玉米S型胞质不育基因KASP分子标记的开发及应用

玉米s型胞质不育基因kasp分子标记的开发及应用
技术领域
1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及与玉米s型胞质不育基因相关的kasp分子标记的开发及应用。


背景技术：

2.玉米是全球第一大作物，种业市场份额最大，也是我国最重要的农作物之一。玉米也是最早实现杂种优势利用的作物。玉米杂交种制种方法有常规和雄性不育两种，利用雄性不育配制杂交种，不仅节省大量劳动力，降低成本，而且还可以提高种子纯度。因此，培育性状优异的不育系材料是提升玉米产量和品质、保证玉米生产质量的最高效、经济、环保的方法(孙庆泉,荣廷昭.玉米核雄性不育材料的研究及其在分子育种中的利用[j].植物学报,2003,20(002):248-253.)。
[0003]
玉米雄性不育分为细胞质不育和细胞核不育，其中质不育又分为t、c、s三型。目前，已开发了一些玉米胞质不育基因连锁标记，通过分子标记辅助选择技术(marker-assisted selection，mas)进行玉米胞质不育材料选育，弥补了传统育种中出现的诸多弊端，成为解决品种选育难这一问题的有效途径。然而，玉米胞质不育相关基因的连锁标记虽然可以用于分子标记辅助选择，但多为rflp标记、ssr标记、indel标记或酶切标记，检测效率低，同时还可能会产生气溶胶污染环境，不适用于高通量的分子检测平台(汤继华,刘宗华,陈伟程,等.玉米c型胞质不育恢复主基因ssr标记[j].中国农业科学,2001,34(006):592-596.；汤继华,季洪强,黄中文,等.玉米c型胞质不育恢复基因rf4的rflp定位[j].河南农业大学学报,2001,35(002):99-102.；田红丽,晏朋涛,王蕊,等.基于叶绿体indel标记对玉米s型胞质不育制种鉴定的研究[j].玉米科学,2019,v.27；no.132(02):57-64+72.)。因此，开发低成本、可高通量检测的分子标记是促进玉米s型胞质不育基因鉴定、增加s型胞质不育材料选育准确度与提高育种效率的迫切需求。
[0004]
kasp(kompetitive allele-specific pcr，竞争性等位基因特异性pcr)通过荧光探针特异性识别基因位点达到基因分型的效果，可快速检测snp或indel位点。与ssr、rflp等分子标记相比，kasp标记具有检测快速，成本低，易于规模化应用等特点，kasp标记不需要根据dna片段大小进行分型，能够摆脱传统凝胶电泳这种步骤相对繁琐，低通量，价格又较贵的检测方法，更加适用于现阶段飞速发展的高通量分子检测平台。因此，开发低成本、适合于高通量分子检测平台的玉米s型胞质不育基因kasp分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高我国玉米s型胞质不育材料选育效率和育种水平具有重要意义。


技术实现要素：

[0005]
本发明的目的是提供一种与玉米s型胞质不育基因紧密连锁的kasp标记及其应用方法。
[0006]
玉米s型胞质不育基因kasp分子标记的开发采用鉴定或辅助鉴定玉米s型胞质不育的方法，此方法包括检测待测玉米的基因型，根据待测玉米的基因型鉴定或辅助鉴定玉
米s型胞质不育；所述基因型为玉米基因组中kasp_s位点的基因型；所述kasp_s位点是玉米叶绿体基因组中的一个indel位点，位于玉米叶绿体基因组第11860位，所述indel位点是核苷酸种类为+或者-，为seq id no.4的第101-183位核苷酸；
[0007]
所述kasp_s位点的基因型为++基因型或+-基因型的待测玉米为s型胞质不育或者候选为s型胞质不育，所述kasp_s位点的基因型为cc基因型的待测玉米为可育或者候选为可育；所述kasp_s位点的基因型为+-基因型的待测玉米与所述kasp_s位点的基因型为++基因型的待测玉米在s型胞质不育性状上无显著差异；其中，所述++基因型表示玉米基因组中所述kasp_s位点的核苷酸种类为+的纯合型；所述
‑‑
基因型表示玉米基因组中所述kasp_s位点的核苷酸种类为-的纯合型；所述+-基因型表示玉米基因组中所述kasp_s位点的核苷酸种类为+和-的杂合型。
[0008]
作为优选实例，所述的方法在玉米育种中的应用。
[0009]
作为优选实例，检测所述kasp_s位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米s型胞质不育中的应用。
[0010]
作为优选实例，检测所述kasp_s位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定玉米s型胞质不育的产品中的应用。
[0011]
作为优选实例，检测所述kasp_s位点的多态性或基因型的物质在玉米辅助育种或制备玉米辅助育种产品中的应用。
[0012]
作为优选实例，所述应用中包括玉米育种的方法，包括选择所述kasp_s位点的基因型为++或者基因型为+-的玉米作为亲本进行育种，所述++基因型表示玉米基因组中所述kasp_s位点的核苷酸种类为+的纯合型；所述+-基因型表示玉米基因组中所述kasp_s位点的核苷酸种类为+和-的杂合型；所述玉米育种可为s型胞质不育玉米。
[0013]
作为优选实例，7、产品为c1-c3中任一一种产品：
[0014]
c1：检测与玉米s型胞质不育相关的indel多态性或基因型的产品；
[0015]
c2：鉴定或辅助鉴定玉米s型胞质不育的产品；
[0016]
c3：用于玉米辅助育种的产品。
[0017]
作为优选实例：检测kasp_s位点的多态性或基因型的物质为如下d1、d2或d3：
[0018]
d1：所述检测权利要求1中kasp_s位点的多态性或基因型的物质含有扩增包括所述kasp_s位点在内的玉米基因组dna片段的pcr引物；
[0019]
d2：所述检测权利要求1中kasp_s位点的多态性或基因型的物质为含有所述pcr引物的pcr试剂；
[0020]
d3：含有d1所述pcr引物或d2所述pcr试剂的试剂盒。
[0021]
作为优选实例：所述pcr引物为由核苷酸序列是序列表中seq id no.1的第22-52位的单链dna、核苷酸序列是序列表中seq id no.2的第22-52位的单链dna和核苷酸序列是序列表中seq id no.3的单链dna组成的引物组。
[0022]
作为优选实例：所述pcr引物为由序列表中seq id no.1所示的单链dna、序列表中seq id no.2所示的单链dna和由序列表中seq id no.3所示的单链dna的引物组。
[0023]
本发明还提供一种与玉米s型胞质不育基因紧密连锁的kasp分子标记kasp_s，所述分子标记kasp_s是基于玉米s型胞质不育基因侧翼的一个indel位点开发的标记，所述indel位点是核苷酸种类为actgtatacacggatacagaatccgctatatccgtttgtgaaataaaggctaa
atcccctcccctcaactccatatctaaata(下文记为+)或者缺失(下文记为-)，为序列表中seq id no.4的第101-183位核苷酸。
[0024]
所述与玉米s型胞质不育基因紧密连锁的kasp分子标记在c1、c2、c3或c4中的应用也应在本发明的保护范围之内：
[0025]
c1、检测玉米基因组中kasp_s位点的多态性或基因型的物质在鉴定或辅助鉴定玉米s型胞质不育中的应用；
[0026]
c2、检测玉米基因组中kasp_s位点的多态性或基因型的物质在制备鉴定或辅助鉴定玉米s型胞质不育的产品中的应用；
[0027]
c3、检测玉米基因组中kasp_s位点的多态性或基因型的物质在玉米辅助育种或制备玉米辅助育种产品中的应用；
[0028]
c4、检测玉米基因组中kasp_s位点的多态性或基因型的物质在选育s型胞质不育玉米资源中的应用。
[0029]
本发明的有益效果是：本发明提供了一种玉米s型胞质不育基因紧密连锁的kasp标记开发与应用，所述分子标记是与玉米s型胞质不育基因紧密连锁的kasp标记kasp_s。该标记基于kasp技术开发，可高通量检测玉米叶绿体基因组的第11860位碱基。本发明应用kasp技术对玉米s型胞质不育基因进行基因型鉴定，具有操作简便、成本低廉、检测周期短、标记稳定、绿色环保等优点，可精准检测玉米s型胞质不育基因，对促进玉米s型胞质不育材料的选育具有重要意义。
附图说明
[0030]
图1为实施例1利用分子标记kasp_s检测8份测试玉米品种材料的分型图，其中，fam表示基因型为
‑‑
，vic表示基因型为++，h表示基因型为+-。
[0031]
图2为实施例2利用分子标记kasp_s检测48份f2测试群体的分型图，其中，fam表示基因型为
‑‑
，vic表示基因型为++，h表示基因型为+-。
具体实施方式
[0032]
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
[0033]
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034]
下述实施例中所使用的玉米品种均可从商业途径得到。
[0035]
本发明的发明人通过文献挖掘到一个与玉米s型胞质不育相关的indel位点(田红丽,晏朋涛,王蕊,等.基于叶绿体indel标记对玉米s型胞质不育制种鉴定的研究[j].玉米科学,2019,v.27；no.132(02):57-64.)，该位点锚定在玉米叶绿体基因组的第11860位(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/assembly/gcf_902167145.1/，基因组版本zm-b73-reference-nam-5.0)，该indel侧翼序列如seq id no.4所示。kasp_s位于seq id no.4的第101-183位，该处的核苷酸序列为+或-。
[0036]
下述++基因型表示kasp_s的核苷酸序列为+的纯合型；
‑‑
基因型表示kasp_s的核苷酸序列为-的纯合型；+-基因型表示kasp_s的核苷酸种类为+和-的杂合型。
[0037]
实施例1与玉米s型胞质不育相关基因紧密连锁kasp标记开发
[0038]
1.引物的设计：根据kasp_s位点提取左右各100bp的侧翼序列，优选利用oligo7.0软件设计3组kasp引物。利用douglas scientific公司arraytape平台检测后，挑选出1套多态性良好的kasp引物用于后续验证。
[0039]
用于检测kasp_s的kasp引物具体如下：primerx：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattgcaagtccactttcaatatatctctgtataa-3’(seq id no.1，小写字母部分为特异荧光标签序列vic)；primer y：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctgcaagtccactttcaatatatctctgtatac-3’(seq id no.2，小写字母部分为特异荧光标签序列fam)；primer r：5
’‑
gaggggtttaatcatgaatccattga-3’(seq id no.3)。
[0040]
2.dna提取：采用常规ctab法从玉米叶片中提取基因组dna。
[0041]
3.kasp反应测试
[0042]
kasp标记扩增及反应体系：
[0043]
(1)荧光定量pcr仪ab-q6 flex检测：
[0044]
5μl pcr荧光定量仪检测反应体系包括：基因组dna 50ng，引物混液0.07μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y 100pmol
·
l-1各12μl，反向引物primer r 100pmol
·
l-1 30μl，ddh2o 46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(low rox)2.5μl。按照荧光定量pcr仪ab-q6仪器操作手册，编辑样品表，执行运行程序，保存数据。
[0045]
以上反应体系为ab-q6 flex的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0046]
(2)选择douglas scientific公司arraytape平台检测
[0047]
1.6μl pcr arraytape平台检测反应体系包括：含基因组dna 50ng/μl 0.8μl，引物混液0.03μl(优选引物混液配比：正向引物primer x、primer y 100pmol
·
l-1各12μl，反向引物primer r 100pmol
·
l-1 30μl,ddh2o 46μl，使用其他合理的引物混液配比也可以达到相同的检测目的)，lgc公司2
×
kasp mix(std rox)0.8μl。根据arraytape平台仪器操作手册，编写样品表，运行程序，读取数据。
[0048]
以上反应体系为douglas scientific公司arraytape平台的优选反应体系，其他合理的反应体系也可以达到相同的检测目的。
[0049]
注：以上为推荐检测方法，其他能够达到相同检测目的的检测方法也可以应用到上述标记的分子标记辅助育种过程中。
[0050]
其中，2
×
kasp mix由荧光探针a、荧光探针b、淬灭探针a和淬灭探针b，以及高保真taq酶，dntp，mg2+等组成。荧光探针a的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtcggagtcaacggatt-3’，5’末端连接一个vic荧光基团；荧光探针b的核苷酸序列为：5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgct-3’，其5’端连接一个fam荧光基团；淬灭探针a的核苷酸序列为：5
’‑
aatccgttgactccgaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq；淬灭探针b的核苷酸序列为：5
’‑
agcatgaacttggtcaccttc-3’，其3’端连接一个淬灭基团bhq。
[0051]
扩增程序：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性20s，55-62℃(优选55℃)退火
60s，设置40个循环。
[0052]
实验同时设置反应体系中不添加模板dna的空白对照(ntc)，每个板设置1个或多个空白对照。
[0053]
对扫描数据进行分析，然后按照如下确定待测玉米基因组中kasp_s位点的基因型(即检测玉米叶绿体基因组的第11860位碱基是+还是-)，若所述待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近x轴(vic信号)，则待测玉米基因组中kasp_s位点的基因型为++纯合型(即玉米叶绿体基因组的第11860位碱基为+纯合型)；若待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析靠近y轴(fam信号)，则待测玉米基因组中kasp_s位点的基因型为
‑‑
纯合型(即玉米叶绿体基因组的第11860位碱基为-纯合型)；若待测玉米的扩增产物的荧光信号数据经douglas基因分型软件分析位于x轴和y轴中间(vic和fam信号)，则待测玉米基因组中kasp_s位点的基因型为+-杂合型(即玉米叶绿体基因组染色体的第11860位碱基为+-杂合型)。左下角显示为黑色的样本为空白对照。
[0054]
5.标记分型数据分析
[0055]
为了验证kasp_s标记的可靠性，对8份玉米材料进行田间鉴定，获得材料的田间s型胞质不育数据。材料基因型采用douglas scientific公司arraytape平台进行检测，检测方法、反应体系以及扩增程序按照上述优选方案实行。
[0056]
扩增结果表明，kasp_s标记在8份材料中能够获得稳定的pcr产物，并且能够检测到+和-两个等位位点(图1)。两份s型胞质不育玉米材料均为++基因型，六份可育玉米材料均为
‑‑
基因型。由此，可看出kasp_s标记可用于s型胞质不育玉米的选育工作。
[0057]
因此，本发明所述的kasp_s标记可用于玉米s型胞质不育相关基因的分子标记辅助育种。
[0058]
表1.8份测试玉米材料的s型胞质不育与基因型信息
[0059]
材料名称育性基因型材料名称育性基因型昌7-2n
‑‑
郑58n
‑‑
京724s++mo17n
‑‑
黄早四n
‑‑
b73n
‑‑
京糯6n
‑‑
丹598n
‑‑
[0060]
注：++，基因型为+的纯合型；
‑‑
，基因型为-的纯合型；+-，基因型为+和-的杂合型；
‘
*’表示无检测信号。
[0061]
实施例2与玉米s型胞质不育相关基因紧密连锁的kasp标记在分子标记辅助选择玉米s型胞质不育植株中的应用
[0062]
为检测本发明kasp_s标记的实用性，将表1所述的玉米s型胞质不育材料京724(作为母本)与可育材料昌7-2(作为父本)杂交配制f2分离群体，对f2分离群体进行kasp标记检测和s型胞质不育统计(检测结果见图2、表2)，标记检测和s型胞质不育鉴定实施方法参考实施例1。通过对48份分离群体单株育性与基因型进行统计分析，有2份材料表型与基因型不一致，表型与基因型的一致性为p＝95.83％(p＝一致的群体单株数量/总群体数量)。
[0063]
上述结果表明标记kasp_s在玉米s型胞质不育植株筛选中具有较高的实用性。
[0064]
表2.玉米分离群体的表型与基因型信息
[0065]
材料编号育性基因型材料编号育性基因型j×
c-f2-001s++j
×
c-f2-025s++j
×
c-f2-002s+-j
×
c-f2-026s++j
×
c-f2-003s+-j
×
c-f2-027s+-j
×
c-f2-004s+-j
×
c-f2-028s++j
×
c-f2-005s+-j
×
c-f2-029n+-j
×
c-f2-006s+-j
×
c-f2-030s++j
×
c-f2-007s+-j
×
c-f2-031s+-j
×
c-f2-008s+-j
×
c-f2-032n
‑‑j×
c-f2-009s+-j
×
c-f2-033s+-j
×
c-f2-010s
‑‑j×
c-f2-034s++j
×
c-f2-011s+-j
×
c-f2-035n
‑‑j×
c-f2-012s+-j
×
c-f2-036s+-j
×
c-f2-013s+-j
×
c-f2-037n
‑‑j×
c-f2-014n
‑‑j×
c-f2-038n
‑‑j×
c-f2-015s++j
×
c-f2-039n
‑‑j×
c-f2-016n
‑‑j×
c-f2-040s++j
×
c-f2-017s+-j
×
c-f2-041s+-j
×
c-f2-018s+-j
×
c-f2-042s+-j
×
c-f2-019s++j
×
c-f2-043s+-j
×
c-f2-020s++j
×
c-f2-044s+-j
×
c-f2-021n
‑‑j×
c-f2-045s+-j
×
c-f2-022n
‑‑j×
c-f2-046s+-j
×
c-f2-023n
‑‑j×
c-f2-047s++j
×
c-f2-024s++j
×
c-f2-048s+-[0066]
注：++，基因型为+的纯合型；
‑‑
，基因型为-的纯合型；+-，基因型为+和-的杂合型；
‘
*’表示无检测信号。
[0067]
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本技术欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本技术中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。