一种鱼皮胶原蛋白及其提取方法

1.本发明属于胶原蛋白提取技术领域，具体涉及一种鱼皮胶原蛋白及其提取方法。


背景技术：

2.胶原蛋白又称胶原(collagen)，是鱼皮中含量最丰富、分布最广的一种糖蛋白，由于其特殊的右手三螺旋结构受到广泛关注。在食品中，经常作为营养补充剂和黏合剂使用。在组织工程方面，由于胶原蛋白具有良好的生物相容性、低抗原性和可降解性，能够促进细胞增殖等优势，完美匹配了组织工程应用的理念，应用于皮肤伤口愈合、骨和软骨组织工程、血管和神经再生等领域。
3.随着社会的进步和人民生活水平的提高，人们对水产类食品的需求量急剧增长，大力促进了国内水产加工业的发展，进而也产生了大量水产品加工下脚料，如鱼皮、鱼头、鱼骨或内脏等，而这些下脚料约占原料鱼的40％～50％。
4.胶原蛋白的制备恰好为鱼皮下脚料的处理提供了渠道，实现了生物资源的再利用。鱼皮胶原蛋白提取的传统方法包括热水提取法、酸提取法、酶提取法和碱提取法等，尽管上述提取方法可以实现胶原蛋白的提取，但是常规提取方法多存在鱼皮中杂蛋白无法处理干净，导致提取得到的胶原蛋白杂质较多的问题，进而造成提取所得胶原蛋白纯度和提取率均较低。


技术实现要素：

5.为了解决上述技术问题，本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白及其提取方法，本发明提供的提取方法可有效去除鱼皮中的杂蛋白，不仅可以制备得到高纯度的胶原蛋白，且其可以有效提高胶原蛋白的提取率。
6.为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：将碱液浸泡后的鱼皮用蛋白酶酶解，清洗至中性，得到除杂蛋白中性鱼皮；将所述除杂蛋白中性鱼皮碎化后，经酸酶结合法提取、盐析和透析得到鱼皮胶原蛋白。
8.优选的，所述蛋白酶包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶或木瓜蛋白酶。
9.优选的，所述蛋白酶的用量为所述碱液体积的0.2％～0.6％；所述蛋白酶酶解时间为2～6h。
10.优选的，所述碎化包括研磨。
11.优选的，所述研磨的装置包括破壁机或胶体磨。
12.优选的，所述研磨前还包括将所述除杂蛋白中性鱼皮与冰水混合物混合；
13.所述研磨为间歇研磨，具体的：每研磨6～15s，暂停10～15s，为一个循环。
14.优选的，当所述研磨装置为破壁机时，所述循环次数为15～25次，每5个循环补充一次等量所述冰水混合物；
15.当所述研磨装置为胶体磨时，所述循环次数为1～3次。
16.优选的，所述除杂蛋白中性鱼皮与冰水混合物的质量比为1～2：2～4；所述冰水混合物中，所述冰和水的体积比为5～9:5～1。
17.优选的，所述碱液浸泡的温度为0～8℃。
18.本发明还提供了上述提取方法提取得到的鱼皮胶原蛋白，其特征在于，所述鱼皮胶原蛋白具有ⅰ型胶原特征，含有γ链、β链和至少两条不同的α链。
19.有益效果：
20.本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白提取方法，包括如下步骤：将碱液浸泡后的鱼皮用蛋白酶酶解，清洗至中性，得到除杂蛋白中性鱼皮；将所述除杂蛋白中性鱼皮碎化后，经酸酶结合法提取、盐析和透析得到鱼皮胶原蛋白。
21.本发明通过将碱液处理后的鱼皮进行蛋白酶处理，可以有效除去鱼皮中的杂蛋白，有效提高鱼皮胶原蛋白的纯度。
22.同时，在采用酸酶结合法提取鱼皮胶原蛋白前对鱼皮进行机械处理可以提高鱼皮和酸的接触面积，缩短提取时间，提高胶原蛋白的提取率。
23.其次，将鱼皮与冰水混合物混合后再进行间歇式碎化的方式，可以保证机械处理的低温环境进而避免因机械处理升温所导致胶原蛋白的热变性，保证胶原蛋白的三螺旋结构，保持鱼皮胶原蛋白的生物活性。
24.另外，采用本发明提供的提取方法提取得到的鱼皮胶原蛋白可以达到工程级医用材料的要求，填补国内市场空白。
25.进一步的，本发明提供的鱼皮胶原蛋白提取方法操作简单，易于工业化。
附图说明
26.为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍。
27.图1为实施例1～3及对比例1～2中鱼皮胶原蛋白的提取率；
28.图2为实施例4～6及对比例3～4中鱼皮胶原蛋白的提取率；
29.图3为对比例7～11中鱼皮胶原蛋白的提取率；
30.图4为实施例3、实施例6和对比例12鱼皮胶原蛋白的sds-page电泳图谱；
31.图5为对比例5和对比例6中鱼皮胶原蛋白的sds-page电泳图谱；
32.图6为实施例1和实施例7～9对比例11～14中鱼皮胶原蛋白的sds-page电泳图谱。
具体实施方式
33.本发明提供了一种鱼皮胶原蛋白的提取方法，包括如下步骤：将碱液浸泡后的鱼皮用蛋白酶酶解，清洗至中性，得到除杂蛋白中性鱼皮；将所述除杂蛋白中性鱼皮碎化后，经酸酶结合法提取、盐析和透析得到鱼皮胶原蛋白。
34.本发明在将所述鱼皮采用碱液浸泡前，优选还包括去除鱼皮上的磷和结缔组织，并将其剪成小块，得到去杂质鱼皮。在本发明中，所述小块的尺寸优选为1～3cm
×
1～3cm，更优选为2cm
×
2cm。在本发明中，所述鱼皮优选为鳕鱼皮、罗非鱼皮、鲟鱼皮、青鱼皮、草鱼皮、绿鳍马面鲀鱼皮或乌鳢皮，更优选为鳕鱼皮、罗非鱼皮、鲟鱼皮或草鱼皮，进一步优选为鳕鱼皮。
35.得到所述去杂质鱼皮后，本发明将碱液浸泡后的去杂质鱼皮用蛋白酶酶解，得到除杂蛋白鱼皮。在本发明中，所述碱液优选包括naoh溶液或koh溶液，更优选包括naoh溶液。在本发明中，所述naoh溶液的浓度优选为0.05～0.15m，更优选为0.1m。在本发明中，所述碱液浸泡的温度优选为0～8℃，更优选为4℃；所述浸泡时间优选为18～36h，更优选为24h。在本发明中，所述去杂质鱼皮与所述碱液的质量体积比优选为0.5～2g:40～80ml，更优选为1g:40ml。在本发明中，在所述碱液浸泡过程中优选更换所述碱液两次，更优选为每8～15h更换一次，进一步优选为每12h更换一次。在本发明中，采用所述碱液浸泡去杂质鱼皮的作用为去除去杂质鱼皮中的杂蛋白，如肌球蛋白等。
36.本发明优选在最后一次更换所述碱液时加入蛋白酶。在本发明中，将所述除杂蛋白鱼皮在碱液条件下酶解的方式可以有效减少鱼皮胶原蛋白中的杂蛋白，有效提高鱼皮胶原蛋白的纯度。在本发明中，所述蛋白酶优选包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶或木瓜蛋白酶，更优选包括碱性蛋白酶、中性蛋白酶，进一步优选为碱性蛋白酶。在本发明中，所述蛋白酶的用量优选为所述碱液体积的0.2％～0.6％，更优选为0.3％～0.5％，进一步优选为0.4％。在本发明中，所述碱性蛋白酶的酶活优选为1
×
105～3
×
105u/g，更优选为1
×
105u/g；所述风味蛋白酶的酶活优选为1
×
105～3
×
105u/g，更优选为1.5
×
105u/g；所述木瓜蛋白酶的酶活优选为1
×
105～3
×
105u/g，更优选为1
×
105u/g；所述中性蛋白酶的酶活优选为1
×
105～3
×
105u/g，更优选为1
×
105u/g。在本发明中，所述蛋白酶的酶解时间优选为2～6h，更优选为4h。
37.得到所述除杂蛋白鱼皮后，本发明将所述除杂蛋白鱼皮清洗至中性，得到除杂蛋白中性鱼皮。在本发明中，所述清洗用水优选为蒸馏水。本发明通过清洗所述除杂蛋白鱼皮可以洗去鱼皮上的蛋白酶，避免酶解过度，同时可以洗掉鱼皮上的碱液防止后续酸酶结合法提取过程中与酸发生反应。
38.得到所述除杂蛋白中性鱼皮后，本发明将所述除杂蛋白中性鱼皮碎化，得到碎化鱼皮。在本发明中，所述碎化优选包括研磨。在本发明中，所述研磨的装置优选包括破壁机或胶体磨。本发明对所述研磨装置的型号和来源没有特殊限定，采用本领域常规研磨装置即可。本发明在所述研磨前优选还包括将所述除杂蛋白中性鱼皮与冰水混合物混合。在本发明中，所述除杂蛋白中性鱼皮与所述冰水混合物的质量比优选为1～2:2～4，更优选为1:2。在本发明中，所述冰水混合物中，所述冰和水的体积比优选为5～9:5～1，更优选为7:3。
39.在本发明中，所述研磨优选为间歇研磨，具体优选为每研磨6～15s，暂停10～15s，为一个循环，更优选为每研磨8～12s，暂停10～12s，进一步优选为每研磨10s，暂停10s。在本发明中，当所述研磨装置优选为破壁机时，所述循环次数优选为15～25次，更优选为18～22次，进一步优选为20次；本发明还优选每5个循环补充一次等量所述冰水混合物。在本发明中，当所述研磨装置优选为胶体磨时，所述循环次数优选为1～3次，更优选为1次。
40.得到所述碎化鱼皮后，本发明采用酸酶结合法提取，得到鱼皮胶原蛋白上清液。在本发明中，所述酸酶结合法中所使用的酸溶液优选包括乙酸或盐酸，更优选包括乙酸。在本发明中，所述酸酶结合法提取优选包括将所述碎化后的鱼皮加入稀释后的乙酸，至所述乙酸的浓度为0.3～0.7mol/l，更优选为0.5mol/l。在本发明中，所述酸酶结合法中所使用的酶优选为胃蛋白酶。所述胃蛋白酶的酶活优选为1
×
105～3
×
105u/g，更优选为1
×
105u/g。在本发明中，所述酸酶结合法中所述酶与所述酸溶液的质量体积比优选为0.1～0.3g:2～
4l，更优选为0.2g:3l。在本发明中，所述提取温度优选为2～8℃，更优选为4℃。在本发明中，所述提取时间优选为20～50h，更优选为24～48h，进一步优选为36～48h。本发明在所述酸酶结合法提取后优选还包括离心，取上清液，得到所述鱼皮胶原蛋白上清液。在本发明中，所述离心的转速优选为9000～10000r/min，更优选为9500r/min；所述时间优选为25～35min，更优选为30min。
41.得到所述鱼皮胶原蛋白上清液后，本发明对所述鱼皮胶原蛋白上清液进行盐析，得到盐析鱼皮胶原蛋白。在本发明中，所述盐析优选包括将所述鱼皮胶原蛋白上清液与nacl混合盐析后，得到盐析鱼皮胶原蛋白。
42.本发明优选将所述鱼皮胶原蛋白上清液与nacl混合至所述鱼皮胶原蛋白上清液与nacl的混合液中nacl的终浓度为0.8～1.5mol/l后，离心取沉淀，得到盐析鱼皮胶原蛋白。在本发明中，所述终浓度优选为0.9mol/l。在本发明中，所述离心的转速优选为优选为9000～10000r/min，更优选为9500r/min；所述时间优选为20～40min，更优选为30min。
43.得到所述盐析鱼皮胶原蛋白后，本发明将所述盐析鱼皮胶原蛋白透析得到鱼皮胶原蛋白。
44.将所述盐析鱼皮胶原蛋白透析前，本发明还优选将所述盐析鱼皮胶原蛋白与酸溶液混合复溶，得到复溶鱼皮胶原蛋白溶液。在本发明中，所述酸溶液优选为乙酸或盐酸，更优选为乙酸。在本发明中，所述乙酸的浓度优选为0.3～0.7mol/l，更优选为0.5mol/l；所述盐析鱼皮胶原蛋白与所述酸溶液的质量体积比优选为5～10g:10～40ml，更优选为5g:20ml。
45.得到所述复溶鱼皮胶原蛋白溶液后，本发明优选将所述复溶鱼皮胶原蛋白溶液在碱溶液中透析至外液ph＞8，得到第一透析鱼皮胶原蛋白液。在本发明中，所述第一透析鱼皮胶原蛋白液优选为透析内液，且呈粘稠液态。在本发明中，所述碱溶液优选为nah2po4。在本发明中，所述nah2po4的质量浓度优选为0.01～0.03mol/l，更优选为0.02mol/l。在本发明中，所述nah2po4可以保证透析的碱性环境，进而达到灭活鱼皮胶原蛋白中的蛋白酶。
46.得到第一透析鱼皮胶原蛋白液后，本发明优选将所述第一透析鱼皮胶原蛋白液在酸溶液中透析，得到第二透析鱼皮胶原蛋白液。在本发明中，所述第二透析鱼皮胶原蛋白液优选为透析内液。在本发明中，所述透析用酸溶液优选包括乙酸或盐酸，更优选包括乙酸；所述乙酸的浓度优选为0.05～0.2mol/l，更优选为0.1mol/l；所述透析时间优选为24～48h，更优选为36～48h，进一步优选为48h。
47.得到所述第二透析鱼皮胶原蛋白液后，本发明优选将所述第二透析鱼皮胶原蛋白液在蒸馏水中透析至电导率不变，得到所述鱼皮胶原蛋白。在本发明中，所述水优选为蒸馏水。
48.在本发明中，所述透析用透析袋的截留分子优选为3500。本发明对所述透析袋的来源没有特殊限定，采用本领域常规市售产品即可，如本发明实施例中采用的是索莱宝(solarbio)的md44。
49.本发明优选还包括将所述经过水透析后的鱼皮胶原蛋白溶液进行冷冻干燥。在本发明中，所述冷冻干燥的温度优选为-40～-70℃，更优选为-50℃；所述时间优选为36～72h，更优选为48h。本发明对所述冷冻干燥所使用的装置没有特殊限定，采用本领域常规冷冻干燥装置即可。
50.本发明还提供了上述提取方法提取得到的鱼皮胶原蛋白，其特征在于，所述鱼皮胶原蛋白具有ⅰ型胶原特征，含有γ链、β链和至少两条不同的α链。
51.为了进一步说明本发明，下面结合附图和实施例对本发明提供的技术方案进行详细地描述，但不能将它们理解为对本发明保护范围的限定。
52.实施例1
53.取去鳞及结缔组织的新鲜鳕鱼皮50g，用剪刀剪成2cm
×
2cm小块。在4℃下，采用2000ml0.1m的naoh浸泡溶液浸泡24h，期间换液两次，在最后一次换液时向naoh溶液里加入80ml酶活为2
×
105u/g的碱性蛋白酶，处理4h后用蒸馏水洗至中性。
54.向鱼皮中加入100ml冰水混合物(其中包括冰70ml，水30ml)后，加入到破壁机中进行研磨，采用运行10s，暂停10s的方式进行，重复20次，每运行5次重新加入一次100ml冰水混合物，得到研磨过的鱼皮。
55.向研磨过的鱼皮中加入乙酸和冰水至乙酸终浓度为0.5mol/l，加入0.2g胃蛋白酶，4℃搅拌提取24h后，9500r/min离心30min取上清。
56.向上述上清液中加入磨细的nacl至nacl的终浓度为0.9mol/l，9500r/min离心30min离心，取沉淀。将沉淀复溶于400ml0.5mol/l的乙酸中。
57.用截留分子为3500的透析袋先在0.02mol/l的nah2po4中透析至外液ph大于8以灭活胃蛋白酶；再在0.1mol/l乙酸中透析24h，最后在蒸馏水中透析至电导率不变。
58.将透析过的溶液在冷冻干燥机中-50℃冷冻48h，得到鱼皮胶原蛋白。
59.实施例2
60.除了将研磨过的鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取36h以外，其他步骤与实施例1相同。
61.实施例3
62.除了将研磨过的鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取48h以外，其他步骤与实施例1相同。
63.实施例4
64.除了将洗至中性的鱼皮加入100ml冰水混合物，加入到胶体磨中进行研磨，采用运行10s，暂停10s的方式进行，重复1次以外，其他与实施例1相同。
65.实施例5
66.除了将研磨过的鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取36h以外，其他步骤与实施例4相同。
67.实施例6
68.除了将研磨过的鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取48h以外，其他步骤与实施例4相同。
69.实施例7
70.除了将碱性蛋白酶替换为中性蛋白酶(酶活为1
×
105u/g)以外，其他与实施例1相同。
71.实施例8
72.除了将碱性蛋白酶替换为木瓜蛋白酶(酶活为1
×
105u/g)以外，其他与实施例1相同。
73.实施例9
74.除了将碱性蛋白酶替换为风味蛋白酶(酶活为1.5
×
105u/g)以外，其他与实施例1相同。
75.对比例1
76.除了将研磨过的鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取12h以外，其他步骤与实施例1相同。
77.对比例2
78.除了将研磨过的鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取6h以外，其他步骤与实施例1相同。
79.对比例3
80.除了将研磨过的鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取12h以外，其他步骤与实施例4相同。
81.对比例4
82.除了将研磨过的鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取6h以外，其他步骤与实施例4相同。
83.对比例5
84.除了除杂蛋白阶段仅用碱液浸泡，不采用碱性蛋白酶酶解，其他步骤与实施例1相同。
85.对比例6
86.除了将洗至中性的鱼皮加入100ml冰水混合物，加入到胶体磨中进行研磨，采用运行10s，暂停10s的方式进行，重复1次以外，其他与对比例5相同。
87.对比例7
88.除了不进行研磨以外，其他步骤与实施例1相同。
89.对比例8
90.除了将鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取6h以外，其他步骤与对比例7相同。
91.对比例9
92.除了将鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取12h以外，其他步骤与对比例7相同。
93.对比例10
94.除了将鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取36h以外，其他步骤与对比例7相同。
95.对比例11
96.除了将鱼皮在乙酸和胃蛋白酶的混合液中提取48h以外，其他步骤与对比例7相同。
97.对比例12
98.除了除杂蛋白阶段仅用碱液浸泡，不采用碱性蛋白酶酶解，且不进行研磨以外，其他步骤与实施例1相同。
99.对比例13
100.除了研磨过程的研磨次数为14次以外，其他与实施例1中的步骤相同。
101.对比例14
102.除了研磨过程的研磨次数为26次以外，其他与实施例1中的步骤相同。
103.测试例1
104.对实施例1～9和对比例1～14中得到的胶原蛋白进行羟脯氨酸含量的测定和sds-page电泳谱图的检测。
105.其中羟脯氨酸是胶原中特有的氨基酸，因此可以用羟脯氨酸含量来反映胶原蛋白的提取率。本发明按照yy/t1511-2017所述的方法测定胶原溶液里的羟脯氨酸含量。实施例1～6及对比例1～14的提取率如表1和图1～3所示。
106.表1实施例1～6及对比例1～14中鱼皮胶原蛋白的提取率
107.序号提取率(％)实施例166.8实施例269.78实施例369.78实施例469.96实施例571.94实施例672.36对比例163.25对比例255.25对比例362.16对比例451.51对比例5-对比例6-对比例741.40对比例825.30对比例938.10对比例1044.49对比例1149.23对比例12-对比例1354.64对比例1460.49
108.由表1和图1～3可知，本发明实施例1～6中鱼皮胶原蛋白的提取率为66.80％～72.36％，对比例1～10中鱼皮胶原蛋白的提取率为25.30％～63.25％，采用本发明提供的方法可显著提高鱼皮蛋白的提取率；并且对比例5中仅用碱液浸泡，不采用碱性蛋白酶酶解的方式含有较多的杂蛋白无法准确进行提取率的检测。
109.sds-page电泳图谱可以判定胶原蛋白的α链是否完整，本发明中sds-page电泳图谱的方法为：将得到的鱼皮胶原蛋白冻干样品溶解于去离子水中，配置成质量浓度为10mg/ml的胶原蛋白溶解液，在60℃的水浴中保持20min，离心，收集上清液，以体积比1:1与上样缓冲液混合，沸水浴3min，与蛋白marker一起上样，在120v的恒流下进行电泳，结束后转移电泳胶到染色液(0.25％考马斯亮蓝+10％乙酸+40％甲醇)中染色1.5h，随后转移到脱色液
(75％乙酸+50％甲醇)中脱色过夜。
110.其中，实施例3、6和对比例12的结果如图4所示，其中lane1为蛋白marker，2为对比例12提取得到的胶原蛋白条带，3为实施例3提取得到的胶原蛋白条带，4为实施例6提取得到的胶原蛋白条带；
111.对比例5～6的结果如图5所示，其中lane1为蛋白marker，2为对比例5胶原蛋白的条带，3为对比例6胶原蛋白的条带；
112.实施例1、实施例7～9的结果如图6所示，其中lane1为蛋白marker，2为实施例1提取得到的胶原蛋白条带，3为实施例7提取得到的胶原蛋白条带，4为实施例8提取得到的胶原蛋白条带，5为实施例9提取得到的胶原蛋白条带。
113.由图4可以看出，采实施例3和实施例6中提取得到的鱼皮胶原蛋白有明显的ⅰ型胶原特征，含有少量的γ链(三聚体)、较多的β链(二聚体)和至少两条不同的α链(α1和α2链)。且没有杂带，条带聚集，没有杂带，胶原纯度较高。
114.由图5可以看出，采用仅采用碱性溶液浸泡而不添加蛋白酶酶解的除杂蛋白方法提取得到的胶原蛋白中胶原特征不明显，条带模糊无法明确区分各条链，且条带下的拖尾条带均为杂蛋白产生的。
115.由图6可以看出，将碱性蛋白酶分别替换为中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和风胃蛋白酶的胶原蛋白的条带聚集。清晰且没有杂带和拖带。
116.由以上实施例可知，采用本发明提供的方法提取鱼皮胶原蛋白可以得到纯度较高的医用级胶原蛋白，且能够显著提高胶原蛋白的提取率。
117.尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。