1.本发明涉及干细胞中提取外泌体技术领域，具体为一种从干细胞中提取外泌体的提取方法。
背景技术：
2.一种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，其主要来源于细胞内溶酶体微粒内陷形成的多囊泡体，经多囊泡体外膜与细胞膜融合后释放到胞外基质中，所有培养的细胞类型均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，包括血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中，有关他们分泌和摄取及其组成、“运载物”和相应功能的精确分子机制刚刚开始研究，外泌体目前被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间通讯，对外泌体的研究兴趣日益增长，无论是研究其功能还是了解如何将其用于微创诊断的开发。但是现有的干细胞外泌体提取的方法，一般是使用差速离心，由于样本的粘度与分离的外泌体纯度有显着的相关性，因此，具有高粘度的生物样品(例如血浆和血清样本)需要更长的超速离心步骤和更高的离心速度，从而使得提取的外泌体的纯度不是很高，提取时间过长，从而影响实验结果；细胞外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后释放到细胞外隙或生物学体液中的膜性囊泡，包含有蛋白质、mrna、mirna和dna片段等生物活性物质,参与人体许多重要的生理或病例过程，在细胞通讯、细胞迁移、促进组织修复或调节免疫反应等作用，具有广阔的应用前景，获得高纯度的细胞外泌体一直是展开应用研究的前提。由于外泌体为纳米级囊泡结构，现有技术大部分采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后，高速离心得到。上述方法提取出的细胞外泌体杂蛋白含量特别高，纯度很不纯，对细胞外泌体的后续应用及研究造成很大影响，所以有必要对现有的细胞外泌体提取方法进行改进，以解决细胞外泌体纯度低的问题。
技术实现要素：
3.(一)解决的技术问题
4.针对现有技术的不足，本发明提供了一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，具备以上等优点，解决了背景技术中提出的问题。
5.(二)技术方案
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，包括以下步骤：
7.1)采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间；
8.2)然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；
9.3)将步骤2)中的不含血清培养基中的干细胞进行分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质；
10.4)将经过步骤3)中提取的外泌体提取液和含血清培养基液混合后进行培育，培育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
11.5)通过设置将步骤4)中含外泌体的浓缩液加入无菌pbs溶解后加入外泌体提取液
进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；
12.6)将步骤5)中收集的液体进行密度梯度离心，将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集；
13.7)冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏。
14.优选的，步骤2)中不含血清的培养基为i型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3cs-nk-b1和3cs-nk-b2进行诱导生长。
15.优选的，步骤6)中将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用。
16.优选的，步骤5)中通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离。
17.优选的，步骤6)中将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀20～40小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储。
18.优选的，步骤7)中在进行冷冻储存时，需要在-80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存。
19.(三)有益效果
20.与现有技术相比，本发明提供了一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，具备以下有益效果：
21.1、该从干细胞中提取外泌体的提取方法，通过含血清的培养基培养后，再用不含血清的培养基培养干细胞，根据观察不同的细胞的大小，过滤膜具对干细胞进行过滤，进行过滤获取的余液在4℃温育并低速离心，并加入沉淀物聚乙二醇进行沉淀，从而使得对分离的外泌体影响小、ph中性，沉淀20～30小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体分离，将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体，再将外泌体通过收集管进行提取，溶于100ul生理盐水中，并提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，用于备用，从而达到高纯度提取外泌体，且操作方便，方便工作人员进行实验；
22.2、该从干细胞中提取外泌体的提取方法，通过对干细胞外泌体进行两次提取和纯化培养有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量，保证其功能性的良好，且使用促细胞生长剂3cs-nk-b1和3cs-nk-b2对其进行诱导分化，使其达到预想的使用目的，使其中蛋白质可以更好的表达；2、改变现有的采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后高速离心技术，使提取技术更加科学化，并在其提取过程中保证所需外泌体的蛋白质不会被破坏，从而不影响整体的表达。
具体实施方式
23.下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施
例，都属于本发明保护的范围。
24.实施例一：
25.一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，包括以下步骤：
26.1)采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间；
27.2)然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；
28.3)将步骤2)中的不含血清培养基中的干细胞进行分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质；
29.4)将经过步骤3)中提取的外泌体提取液和含血清培养基液混合后进行培育，培育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
30.5)通过设置将步骤4)中含外泌体的浓缩液加入无菌pbs溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；
31.6)将步骤5)中收集的液体进行密度梯度离心，将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集；
32.7)冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏；
33.步骤2)中不含血清的培养基为i型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3cs-nk-b1和3cs-nk-b2进行诱导生长，步骤6)中将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用，步骤5)中通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离，步骤6)中将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀40小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，步骤7)中在进行冷冻储存时，需要在-80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存，该从干细胞中提取外泌体的提取方法，通过含血清的培养基培养后，再用不含血清的培养基培养干细胞，根据观察不同的细胞的大小，过滤膜具对干细胞进行过滤，进行过滤获取的余液在4℃温育并低速离心，并加入沉淀物聚乙二醇进行沉淀，从而使得对分离的外泌体影响小、ph中性，沉淀30小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体分离，将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体，再将外泌体通过收集管进行提取，溶于100ul生理盐水中，并提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，用于备用，从而达到高纯度提取外泌体，且操作方便，方便工作人员进行实验；通过对干细胞外泌体进行两次提取和纯化培养有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量，保证其功能性的良好，且使用促细胞生长剂3cs-nk-b1和3cs-nk-b2对其进行诱导分化，使其达到预想的使用目的，使其中蛋白质可以更好的表达；2、改变现有的采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后高速离心技术，使提取技术更加科学化，并在其提取过程中保证所需外泌体的蛋白质不会被破坏，从而不影响整体的表达。
34.实施例二：
35.一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，包括以下步骤：
36.1)采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间；
37.2)然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；
38.3)将步骤2)中的不含血清培养基中的干细胞进行分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质；
39.4)将经过步骤3)中提取的外泌体提取液和含血清培养基液混合后进行培育，培育后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
40.5)通过设置将步骤4)中含外泌体的浓缩液加入无菌pbs溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；
41.6)将步骤5)中收集的液体进行密度梯度离心，将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集；
42.7)冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏；
43.步骤2)中不含血清的培养基为i型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3cs-nk-b1和3cs-nk-b2进行诱导生长，步骤6)中将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用，步骤5)中通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离，步骤6)中将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀20小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，步骤7)中在进行冷冻储存时，需要在-80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存，该从干细胞中提取外泌体的提取方法，通过含血清的培养基培养后，再用不含血清的培养基培养干细胞，根据观察不同的细胞的大小，过滤膜具对干细胞进行过滤，进行过滤获取的余液在4℃温育并低速离心，并加入沉淀物聚乙二醇进行沉淀，从而使得对分离的外泌体影响小、ph中性，沉淀20小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体分离，将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体，再将外泌体通过收集管进行提取，溶于100ul生理盐水中，并提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，用于备用，从而达到高纯度提取外泌体，且操作方便，方便工作人员进行实验；通过对干细胞外泌体进行两次提取和纯化培养有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量，保证其功能性的良好，且使用促细胞生长剂3cs-nk-b1和3cs-nk-b2对其进行诱导分化，使其达到预想的使用目的，使其中蛋白质可以更好的表达；2、改变现有的采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后高速离心技术，使提取技术更加科学化，并在其提取过程中保证所需外泌体的蛋白质不会被破坏，从而不影响整体的表达。
44.实施例三：
45.一种从干细胞中提取外泌体的提取方法，包括以下步骤：
46.1)采用含血清培养基培养干细胞，培养至一定时间；
47.2)然后提取干细胞，将干细胞放置在不含血清的培养基中，培养至一定时间；
48.3)将步骤2)中的不含血清培养基中的干细胞进行分离，对干细胞进行培养，将细胞培养后的培养基，离心去除杂质；
49.4)将经过步骤3)中提取的外泌体提取液和含血清培养基液混合后进行培育，培育
后得第一孵化液，对第一孵化液进行离心浓缩，得到含外泌体的浓缩液；
50.5)通过设置将步骤4)中含外泌体的浓缩液加入无菌pbs溶解后加入外泌体提取液进行孵育，孵育后得第二孵化液，将第二孵化液进行离心收集底部沉淀，得细胞外泌体；
51.6)将步骤5)中收集的液体进行密度梯度离心，将提纯的液体通过收集管进行高纯度外泌体的收集；
52.7)冷冻储存，对培养后的干细胞外泌体进行深低温冷藏；
53.步骤2)中不含血清的培养基为i型胶原蛋白包被细胞培养板对培养后的干细胞外泌体采用促细胞生长剂3cs-nk-b1和3cs-nk-b2进行诱导生长，步骤6)中将外泌体通过收集管进行提取，并通过注射器将外泌体溶于100ul生理盐水中，通过无菌容器进行收集，此外通过注射器提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，放入无菌低温环境中，用于备用，步骤5)中通过注射器将沉淀物注射至离心容器中，在超速离心力作用下，使蔗糖溶液形成从低到高连续分布的密度阶层，通过密度梯度离心，样品中的外泌体将在1.13-1.19g/ml的密度范围收集，实现外泌体分离，步骤6)中将混合沉淀的液体放置商品化试剂盒中，沉淀25小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，步骤7)中在进行冷冻储存时，需要在-80℃的环境下对所提取的干细胞外泌体进行保存，该从干细胞中提取外泌体的提取方法，通过含血清的培养基培养后，再用不含血清的培养基培养干细胞，根据观察不同的细胞的大小，过滤膜具对干细胞进行过滤，进行过滤获取的余液在4℃温育并低速离心，并加入沉淀物聚乙二醇进行沉淀，从而使得对分离的外泌体影响小、ph中性，沉淀20小时，通过提取管将放置商品化试剂盒中上清液体进行去除，并将沉淀物用注射器进行收集，放置无菌低温环境下进行存储，将超速离心与蔗糖密度梯度相结合，实现外泌体分离，将囊泡与不同密度的颗粒分开，能够提取含量低的外泌体，再将外泌体通过收集管进行提取，溶于100ul生理盐水中，并提取1mg外泌体溶于10ul生理盐水中，用于备用，从而达到高纯度提取外泌体，且操作方便，方便工作人员进行实验；通过对干细胞外泌体进行两次提取和纯化培养有效地提高细胞外泌体的纯度，降低其杂蛋白含量，保证其功能性的良好，且使用促细胞生长剂3cs-nk-b1和3cs-nk-b2对其进行诱导分化，使其达到预想的使用目的，使其中蛋白质可以更好的表达；2、改变现有的采用外泌体提取试剂盒对其进行脱水处理后高速离心技术，使提取技术更加科学化，并在其提取过程中保证所需外泌体的蛋白质不会被破坏，从而不影响整体的表达。
54.尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。