫三肽具有抗氧化作用；尤其是，经发明进一步研究表明，所述的方格星虫三肽还具有促进毛发再生作用。
8.本发明所要解决的技术问题，通过以下技术方案予以实现：
9.本发明的第一方面，提供了一种方格星虫三肽，其氨基酸序列为ser-arg-pro (如seq id no.1所示)。
10.该方格星虫三肽可以通过方格星虫经酶解得到，也可以通过常规的多肽合成方法合成得到。
11.本发明的第二方面，提供了一种方格星虫三肽金属螯合物，其通过包含如下步骤
的方法制备得到：
12.s01.将方格星虫三肽用水溶解；
13.s02.向溶解有方格星虫三肽的水中加入金属盐，在水浴中进行螯合反应；
14.s03.向反应液中加入无水乙醇，搅拌后离心；
15.s04.取沉淀放入无水乙醇中震荡洗涤；
16.s05.取洗涤后的沉淀加入无水乙醇，置于-15～-25℃下冷冻保存；冷冻保存后分离沉淀即得所述的方格星虫三肽金属螯合物；
17.步骤s02中的金属盐为锌盐或镁盐；若加入锌盐则制备得到方格星虫三肽锌螯合物；若加入镁盐则制备得到方格星虫三肽镁螯合物。
18.发明人进一步研究，发明人惊奇的发现，通过上述方法制备得到的方格星虫三肽锌螯合物以及方格星虫三肽镁螯合物，其抗氧化作用以及促进毛发再生作用要远远好于方格星虫三肽。
19.优选地，所述的方格星虫三肽锌螯合物具体通过如下方法制备得到：
20.s11.将方格星虫三肽加水，调节ph值为5～6；搅拌溶解；
21.s12.向溶解有方格星虫三肽的水中加入锌盐，在50～60℃的水浴中进行螯合反应30～50min；
22.s13.向反应液中加入无水乙醇，搅拌后离心；其中，无水乙醇与反应液的体积比为2～5:1；
23.s14.取沉淀放入无水乙醇中震荡洗涤1～3min；
24.s15.取洗涤后的沉淀加入无水乙醇，置于-15～-25℃下冷冻保存；冷冻保存后分离沉淀即得所述的方格星虫三肽金属螯合物；其中，洗涤后的沉淀与无水乙醇的用量比为1g:2～5ml。
25.进一步优选地，步骤s11中方格星虫三肽与水的质量比为1:20～30。
26.最优选地，步骤s11中方格星虫三肽与水的质量比为1:25。
27.进一步优选地，步骤s12中方格星虫三肽与锌盐的质量比为2～3:1。
28.最优选地，步骤s12中方格星虫三肽与锌盐的质量比为2.5:1。
29.优选地，所述的方格星虫三肽镁螯合物具体通过如下方法制备得到：
30.s21.将方格星虫三肽加水，调节ph值为7；搅拌溶解；
31.s22.向溶解有方格星虫三肽的水中加入镁盐，在65～75℃的水浴中进行螯合反应40～60min；
32.s23.向反应液中加入无水乙醇，搅拌后离心；其中，无水乙醇与反应液的体积比为2～5:1；
33.s24.取沉淀放入无水乙醇中震荡洗涤1～3min；
34.s25.取洗涤后的沉淀加入无水乙醇，置于-15～-25℃下冷冻保存；冷冻保存后分离沉淀即得所述的方格星虫三肽金属螯合物；其中，洗涤后的沉淀与无水乙醇的用量比为1g:2～5ml。
35.进一步优选地，步骤s21中方格星虫三肽与水的质量比为1:25～35。
36.最优选地，步骤s21中方格星虫三肽与水的质量比为1:25；
37.进一步优选地，步骤s22中方格星虫三肽与锌盐的质量比为2.5～3.5:1。
38.最优选地，步骤s02中方格星虫三肽与锌盐的质量比为3:1。
39.本发明的第三方面，提供了一种组合物，其包含方格星虫三肽和方格星虫三肽金属螯合物。
40.优选地，方格星虫三肽和方格星虫三肽金属螯合物的质量比为1:3～5。
41.发明人在进一步地研究过程中，惊奇的发现，将方格星虫三肽和方格星虫三肽金属螯合物组合后得到的组合物，方格星虫三肽和方格星虫三肽金属螯合物组合可以产生协同抗氧化作用；使得其抗氧化作用要进一步好于单独使用方格星虫三肽或方格星虫三肽金属螯合物。
42.本发明的第四方面，提供了上述方格星虫三肽、方格星虫三肽金属螯合物或组合物在制备具有促进毛发再生作用或抗氧化作用的产品中的应用。
43.优选地，所述的产品包括日化产品、药品和保健品。
44.有益效果：本发明提供了一种全新结构的方格星虫三肽；所述的方格星虫三肽不仅具有抗氧化作用还具有促进毛发再生作用。发明人进一步研究表明，通过本发明方法制备得到的方格星虫三肽锌螯合物以及方格星虫三肽镁螯合物，其抗氧化作用以及促进毛发再生作用要远远好于方格星虫三肽。因此，将所述的方格星虫三肽和/或方格星虫三肽金属螯合物用于制备日化产品、药品和保健品，可以使得日化产品、药品和保健品具有抗氧化作用以及促进毛发再生作用。
附图说明
45.图1为方格星虫三肽的质谱图。
46.图2为方格星虫三肽的液相色谱图。
具体实施方式
47.以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。
48.实施例1方格星虫三肽的制备
49.(1)取250mg fmoc-ser(tbu)-oh树脂倒入反应柱中，加入dmf浸泡30min，抽干；再加入哌啶dmf溶液，振荡后滤出溶剂；
50.(2)向反应柱中加入适量脱保护溶液(哌啶＝20％六氢吡啶+80％dmf)，通氮气搅拌鼓动30分钟，抽干，向反应柱中加入适量dmf，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作6次；
51.(3)加入fmoc-arg(pbf)-oh、缩合剂hbtu以及有机碱nmm，氮气搅拌鼓动30分钟，进行缩合反应；其中，fmoc-arg(pbf)-oh、缩合剂hbtu以及有机碱nmm与fmoc-ser(tbu)-oh树脂的摩尔用量比为3:2.85:6:1；
52.(4)缩合反应完毕后，将反应柱中的溶液抽干，加入适量dmf洗涤，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操作3次；
53.(5)参照步骤2～4加入fmoc-pro-oh进行缩合反应；反应完毕后脱除 fmoc-pro-oh上面的保护基fmoc，使n端裸露出来；
54.(6)抽干，向反应柱中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，再加入适量 dcm，氮气鼓动2分钟，抽干重复操作3次。最后反应釜中加入适量甲醇，氮气鼓动2分钟，抽干，重复操
作2次，将树脂装入合适器皿中置于真空干燥器内真空干燥12小时待切割；
55.(7)将干燥后的树脂装入合适的圆底烧瓶中，加入适量切液(1g/10ml，组成为87.5％tfa+5％苯甲硫醚+2.5％苯酚+2.5％edt+2.5％h2o)，放置于恒温摇床中25℃恒温振荡2小时；过滤：用50ml的砂芯漏斗过滤掉树脂颗粒，然后将滤液倒入离心管的玻璃容器内，加入6-8倍体积量的无水乙醚，边加边搅拌，析出的白色固体为即所需多肽粗品；
56.(8)将白色固体分装进离心管中，离心管密封后放入离心机中以4000r/min 的转速离心3分钟，取出，将上层清液倒掉，再加入乙醚，用玻璃棒搅拌均匀，再次离心；如此重复操作洗涤5次；
57.(9)将已洗涤5次的后的多肽放入真空干燥器中真空干燥24小时；进一步采用高效液相色谱进行纯化，得氨基酸序列为ser-arg-pro方格星虫三肽的纯品 (氨基酸序列为ser-arg-pro的方格星虫三肽的液相色谱图见图2)；
58.所述的高效液相色谱条件为如下：
59.色谱柱型号：250*4.6mm,boston green ods-aq；
60.检测波长为：220nm；
61.流速为：1.0ml/min；
62.流动相a:含有0.1％三氟乙酸(tfa)的水；
63.流动相b:含有0.1％三氟乙酸(tfa)的乙腈；
64.梯度洗脱条件：0.1min时，流动相b的体积为5％；25min时，流动相b的体积上升到30％；25.01min时，流动相b的体积上升到100％；30min时，流动相b的体积为100％。
65.氨基酸序列为ser-arg-pro的方格星虫三肽的质谱图(见图1)显示有359.3的 [m+h]
+
离子峰；这与氨基酸序列为ser-arg-pro方格星虫三肽的分子量358一致，说明成功合成了氨基酸序列为ser-arg-pro方格星虫三肽。
[0066]
实施例2方格星虫三肽锌螯合物的制备
[0067]
(1)溶解：取按实施例1方法制备得到的方格星虫三肽，置于烧杯中，加入超纯水(方格星虫三肽：超纯水质量比1：25)，搅拌、溶解，调ph值 5.5；
[0068]
(2)螯合反应：将烧杯置于55℃水浴中，搅拌下加入硫酸锌(方格星虫三肽：锌的质量比为2.5∶1)，螯合反应35min。放置室温；
[0069]
(3)洗涤：向反应液中加入无水乙醇洗涤，搅拌10min，离心(5000r/min) 10min；其中，无水乙醇与反应液的体积比为2:1；
[0070]
(4)纯化：取沉淀加入无水乙醇震荡洗涤2min，离心(5000r/min)10min，重复上述的步骤2次，去除游离zn++，再次加入无水乙醇，置于-20℃冰箱内 36h；其中，洗涤后的沉淀与无水乙醇的用量比为1g:3ml；
[0071]
(5)冷冻干燥：离心后的置于冷冻干燥机内，冷冻干燥，得白色晶体，即所述的方格星虫三肽锌螯合物。
[0072]
实施例3方格星虫三肽镁螯合物的制备
[0073]
(1)溶解：取按实施例1方法制备得到的方格星虫三肽，置于烧杯中，加入超纯水(方格星虫三肽：超纯水质量比1：30)，搅拌、溶解，调ph值7.0；
[0074]
(2)螯合反应：将烧杯置于70℃水浴中，保温10min，搅拌下加无水mgci
2 (方格星虫三肽镁质量比为3：1)，螯合反应45min，放置室温；
[0075]
(3)洗涤：向反应液中加入无水乙醇，搅拌10min，离心(5000r/min)10min；其中，无水乙醇与反应液的体积比为2:1；
[0076]
(4)纯化：取沉淀加入无水乙醇，震荡洗涤，离心，分离上清液检测游离 mg
++
，若产生白色沉淀，就重复上述的步骤，直至检验无mg
++
为止；再次加入无水乙醇，置于-20℃冰箱内36h；其中，洗涤后的沉淀与无水乙醇的用量比为 1g:3ml；
[0077]
(5)冷冻干燥：将沉淀置于冷冻干燥机内，冷冻干燥，得白色晶体，即所述的方格星虫三肽镁螯合物。
[0078]
实施例4组合物的制备
[0079]
将按实施例1制备得到的方格星虫三肽与实施例2制备得到的方格星虫三肽锌螯合物按质量比1:4混合均匀即得所述的组合物。
[0080]
实施例5组合物的制备
[0081]
将按实施例1制备得到的方格星虫三肽与实施例3制备得到的方格星虫三肽镁螯合物按质量比1:4混合均匀即得所述的组合物。
[0082]
实验例1抗氧化能力测试
[0083]
采用dpph法评价方格星虫三肽、方格星虫三肽锌螯合物的抗氧化能力。具体方法如下：
[0084]
用体积分数为90％的乙醇配制100μmol/l的dpph乙醇溶液；用水配制 1mg/ml的方格星虫三肽、方格星虫三肽锌螯合物以及组合物得待测样品溶液；将0.5ml待测样品与2.5ml的dpph乙醇溶液混合均匀，在37℃下避光孵育 30min后，在517nm处测定反应溶液的吸光度；每个样品平行测试3次，取平均值；dpph自由基清除率的公式为：dpph自由基清除率(％)＝(1-(a
x-ay)/az)
ꢀ×
100；
[0085]
式中，a
x
为0.5ml待测样品溶液与2.5ml的dpph乙醇溶液孵育后的吸光度；ay为0.5ml待测样品溶液与2.5ml的体积分数为90％的乙醇溶液孵育后的吸光度；az为0.5ml的水与2.5ml的dpph乙醇溶液孵育后的吸光度。测试结果见表1。
[0086]
表1.dpph自由基清除率测试结果
[0087]
待测样品dpph自由基清除率实施例1制备得到的方格星虫三肽62％实施例2制备得到的方格星虫三肽锌螯合物85％实施例3制备得到的方格星虫三肽镁螯合物81％实施例4制备得到的组合物99％实施例5制备得到的组合物95％
[0088]
从表1 dpph自由基清除率测试结果可以看出，本发明提供的方格星虫三肽其在1mg/ml的浓度时对dpph自由基清除率为62％；这说明，其具有一定的抗和氧化能力。
[0089]
进一步地，实施例2和3制备得到的方格星虫三肽锌螯合物和方格星虫三肽镁螯合物，其dpph自由基清除率达到了85％和81％；与方格星虫三肽相比，有了大幅地提升；这说明由本发明制备得到的方格星虫三肽锌螯合物和方格星虫三肽镁螯合物，其抗氧化能力要好于方格星虫三肽。
[0090]
进一步地，实施例4和5制备得到的组合物，其dpph自由基清除率达到了 99％和95％；远远高于方格星虫三肽、方格星虫三肽锌螯合物以及方格星虫三肽镁螯合物；这说明
方格星虫三肽与方格星虫三肽锌螯合物或方格星虫三肽镁螯合物组合后，方格星虫三肽与方格星虫三肽锌螯合物或方格星虫三肽镁螯合物之间会发生协同抗氧化作用，其抗氧化能力得到了进一步地提高。
[0091]
实验例2促进毛发再生能力测试
[0092]
将12只sd大鼠的背部用10％nas溶液脱毛，随机分为4组，每组3只；其中实验组1的脱毛大鼠涂抹实施例1制备得到的方格星虫三肽水溶液；实验组 2的脱毛大鼠涂抹实施例2制备得到的方格星虫三肽锌螯合物水溶液；实验组3 的脱毛大鼠涂抹实施例3制备得到的方格星虫三肽镁螯合物水溶液；实施例4 每天涂抹等量的水；三肽与方格星虫三肽锌螯合物或方格星虫三肽镁螯合物水溶液的浓度为1mg/l，每天涂抹3次，每次涂抹1ml；7天后观察毛发生长情况；以及测量生长的毛发的平均长度；实验结果见表2。
[0093]
表2.促进毛发再生能力测试
[0094][0095]
从表2实验中可以看出，本发明所述的三肽与方格星虫、三肽锌螯合物或方格星虫三肽镁螯合物均具有促进毛发再生作用；且方格星虫三肽锌螯合物或方格星虫三肽镁螯合物其促进毛发再生作用要远远好于三肽与方格星虫。
[0096]
实施例6生发液的制备
[0097]
配方：方格星虫三肽锌螯合物0.7％，方格星虫三肽镁螯合物0.35％，卡波姆u-20 0.025％，甘油1.0％，三乙醇胺0.05％，尼铂金乙酯0.2％，95％乙醇10％，其余为无菌水。
[0098]
制备方法：取卡波姆u20、甘油加入少量无菌去离子水，浸泡12-15h，使其充分膨胀，得到卡波姆u20混合液；加入三乙醇胺，调ph值5.5-6.5，搅拌混匀，得到卡波姆u20凝胶液；加入金属螯合肽水溶液，尼铂金乙酯乙醇溶液搅拌混匀，最后加入无菌去离子水至全量，混匀即得所述的生发液。