技术特征：
1.一种核酸斑点杂交法检测pstvd的探针，其特征在于，所述探针的核苷酸序列如seq id no.1所示。2.一种权利要求1所述核酸斑点杂交法检测pstvd的探针的制备方法，其特征在于，以pstvd反转录得到的cdna为模板，以正向引物pstvd-f和反向引物pstvd-r为引物组进行非对称pcr扩增，所得209bp扩增产物即为检测pstvd的探针；所述正向引物pstvd-f的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述反向引物pstvd-r的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述反向引物pstvd-r的5’端标记地高辛或生物素。3.根据权利要求2所述一种核酸斑点杂交法检测pstvd的探针的制备方法，其特征在于，所述非对称pcr扩增的反应体系为：pstvd阳性样品dna 1.0μl，浓度为10um的正向引物pstvd-f 0.1μl、浓度为10um的反向引物pstvd-r 0.5μl，10
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pcr buffer 2.5μl，浓度为2.5mm的dntp mixture 2.0μl，浓度为5u/μl的taq酶0.3μl和ddh2o 17.2μl；所述非对称pcr扩增的反应程序为：94℃预变性5min，94℃变性30s，54.5℃退火30s，72℃延伸30s，30次循环，72℃终延伸7min，4℃保温。4.一种核酸斑点杂交法检测pstvd的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的核酸斑点杂交法检测pstvd的探针。5.根据权利要求4所述一种核酸斑点杂交法检测pstvd的试剂盒，其特征在于，还包括核酸提取缓冲液、氯仿、杂交液、洗液i、洗液ii、洗涤缓冲液、阻断液、抗体液、检测缓冲液、显色反应缓冲液、nbt、bcip和正电荷尼龙膜方格。6.根据权利要求5所述一种核酸斑点杂交法检测pstvd的试剂盒，其特征在于，所述抗体液含有抗地高辛碱性磷酸酶复合物或链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物。7.一种核酸斑点杂交法检测pstvd的方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤一、提取、固定核酸：取马铃薯样品按质量体积比与提取缓冲液混合、研磨，将研磨所得混合体系置于37℃条件下完成孵育，加入氯仿旋涡震荡使其充分混合，离心所得上清液即为核酸溶液，取所得核酸溶液点样于正电荷尼龙膜的方格中，室温干燥后进行紫外交联固定核酸；步骤二、杂交：杂交液预热熔化后加入权利要求1所述检测pstvd的探针，混匀后将步骤一完成核酸固定的正电荷尼龙膜置于杂交液中，杂交过夜；取出完成杂交的正电荷尼龙膜，依次用洗液i、洗液ii和洗涤缓冲液进行洗涤；步骤三、阻断显色：配制1
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阻断液和抗体液，将步骤二洗涤后的正电荷尼龙膜依次置于1
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阻断液和抗体液中进行孵育；将完成孵育的正电荷尼龙膜置于洗涤缓冲液中洗涤，再置于检测缓冲液中平衡，将显色反应缓冲液、nbt和bcip混匀后均匀涂在正电荷尼龙膜上，避光孵育显色，出现显色则表明待测马铃薯样本中存在pstvd，显色越深则pstvd阳性样本浓度越高。8.根据权利要求7所述一种核酸斑点杂交法检测pstvd的方法，其特征在于，步骤一所述马铃薯样品与提取缓冲液的质量体积比为0.1g:150μl，所述提取缓冲液含有如下浓度的组分：1m nacl、20mm mgcl2、0.5m醋酸钠和3％sds；所述37℃孵育的时间为15min；所述离心为1000rpm离心10min；所述点样为2μl核酸溶液点样于正电荷尼龙膜上的一个方格中；所述
紫外交联固定是在1200j条件下，将正电荷尼龙膜的正反面各交联1min。9.根据权利要求7或8所述一种核酸斑点杂交法检测pstvd的方法，其特征在于，步骤二所述杂交液的预热温度为68℃；所述检测pstvd的探针与杂交液的体积比为10μl:5ml；所述杂交过夜的条件为68℃，8～15rpm；所述洗液i含有如下浓度的组分：2
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ssc，0.1％sds，所述洗液i洗涤是用20ml洗液i在室温下洗涤2次，每次15min；所述洗液ii含有如下浓度的组分：1
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ssc，0.1％sds，所述洗液ii洗涤是用20ml 50℃预热的洗液ii在55℃下洗涤2次，每次15min；所述洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1m马来酸，0.3％tween-20，所述洗涤缓冲液洗涤是用20ml洗涤缓冲液洗涤5min。10.根据权利要求9所述一种核酸斑点杂交法检测pstvd的方法，其特征在于，步骤三所述1
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阻断液的配制方法为用0.1m马来酸缓冲液将预热熔化的10
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阻断液稀释至1
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阻断液；抗体液的配制方法为10ml 1
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阻断液加入2μl抗地高辛碱性磷酸酶复合物或链霉亲和素-碱性磷酸酶复合物；所述正电荷尼龙膜在1
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阻断液中的孵育时间为20min，在抗体液中的孵育时间为30min；所述洗涤缓冲液含有如下浓度的组分：0.1m马来酸，0.3％tween-20，所述洗涤缓冲液洗涤是用20ml洗涤缓冲液洗涤2次，每次15min；所述检测缓冲液含有如下浓度的组分：0.1m tris-hcl，0.1m nacl，所述检测缓冲液平衡是用15ml检测缓冲液平衡2～5min；所述显色反应缓冲液、nbt和bcip混合的体积比为25:1:1；所述避光孵育显色是在37℃避光孵育显色30min。
技术总结
本发明涉及核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针及其制备方法、试剂盒与检测方法，属于马铃薯病毒检测技术领域。为解决现有探针成本高、检测程序复杂的问题，本发明提供了一种核苷酸序列如SEQ ID No.1所示的核酸斑点杂交法检测PSTVd的探针，该探针以阳性cDNA为模板，采用PCR扩增的方式制备，制备方法简便、产量高、成本低。本发明将待测样品的核酸固定于正电荷尼龙膜上，用带有Dig标记的探针与待测样品的核酸进行杂交，通过标记物的颜色反应检测PSTVd的有无。本发明能够检测到更低含量的核酸，灵敏度更高；仅需粗提核酸即可进行检测，简化了检测程序，更易于操作，对检测设备的要求低，检测场所的适应性广。测场所的适应性广。测场所的适应性广。
技术研发人员：白艳菊 王腾 张威 刘尚武 黄元炬 马爽
受保护的技术使用者：黑龙江省农业科学院经济作物研究所
技术研发日：2021.12.20
技术公布日：2022/2/11