一种耐盐节杆菌及其固氮应用

1.本发明涉及一种耐盐节杆菌及其固氮应用，属于微生物学和环境保护技术领域。


背景技术：

2.氮元素是植物生长最重要的营养元素之一。目前，我国农业想要提高氮含量，主要通过施用化肥。但由于农业技术滞后，及不当的化肥施用方法，导致化肥利用率低，在多雨或灌溉较为频繁地区，速效氮会随雨水或灌溉用水流失。不仅流失率极高，含大量含氮污水流入水体也是富营养化的一大成因。
3.由于化肥的过度施用，会导致土壤污染、有毒物质积累，导致土壤生物群落改变，对土壤有益的动物种类、数量减少，致使土壤板结，团粒结构遭到破坏，营养物质分解不充分，破坏了土壤生态结构，致使微生物驱系恶化、酶活性下降、病原菌增多。导致土壤肥力下降，进而化肥使用量被迫增多，形成恶性循环。不仅加重了农业生产成本，也造成了资源的极大浪费，更加剧了一系列环境问题。
4.因此，从自然界中筛选出有较强固氮能力的菌株，从而将其制成生物菌制剂，应用于提高土壤氮含量，将有实际的应用价值，成为该技术领域需要解决的技术难题。


技术实现要素：

5.本发明的目的之一是针对上述现有技术存在的问题，提供一种能高效固氮的耐盐节杆菌株。
6.本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
7.一种耐盐节杆菌，其分类命名为耐盐节杆菌株(arthrobacter pascens)，保藏编号为cgmcc no.20974；保藏日为2020年10月29日，保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称cgmcc)；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路，中国科学院微生物研究所。
8.本发明的另一目的是提供上述耐盐节杆菌的培养方法。
9.本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
10.一种耐盐节杆菌菌株的培养方法，其步骤如下：
11.(1)、培养基的制备
12.ashby无氮培养基：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，蒸馏水1.0l；，在121℃下，恒温灭菌20分钟；
13.固体ashby无氮培养基：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0l；在121℃下，恒温灭菌20分钟；
14.(2)、第一代培养
15.称取土壤样品，放入装有适量玻璃珠和无菌水的锥形瓶中，静置，在振荡培养箱中振荡，制成菌悬液母液；
16.(3)富集培养：取菌悬液母液，加入ashby无氮培养基中，培养1
‑
2天，然后稀释104、
105、106倍，得到10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释浓度的样品溶液；
17.(4)倒平板：将ashby无氮培养基(分离、纯化培养基)放置在立式压力蒸汽灭菌器中，经过121℃、20min灭菌后，冷却至60℃时，倒平板；
18.(5)平板涂布：10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释浓度的样品溶液，用灭菌后的三角玻璃棒分别均匀涂布到各个培养基表面；
19.(6)培养：将涂有菌液的平板放在30℃恒温生化培养箱中，倒置培养3天；
20.(7)初步筛选：从各个平板中挑取长势明显的大型菌落，在ashby无氮培养基上进行平板划线，倒置放在30℃恒温培养箱中培养2天，然后，挑取长势明显的大型菌落，在耐盐ashby无氮培养基(即在ashby无氮培养基上添加1.5％的nacl)上进行平板划线，倒置放在30℃恒温培养箱中培养2天，反复进行3次，同时用显微镜观察菌落纯度，直至获得纯培养的耐盐节杆菌菌株。
21.优选地，步骤(2)中，土壤样品的采集如下：采用三点取样法，用小铁铲去除表层土，取地面以下15～20cm深处的小麦根际土壤，三点土样混合为一份，装入无菌袋中，放置于冰箱内4℃保存。
22.优选地，步骤(3)中，富集培养的条件：160rpm、35℃的条件，培养2天。
23.优选地，采样地位于北京市通州区潞城镇八各庄村(39
°
52
‘
50.365"n，116
°
46’25.986"e)，土壤类型主要为粘潮黄土，主栽作物为小麦；土样样品的釆集采用三点取样法；用小铁铲去除表层土，取地面以下15～20cm深处的小麦根际土壤，三点土样混合为一份，每份重量3kg，分别装入无菌袋中，放置于冰箱内4℃保存；
24.优选地，首先，将所采集的土壤与无菌水混合振荡，制成菌悬浮液；接着，将悬浮液离心后的离心液接种到富集培养基中进行富集培养；然后将富集培养物涂布于平板分离纯化培养基上，反复进行平板涂布，进行分离纯化培养，直到分离得到具有固氮能力的耐盐节杆菌。
25.优选地，所述富集培养是在转速为160rpm，温度为30℃的条件培养1
‑
2天。
26.优选地，所述分离纯化培养的条件是温度为35℃，培养时间为3
‑
7天。
27.本发明的耐盐节杆菌具有以下特征：
28.耐盐节杆菌适宜在中性偏碱性ph7.4的培养介质中生长，适合的生长温度为25
‑
35℃，其细菌学形态特征为：革兰氏阳性，菌体长杆状，无鞭毛，体积大小约为(0.8μm
‑
1.2μm)
×
(0.2μm
‑
0.4μm)。
29.16s rrna基因序列特征为：耐盐节杆菌的16srrna序列长度为1418bp。
30.本发明的再一方面是提供上述耐盐节杆菌菌株在固氮方面的应用。
31.本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
32.耐盐节杆菌在固氮方面的应用，将所述耐盐节杆菌接种于阿什比无氮培养基(ashby nitrogen
‑
free medium)(ashby无氮培养基)中，振荡培养，使耐盐节杆菌在培养基中固氮。
33.优选地，所述ashby无氮培养基制备如下：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，蒸馏水1.0l，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟。
34.优选地，所述应用具体如下：(1)、制备耐盐节杆菌株的湿细胞：用接种环挑取适量
的用于保藏菌种的斜面培养基上的耐盐节杆菌落，在已灭菌的固体ashby无氮培养基(所述固体ashby无氮培养基制备如下：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0l；在121℃下，恒温灭菌20分钟)上进行划线，35℃培养3天后，即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得耐盐节杆菌湿细胞；(2)、培养基固氮试验：将步骤(1)得到的耐盐节杆菌的湿细胞，接种于富集培养基，其中，每50ml富集培养基中接种0.5g的耐盐节杆菌湿细胞；然后在35℃、ph＝7.4、摇床转速140rpm的条件下进行培养。
35.本发明又一方面提供一种耐盐节杆菌在土壤中固氮的应用。
36.本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
37.耐盐节杆菌在土壤中固氮的应用，将所述耐盐节杆菌在ashby无氮培养基中培养后的耐盐节杆菌液，接种于土壤中继续培养。
38.优选地，所述应用具体如下：(1)用接种环挑取适量的用于保藏菌种的斜面培养基上的耐盐节杆菌落，在已灭菌的固体ashby无氮培养基上进行划线，35℃培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得耐盐节杆菌湿细胞；(2)将耐盐节杆菌的湿细胞接种于富集培养基，其中，每50ml富集培养基中接种0.5g的耐盐节杆菌湿细胞；然后在35℃、ph＝7.4、摇床转速140rpm的条件下培养3天，获得耐盐节杆菌液；(3)在北京工商大学花园取土，装入垫有滤纸的花盆中，每盆装土500g；(4)量取耐盐节杆菌液50ml浇入花盆，用封口膜盖住花盆，防止水分蒸发，在膜上戳出小孔，提供空气，在室温培养10天。
39.优选地，所述ashby无氮培养基的组成如下：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，蒸馏水1.0l，培养基在121℃下恒温灭菌20分钟。
40.优选地，所述固体ashby无氮培养基：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0l；在121℃下，恒温灭菌20分钟。
41.本发明又一方面提供所述的耐盐节杆菌制备的耐盐节杆菌肥在土壤中固氮的应用。
42.本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
43.耐盐节杆菌制备的耐盐节杆菌肥在土壤中固氮的应用，将所述耐节杆菌接种于餐厨废液中，进行耐盐节杆菌培养，之后接种在土壤中继续培养，固氮。
44.优选地，所述应用具体如下：(1)用接种环挑取适量的用于保藏菌种的斜面培养基上的耐盐节杆菌落，在已灭菌的固体ashby无氮培养基上进行划线，35℃培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得耐盐节杆菌湿细胞；(2)在大学食堂取餐厨垃圾，将取回的餐厨垃圾在搅拌机中粉碎，装入湿热反应器中，在通风橱中用100℃油浴锅加热反应60min，待反应结束后，将处理后的餐厨垃圾装入离心管中使用高速离心机，以6000rpm、4℃的条件下离心20min，将离心后的餐厨垃圾除去油脂后，倒出其余餐厨垃圾废液过滤，灭菌后备用；(3)将纯化后的耐盐节杆菌以ph＝6，温度35℃，摇床转速100rpm，每50ml餐厨废液中接种0.5g耐盐节杆菌湿细胞的条件接种到餐厨垃圾废液中培养3天，获得耐盐节杆菌肥；(4)取土，装入垫有滤纸的花盆中，每盆装土500g；(5)量取耐盐节杆菌肥50ml浇入花盆，为减少表面水分蒸发，在盆钵表面覆盖一层封口膜，并在封口膜表面对称开4个小孔透气，室
0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0l；在121℃下，恒温灭菌20分钟；
65.2、富集培养
66.采样地点位于北京市通州区潞城镇八各庄村(39
°
52’50.365"n，116
°
46’25.986"e)，土壤类型主要为粘潮黄土，主栽作物为小麦；
67.土样样品的釆集，采用三点取样法，用小铁铲去除表层土，取地面以下15～20cm深处的小麦根际土壤，三点土样混合为一份，装入无菌袋中，放置于冰箱内4℃保存；
68.(1)第一代培养
69.称取土壤样品10g，放入装有适量玻璃珠和100ml无菌水的250ml锥形瓶中，静置20min后，以200rpm在振荡培养箱中振荡30min，经过充分振荡，细胞分散，制成菌悬液母液；
70.(2)富集培养：从锥形瓶中取菌悬液母液5ml，加入到装有100ml液体的富集培养基的250ml锥形瓶中，以160rpm、35℃的条件，培养2天，然后将悬液稀释104、105、106倍，得到10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释浓度的样品溶液；
71.(3)倒平板：将ashby无氮培养基放置在立式压力蒸汽灭菌器中，经过121℃、20min灭菌后，冷却至60℃时，倒平板；
72.(4)平板涂布：10
‑4、10
‑5、10
‑6三个稀释浓度的样品溶液，各取100μl，用灭菌后的三角玻璃棒分别均匀涂布到各个培养基表面；
73.(5)培养：将涂有菌液的平板放在30℃恒温生化培养箱中，倒置培养3天；
74.(6)初步筛选：从各个平板中挑取长势明显的大型菌落，在固体ashby无氮培养基上进行平板划线，倒置放在30℃恒温培养箱中培养2天，然后，挑取长势明显的大型菌落，在耐盐固体ashby无氮培养基(即在ashby无氮培养基上添加1.5％的nacl)上进行平板划线，倒置放在30℃恒温培养箱中培养2天，反复进行3次，同时用显微镜观察菌落纯度，直至获得纯培养的耐盐节杆菌菌株。
75.实施例2：耐盐节杆菌菌株的微生物学特性研究
76.1、菌落形态观察
77.将分离、纯化培养得到的耐盐节杆菌菌株划线接种于ashby无氮培养基中，于35℃下培养至长出菌落，观察菌落形态，结果如下：
78.革兰氏阳性，菌落呈圆形，光滑，透明，边缘整齐，菌体长杆状，无鞭毛，单个，体积大小约为(0.8μm
‑
1.2μm)
×
(0.2μm
‑
0.4μm)；
79.2、细胞形态观察
80.挑取在ashby无氮培养基上培养2天的菌株菌落，依次用戊二醛固定、磷酸盐缓冲液(ph＝7.2)漂洗，梯度乙醇脱水，醋酸异戊酯处理，二氧化碳临界点干燥，喷金，将样品放入观察室后进行电镜扫描(德国蔡司sigma300,eht＝1.00kv、signal＝se2、mag＝16.29k
×
、wd＝5.8mm)，电镜扫描结果如图1所示，表明耐盐节杆菌细胞呈长杆状；
81.本发明中所提及的耐盐节杆菌株，经中国工业微生物菌种保藏管理中心鉴定，是一株在自然界中发现的新菌株，迄今为止未经报道；
82.3、16srrna基因序列测定
83.将接种于ashby无氮培养基中的耐盐节杆菌，于35℃，150rpm黑暗条件下培养20天后，采用dna提取试剂盒提取耐盐节杆菌的dna，对提取的耐盐节杆菌的16srrna进行pcr扩
增，在1％的琼脂糖凝胶上点样5μl，扩增产物选用通用引物进行三个测序反应，将三个序列结果拼接为完整的16srrna序列，将耐盐节杆菌的16srrna序列应用blastn程序与gen bank等数据库中已报道的序列进行核苷酸序列相似度分析，选取与菌株相似性大于99％的菌株，对菌株进行同源性分析并参照文献，测序结果见序列表1，其中，菌株的16srrna(seq id no.1)序列长度为1418bp，根据菌株的菌落形态特征，细胞形态特征以及其16srrna基因序列的比对结果，鉴定菌种属于耐盐节杆菌。
84.本发明的耐盐节杆菌菌株已于2020年10月29日保藏于“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，其菌株名称为耐盐节杆菌(arthrobacter pascens)，在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”的保藏编号为cgmcc no.20974。
85.序列表1
86.[0087][0088][0089]
实施例3
[0090]
1、制备耐盐节杆菌株的湿细胞
[0091]
用接种环挑取适量的用于保藏菌种的斜面培养基上的耐盐节杆菌落，在已灭菌的固体ashby无氮培养基上进行划线，35℃培养3天后，即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得耐盐节杆菌湿细胞；所述固体ashby无氮培养基制备如下：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0l；在121℃下，恒温灭菌20分钟。
[0092]
2、培养基固氮试验
[0093]
将步骤1得到的耐盐节杆菌的湿细胞，接种于富集培养基，其中，每50ml富集培养基中接种0.5g的耐盐节杆菌湿细胞；然后在35℃、ph＝7.4、摇床转速140rpm的条件下进行培养，测定接种前培养基和接种后每天的培养液中凯氏氮的浓度值，测定结果如图2所示，为本发明实施例3和对照例1中培养基中凯氏氮浓度变化图；
[0094]
本实施例3使用的富集培养基是ashby无氮培养基具体成分为：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，蒸馏水1.0l；所述固体ashby无氮培养基：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0l；在121℃下，恒温灭菌20分钟，培养液中的凯氏氮含量使用凯氏定氮仪测定；
[0095]
测定结果表明：本发明耐盐节杆菌具有很好固氮能力，能使培养液中凯氏氮含量上升，在接种量为0.5g湿细胞/50ml培养液时，可以使培养液在14天之内，凯氏氮含量上升8.6％。
[0096]
对照例1
[0097]
接种耐盐节杆菌的湿细胞后，立即进行高压蒸汽灭菌，即在高压下蒸汽灭菌20分钟，使接种的耐盐节杆菌立即灭活之外，得到无生物活性的对照组，其余与实施例3相同，测定接种前培养基和接种后每天的相应培养液中凯氏氮浓度，测定结果如图2所示，为本发明实施例3和对照例1中培养基中凯氏氮浓度变化图；
[0098]
测定结果是对照例1的培养液中的凯氏氮浓度基本保持不变，对照测定结果表明：培养液中凯氏氮含量上升是由耐盐节杆菌引起的，而灭菌后的生物菌体物无固氮能力，因此，耐盐节杆菌能使培养基中凯氏氮含量上升，可用于固氮。
[0099]
试验例1：
[0100]
耐盐节杆菌液在土壤中固氮效果试验
[0101]
1)用接种环挑取适量的用于保藏菌种的斜面培养基上的耐盐节杆菌落，在已灭菌的固体ashby无氮培养基上进行划线，35℃培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得耐盐节杆菌湿细胞；所述固体ashby无氮培养基制备如下：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0l；在121℃下，恒温灭菌20分钟。
[0102]
2)将耐盐节杆菌的湿细胞接种于富集培养基(具体成分为：甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g)，其中，每50ml富集培养基中接种0.5g的耐盐节杆菌湿细胞；然后在35℃、ph＝7.4、摇床转速140rpm的条件下培养3天，获得耐盐节杆菌液；
[0103]
3)在北京工商大学花园取土，装入垫有滤纸的花盆中，每盆装土500g；
[0104]
4)量取耐盐节杆菌液50ml浇入花盆，用封口膜盖住花盆，防止水分蒸发，在膜上戳出小孔，提供空气，在室温培养10天；
[0105]
5)按照碱解扩散法测定接种后每天的土壤中速效氮浓度，测定结果如图3所示，为本发明试验例1和对照例2中耐盐节杆菌液在土壤中固氮过程中土壤速效氮浓度变化图；
[0106]
测定结果显示：在接种耐盐节杆菌液之后，耐盐节杆菌即开始固氮，土壤中速效氮含量上升，接种10天后，土壤中速效氮含量浓度上升15.6％，说明耐盐节杆菌能有效提升土壤速效氮含量，表明耐盐节杆菌有固氮能力。
[0107]
对照例2
[0108]
接种耐盐节杆菌的湿细胞后立即进行高压蒸汽灭菌，即在高压下蒸汽灭菌20分钟，使接种的耐盐节杆菌立即灭活之外，得到无生物活性的对照组，其余与试验例1相同，测定接种前土壤和接种后每天的相应土壤速效氮含量，测定结果如图3所示，为本发明试验例1和对照例2中耐盐节杆菌液在土壤中固氮过程中土壤速效氮浓度变化图；
[0109]
测定结果是对照例2的土壤速效氮浓度基本保持不变，对照测定结果表明：土壤中速效氮含量上升是由耐盐节杆菌引起的，而灭菌后的生物菌体物无固氮能力，因此，耐盐节杆菌能使土壤中速效氮含量上升，可用于固氮。
[0110]
试验例2：
[0111]
耐盐节杆菌肥在土壤中固氮效果试验
[0112]
所述固体ashby无氮培养基制备如下：(甘露醇10g，kh2po
4 0.2g，mgso4·
7h2o 0.2g，nacl 0.2g，caso4·
2h2o 0.1g，caco
3 5.0g，琼脂15g，蒸馏水1.0l；在121℃下，恒温灭菌20分钟)；
[0113]
1)用接种环挑取适量的用于保藏菌种的斜面培养基上的耐盐节杆菌落，在已灭菌的固体ashby无氮培养基上进行划线，35℃培养3天后即可得到长有明显菌落的培养基平板，获得耐盐节杆菌湿细胞；
[0114]
2)在大学食堂取餐厨垃圾，将取回的餐厨垃圾在搅拌机中粉碎，装入湿热反应器中，在通风橱中用100℃油浴锅加热反应60min，待反应结束后，将处理后的餐厨垃圾装入离心管中使用高速离心机，以6000rpm、4℃的条件下离心20min，将离心后的餐厨垃圾除去油脂后，倒出其余餐厨垃圾废液过滤，灭菌后备用；
[0115]
3)将纯化后的耐盐节杆菌以ph＝6，温度35℃，摇床转速100rpm，每50ml餐厨废液中接种0.5g耐盐节杆菌湿细胞的条件接种到餐厨垃圾废液中培养3天，获得耐盐节杆菌肥；
[0116]
4)在北京工商大学花园取土，装入垫有滤纸的花盆中，每盆装土500g；
[0117]
5)量取耐盐节杆菌肥50ml浇入花盆，为减少表面水分蒸发，在盆钵表面覆盖一层封口膜，并在封口膜表面对称开4个小孔透气，室温培养35天；
[0118]
6)按照碱解扩散法测定接种后第5、10、15、20、25、35天的土壤中速效氮浓度，测定结果如图4所示，为本发明试验例2和对照例3中耐盐节杆菌肥在土壤中固氮过程中土壤速效氮浓度变化图；
[0119]
测定结果显示：在接种耐盐节杆菌肥之后，从接种后速效氮即开始上升，35天后速效氮含量上升27.92％，说明耐盐节杆菌肥能使土壤中速效氮含量上升，表明耐盐节杆菌具有固氮能力。
[0120]
对照例3
[0121]
接种耐盐节杆菌的湿细胞后，立即进行高压蒸汽灭菌，即在高压下蒸汽灭菌20分钟，使接种的耐盐节杆菌立即灭活之外，得到无生物活性的对照组，其余与试验例2相同，测定接种前土壤和接种后第5、10、15、20、25、35天土壤速效氮浓度，测定结果如图4所示，为本发明试验例2和对照例3中耐盐节杆菌肥在土壤中固氮过程中土壤速效氮浓度变化图；
[0122]
测定结果是对照例3的土壤速效氮浓度基本保持不变，对照测定结果表明：土壤中速效氮含量上升是由耐盐节杆菌引起的，而灭菌后的生物菌体物无固氮能力，因此，耐盐节杆菌能使土壤中速效氮含量上升，可用于固氮。
[0123]
实验结果表明：本发明从自然界中筛选耐盐节杆菌株，能够有效固氮，提高土壤中氮含量。