一种引物组合物及其应用

一种引物组合物及其应用
1.本技术要求于2021年9月2日提交中国专利局、申请号为202111026854.3发明名称为“一种引物组合物及其应用”的中国专利申请的优先权，其全部内容通过引用结合在本技术中。
技术领域
2.本技术涉及五灵脂及其混伪品的鉴定技术领域，特别是涉及一种引物组合物及其在鉴定五灵脂及其混伪品中的应用。


背景技术：

3.五灵脂，又名血灵脂、草灵脂、五灵子、寒雀粪、寒号鸟屎，是鼯鼠科复齿鼯鼠(trogopterus xanthipes)的干燥粪便，主产于山西太行山、五台山地区及河北等地。五灵脂性温，味咸、甘，归肝经，具有活血、散瘀、止血、止痛的功效。现代药理学研究表明，五灵脂具有抗炎、抗溃疡、抗血小板聚集、提高免疫等方面的药理活性，在临床上被广泛地应用于心脑血管疾病、妇科疾病、慢性胃炎、胃溃疡等的治疗。
4.五灵脂的基原动物是其真伪的判断标准，混伪品的存在在一定程度上影响了五灵脂临床用药的安全性，但现有鉴定混伪品的方法，如来源鉴定、性状鉴定、显微鉴定等，会受到主观因素的影响，无法完全满足目前中药鉴定的需求。因此，亟需一种更加客观准确的鉴定方法。


技术实现要素：

5.本技术的目的在于提供一种引物组合物，以通过对五灵脂及其混伪品的线粒体基因组cytb基因序列的特异性扩增，经测序后与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因序列进行比对，实现五灵脂及其混伪品的准确鉴定。
6.本技术第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物的序列如seq id no:1所示，所述反向引物的序列如seq id no:2所示。
7.本技术第二方面提供了本技术第一方面提供的引物组合物在鉴定五灵脂及其混伪品中的用途。
8.本技术第三方面提供了一种采用本技术第一方面提供的引物组合物鉴定五灵脂及其混伪品的方法，包括以下步骤：
9.1)提取待测样品的总dna；
10.2)采用所述引物组合物，以待测样品的总dna为模板进行pcr扩增；
11.3)对扩增产物进行测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
12.4)将步骤3)获得的基因序列与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因序列进行比对，鉴定所述待测样品为五灵脂或其混伪品。
13.本技术第四方面提供了一种用于鉴定五灵脂及其混伪品的试剂盒，所述试剂盒中包括本技术第一方面提供的引物组合物。
14.本技术提供的引物组合物，可以用于特异性扩增五灵脂及其混伪品的线粒体基因组cytb基因序列，经测序后与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因序列进行比对，从而实现五灵脂及其混伪品的准确鉴定。
附图说明
15.为了更清楚地说明本技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，还可以根据这些附图获得其他的实施例。
16.图1显示了各待测样品总dna的pcr扩增结果的序列相对丰度热图。
17.图2显示了各中成药样品总dna的pcr扩增结果的序列相对丰度热图。
具体实施方式
18.下面将结合本技术实施例中的附图，对本技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本技术中的实施例，本领域普通技术人员基于本技术所获得的所有其他实施例，都属于本技术保护的范围。
19.本技术第一方面提供了一种引物组合物，包括正向引物和反向引物，其中，所述正向引物为5
’‑
agcatgatgaaattttggttccctc-3’(seq id no:1)，所述反向引物为5
’‑
taagtcagccgtaatttacatctcg-3’(seq id no:2)。
20.本技术第二方面提供了本技术第一方面提供的引物组合物在鉴定五灵脂及其混伪品中的用途。
21.在本技术中，采用本技术的引物组合物鉴定五灵脂及其混伪品，是通过鉴定五灵脂或其混伪品的基原动物，从而实现的五灵脂或其混伪品的鉴定。发明人在研究中发现，本技术的引物组合物，能够同时用于扩增五灵脂及其常见伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因，因此，如果五灵脂药材中混有伪品，对药材的总dna进行pcr扩增的产物中就会出现其伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因片段；以五灵脂及其混伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因为各自的特征序列，通过鉴定扩增结果中是否存在其伪品的基原动物的特征序列，即可鉴定五灵脂的真伪；其中，所述五灵脂的基原动物为复齿鼯鼠，所述混伪品的基原动物包括但不限于红白鼯鼠、小飞鼠、黑白飞鼠、豚鼠、山羊、毛足飞鼠、大飞鼠、栗褐鼯鼠、黄羊、青羊和红耳鼠兔中的至少一种。
22.本技术第三方面提供了一种采用本技术第一方面提供的引物组合物鉴定五灵脂及其混伪品的方法，包括以下步骤：
23.1)提取待测样品的总dna；
24.2)采用所述引物组合物，以待测样品的总dna为模板进行pcr扩增；
25.3)对扩增产物进行测序，分析测序结果，获得扩增产物的基因序列；
26.4)将步骤3)获得的基因序列与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因序列进行比对，鉴定所述待测样品为五灵脂或其混伪品。
27.本技术中，对待测样品总dna的提取方法不做限定，只要能够实现本技术的目的即
可，例如可以采用市售的粪便基因组提取试剂盒即可，如tiangen公司的粪便基因组提取试剂盒。
28.在步骤4)中，所述五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因序列，可以通过常用的基因数据库进行搜索获得，例如由genbank数据库搜索获得。
29.对待测样品的总dna进行pcr扩增可采用常规的pcr扩增体系，例如25μl扩增体系或50μl扩增体系等，本技术在此不做限定。
30.在本技术第三方面的一些实施方式中，pcr扩增体系中包括：
31.0.1-0.3μmol/l正向引物；0.1-0.3μmol/l反向引物；2-10ng/μl模板dna；50-150μmol/l dntps；0.02-0.03u/μl dna聚合酶。
32.dntps以及dna聚合酶均为pcr体系的常规通用试剂，均可市售获得。dna聚合酶可以选择pcr扩增用的常规dna聚合酶，本技术在此不做限定，例如gflex dna聚合酶。
33.当然，所述pcr扩增体系中还包括pcr缓冲液和ddh2o，所述pcr缓冲液根据所用的dna聚合酶的种类确定，可市售获得。通常pcr缓冲液与dna聚合酶需要配合使用，市售dna聚合酶均配有与之配合使用的pcr缓冲液，此为本领域常规操作，本技术在此不做限定。
34.本领域中，pcr缓冲液通常为浓缩的pcr缓冲液，例如可以是2
×
pcr缓冲液、10
×
pcr缓冲液等，本技术对此不做限定，示例性的，对于50μl扩增体系而言，如果采用2
×
pcr缓冲液，其用量通常为25μl，如果采用10
×
pcr缓冲液，其用量通常为5μl；此为pcr扩增的常规用法，本技术在此不做限定。pcr扩增体系中，除缓冲液、引物、模板、dntp及dna聚合酶，剩余体积以双蒸水(ddh2o)或depc水补足，此为本领域常规操作，本技术在此不做限定。
35.在本技术第三方面的一些实施方式中，步骤2)中，pcr扩增的条件包括：
36.预变性：93-95℃，50-70s；变性：97-98℃，8-12s；退火：59-61℃，13-17s；延伸：67-69℃，25-35s；35-45个循环；完成循环后继续67-69℃延伸4-6分钟。
37.其中，“35-45个循环”是指变性、退火、延伸三个过程的循环，此为本领域常规操作，本技术在此不做赘述。
38.本技术中，对扩增产物的测序方法不做限定，只要能够实现本技术的目的即可，例如可以采用一代测序或下一代测序技术。本技术中所述的“一代测序”或“下一代测序”，是本领域公知的测序方法，测序工作一般由专业的商业公司来完成。
39.本技术中，对一代测序或下一代测序的结果进行分析为本领域的常规操作，本技术在此不做限定，只要能够实现本发明的目的即可，例如，可以采用bbduck软件去除引物序列，采用usearch软件或dada2软件进行分析，获得扩增产物的基因序列。
40.本技术第四方面提供了一种用于鉴定五灵脂及其混伪品的试剂盒，所述试剂盒中包括本技术第一方面提供的引物组合物。
41.在本技术第四方面的一些实施方式中，所述试剂盒中还包括pcr缓冲液、ddh2o、dna聚合酶、dntps，及操作说明书。
42.本技术所述“混伪品”，包括五灵脂的伪品，以及正品和伪品混合的五灵脂混伪品。
43.以下结合具体实施例对本技术进行详细说明。
44.1、仪器
45.表1实验主要仪器
[0046][0047]
2、试剂
[0048]
表2实验主要试剂
[0049][0050]
3、材料
[0051]
通过实体药店及网络平台购买，收集129份不同产地、不同基原动物喂养方式的五灵脂样品，取自封袋封存于4℃冰箱中，各待测样品信息见表3，样品1-129为已知组成的样品，并经过天津中医药大学中医药研究院田晓轩教授鉴定，其中样品12-74为五灵脂正品，样品1-11、样品75-129为五灵脂的混伪品，样品129为山羊粪便；表中“生”为生品，“醋”为醋制品。
[0052]
表3
[0053]
[0054][0055]
实施例1五灵脂样品的鉴定
[0056]
1、待测样品总dna提取
[0057]
分别取表3中129份待测样品，每份120mg，分别用剪刀充分剪碎，采用tiangen的粪便基因组dna提取试剂盒进行各待测样品的总dna提取，提取步骤按操作说明书进行。利用nanodrop 2000检测各待测样品总dna的浓度，并用ddh2o以1:10稀释各待测样品总dna的浓度至25-125ng/μl。
[0058]
2、pcr扩增及测序
[0059]
扩增体系：
[0060][0061][0062]
扩增条件：
[0063]
预变性：94℃，60s；变性：98℃，10s；退火：60℃，15s；延伸：68℃，30s；40个循环；完成循环后继续68℃延伸5分钟。
[0064]
pcr扩增产物使用illumina hiseq pe150平台测序。
[0065]
3、待测样品鉴定
[0066]
由genbank数据库搜索获得五灵脂基原动物复齿鼯鼠及其常见混伪品的基原动物豚鼠、红白鼯鼠、山羊及鼯鼠亚族(pteromyini)和鼯鼠属(petaurista)动物的线粒体基因组cytb基因序列。
[0067]
采用bbduck软件去除上述测序结果的引物序列，采用usearch软件进行分析，获得各待测样品中扩增产物的基因序列及各序列的reads数，扩增产物的基因序列与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因序列比对，确定各待测样品组成，结果如图1所示，其中伪品的基原动物包括豚鼠、红白鼯鼠、山羊、鼯鼠亚族中2种未知名称的不同种的动物：分别标记为鼯鼠亚族种1(pteromyini.sp1)和鼯鼠亚族种2(pteromyini.sp2)、鼯鼠属中2种未知名称的不同种的动物：分别标记为鼯鼠属种1(petaurista.sp1)和鼯鼠属种2(petaurista.sp2)。
[0068]
根据各待测样品中来源于不同基原动物的各序列的reads数，获得各待测样品扩增结果的序列相对丰度热图如图1所示。从图1可以看出，在129份的待测样品中，大部分样品以复齿鼯鼠为主要动物基原，其中63份样品为单一正品，剩余样品中均发现了其他物种粪便的不同程度的混伪，主要混伪品为pteromyini.sp1，所有含混伪品的66份样品中，59份样品含pteromyini.sp1粪便，其他样品中的混伪品情况包括鉴定到petaurista.sp1粪便、pteromyini.sp2粪便、豚鼠粪便、红白鼯鼠粪便、petaurista.sp2粪便或山羊粪便。该结果和待测样品已知的组成一致，表明了采用本技术的引物组合物，能够准确鉴定五灵脂及其混伪品。
[0069]
实施例2中成药中五灵脂的鉴定
[0070]
材料：通过网络平台购买五灵脂用量(g)在20％以上且仅含五灵脂一味动物基源药材的中成药35份，包括片剂、丸剂、胶囊剂，阴凉处保存，各中成药样品见表4。
[0071]
表4
[0072]
样品名称样品名称样品名称样品名称z1五灵止痛胶囊z10五灵止痛胶囊z19槟榔四消丸z28槟榔四消丸z2五灵止痛胶囊z11五灵止痛胶囊z20槟榔四消丸z29槟榔四消丸z3五灵止痛胶囊z12五灵止痛胶囊z21槟榔四消丸z30槟榔四消丸z4五灵止痛胶囊z13五灵止痛胶囊z22槟榔四消丸z31槟榔四消丸z5五灵止痛胶囊z14五灵止痛胶囊z23槟榔四消丸z32槟榔四消丸z6五灵止痛胶囊z15五灵止痛胶囊z24槟榔四消丸z33槟榔四消丸z7五灵止痛胶囊z16槟榔四消丸z25槟榔四消丸z34槟榔四消丸z8五灵止痛胶囊z17槟榔四消丸z26槟榔四消丸z35槟榔四消丸z9五灵止痛胶囊z18槟榔四消丸z27槟榔四消丸
‑‑
[0073]
分别取表4中各中成药样品90mg，分别按照磁珠法动物基因组dna提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)的操作说明书提取各中成药样品的总dna，按照dna fragment purification kit ver.4.0试剂盒(宝日医生物技术(北京)有限公司)的操作说明书纯化各中成药样品的总dna。经纯化后的各中成药样品的总dna使用nanodrop 2000测定浓度及纯度。提取纯化后的各中成药样品的总dna，以用ddh2o作1:10稀释后得到的浓度为25-125ng/μl的总dna作为扩增模板，扩增所用引物、酶、扩增体系、扩增程序均同实施例1。pcr扩增产物使用illumina hiseq pe150平台测序。
[0074]
由genbank数据库搜索获得五灵脂基原动物复齿鼯鼠及其常见混伪品的基原动物红白鼯鼠及鼯鼠亚族(pteromyini)和鼯鼠属(petaurista)动物的线粒体基因组cytb基因序列。
[0075]
采用bbduck软件去除上述测序结果的引物序列，采用usearch软件进行分析，获得各中成药样品中扩增产物的基因序列及各序列的reads数，扩增产物的基因序列与五灵脂或其伪品的基原动物的线粒体基因组cytb基因序列比对，确定各中成药中五灵脂的组成，各中成药样品扩增结果的序列相对丰度热图如图2所示，其中伪品的基原动物包括红白鼯鼠、鼯鼠亚族种1(pteromyini.sp1)、鼯鼠亚族种2(pteromyini.sp2)、鼯鼠属种1(petaurista.sp1)和鼯鼠属种2(petaurista.sp2)。图2的结果表明，在35份中成药样品中，有27份中成药样品中的五灵脂全部为正品，没有混伪；有8份中成药样品中鉴定到少量其他动物粪便的混伪。
[0076]
以上结果表明，本技术的引物组合物能够用于扩增五灵脂以及含有五灵脂的中成药中正品及伪品的基原动物线粒体基因组cytb基因，通过序列比对，可实现五灵脂及其混伪品的准确鉴定。
[0077]
本说明书中的各个实施例均采用相关的方式描述，各个实施例之间相同相似的部分互相参见即可，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处。尤其，对于系统实施例而言，由于其基本相似于方法实施例，所以描述的比较简单，相关之处参见方法实施例的部分说明即可。
[0078]
以上所述仅为本技术的较佳实施例，并非用于限定本技术的保护范围。凡在本技术的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换、改进等，均包含在本技术的保护范围内。