KCNJ16基因突变体及其应用

kcnj16基因突变体及其应用
技术领域
1.本发明属于生物技术领域，具体涉及kcnj16基因突变体及其应用。


背景技术：

2.内分泌腺体疾病包括甲状腺功能减退和甲状旁腺功能减退。
3.其中，甲状腺功能减退是甲状腺激素合成及分泌减少、或其生理效应不足所致机体代谢降低机体代谢功能降低的疾病，其临床表现为：面色苍白，眼睑和颊部虚肿，表情淡漠，全身皮肤干燥、增厚、粗糙多脱屑，非凹陷性水肿，毛发脱落，手脚掌呈萎黄色，体重增加，少数病人指甲厚而脆裂；记忆力减退，智力低下，嗜睡，反应迟钝，多虑，头晕，头痛，耳鸣，耳聋，眼球震颤，共济失调，腱反射迟钝，跟腱反射松弛期时间延长，重者可出现痴呆，木僵，甚至昏睡；心动过缓，心输出量减少，血压低，心音低钝，心脏扩大，可并发冠心病，但一般不发生心绞痛与心衰，有时可伴有心包积液和胸腔积液；厌食、腹胀、便秘；肌肉软弱无力、疼痛、强直，可伴有关节病变如慢性关节炎；女性月经过多，久病闭经，不孕；男性阳痿，性欲减退；病情严重时，由于受寒冷、感染、手术、麻醉或镇静剂应用不当等应激可诱发黏液性水肿昏迷或称“甲减危象”，表现为低体温(t〈35℃)，呼吸减慢，心动过缓，血压下降，四肢肌力松弛，反射减弱或消失，甚至发生昏迷，休克，心肾功能衰竭；表情呆滞，发音低哑，颜面苍白，眶周浮肿，两眼距增宽，鼻梁扁塌，唇厚流涎，舌大外伸四肢粗短、鸭步；身材矮小，智慧低下，性发育延迟。
4.甲状旁腺功能减退是指甲状旁腺素产生减少或作用缺陷造成的低钙血症、高磷血症为主要症状的疾病。甲状旁腺功能减退的临床表现为：神经肌肉应激性增加，初期主要有麻木、刺痛和蚁走感，严重者呈手足搐搦，甚至全身肌肉收缩而有惊厥发作，一般当血游离钙浓度≤0.95mmol/l(3.8mg/dl)，或血总钙值≤1.88mmol/l(7.5mg/dl)时常出现症状；癫痫发作，其类型有大发作、小发作、精神运动性发作和癫痫持续状态；外胚层组织营养变性，如低钙性白内障、出牙延迟、牙发育不全、磨牙根变短、龋齿多、甚至缺牙、皮肤角化过度、指(趾)甲变脆、粗糙和裂纹及头发脱落等；骨骼改变，病程长、病情重者可有骨骼疼痛，以腰背和髋部多见。骨密度正常或增加；胃肠道功能紊乱，有恶心、呕吐、腹痛和便秘等；心血管异常，低血钙刺激迷走神经可导致心肌痉挛而突然死亡，患者心率增速或心律不齐；转移性钙化，多见于脑基底节(苍白球、壳核和尾状核)，常对称性分布；典型患者常有所谓aho体型(身材矮粗、体型偏胖、脸圆、颈短、盾状胸)，指、趾骨畸形(多为第4、5掌骨或跖骨)。
5.内分泌腺体疾病给患者及家庭带来了极大的危害。


技术实现要素：

6.有鉴于此，本发明的目的在于提供一种基因突变及其应用。
7.为实现上述目的，本发明的技术方案为：
8.本发明的目的在于保护一种基因突变，其与野生型kcnj16基因相比，具有以下突变：c.637(exon6)g》t。
9.本发明的目的还在于保护一种核酸，其与野生型kcnj16基因相比，所述核酸具有以下突变：c.637(exon6)g》t。
10.本发明的目的还在于保护一种蛋白质，其与野生型kcnj16基因表达的蛋白质的氨基酸序列相比，所述蛋白质的氨基酸序列具有以下突变：p.e213
→
x，206。
11.本发明的目的还在于保护检测如上所述基因突变或如上所述核酸或如上所述蛋白质的试剂在制备试剂盒或设备中的应用，所述试剂盒或设备用于检测肾小管酸中毒症、内分泌腺体疾病或听力疾病，所述试剂包括特异性针对所述基因突变、所述核酸和所述蛋白质中的至少一种的所述抗体、探针、引物及质谱检测试剂的至少一种。
12.本发明的目的还在于保护生物模型在筛选药物中的应用，所述生物模型至少携带以下任意一种：如上所述基因突变；如上所述核酸；如上所述蛋白质；所述生物模型为细胞模型或动物模型。
13.本发明的目的还在于保护特异性改变如上所述基因突变或如上所述核酸的试剂在制备药物中的应用，所述药物用于治疗肾小管酸中毒症、内分泌腺体疾病或听力疾病。
14.本发明的目的还在于保护检测肾小管酸中毒症、内分泌腺体疾病或听力疾病的试剂盒，所述试剂盒中包括检测如上所述基因突变的试剂，和/或，如上所述核酸的试剂，和/或，检测如上所述蛋白质的试剂。
15.本发明的有益效果在于：
16.本发明为肾小管酸中毒(低钾、高氯、酸中毒)、内分泌腺体病(甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退)和听力下降疾病的诊断和治疗提供了良好的理论和实践基础。
附图说明
17.图1为小鼠测序结果，其中，query为野生型基因组序列，subject为突变后实际测序结果。mutation为突变位点；
18.图2为小鼠听力检测结果，其中，a为kcnj16(e213x)点突变小鼠的构建流程，b为三种基因型小鼠12周龄时的大体照片，c为免疫印迹法检测kir5.1蛋白羧基端(kir5.1-c)、氨基端(kir5.1-n)的表达，以β肌动蛋白(actb)为内参；d为蛋白印迹条带的灰度分析，*表示与wt组比较，p值小于0.05；e为小鼠听性脑干诱发电位(abr)检测三周小鼠的听力阈值，wild type allele为野生型，targeted allele为目标等位基因，point mutation allele为点突变等位基因，exon为kcnj16的外显子，wt、he、ho分别为野生型、杂合子、纯合子，下同；
19.图3为骨密度检测结果，采用微ct扫描技术进行测量，其中，a为小鼠股骨的二维及三维图像，b为骨密度(bmd)测量值的比较，c为骨小梁分离度(tb.sp)的比较，d为骨表面积组织体积比值(bs/tv)的比较，e为骨小梁数量(tb.n)的比较，f为骨小梁厚度(tb.th)的比较。
具体实施方式
20.所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
21.实施例1
22.突变基因
23.2018年9月，发明人在临床工作中发现了一例kcnj16基因(nm_001270422.1)无义突变(p.e213
→
x，206)的家系，经检测，该突变基因含有以下突变：c.637(exon6)g》t，其中，检测方法为基因全外显子测序，基因全外显子测序委托广州金域医学检验中心完成。
24.该家系中4个纯合突变患者主要临床表现均为肾小管酸中毒(低钾、高氯、酸中毒)、内分泌腺体病(甲状腺功能减退、甲状旁腺功能减退)和听力下降，而其余13个杂合突变的家系成员无明显临床表现。
25.kcnj16基因编码整流性钾离子通道5.1(kir 5.1，inward rectifying potassium channels 5.1；np_001257351)蛋白。查阅ncbi数据库，上述点突变使碱基序列中编码第213号氨基酸的密码子变成终止密码子，因此，该蛋白第213位之后的206个氨基酸缺失，而丢失的206个氨基酸正好位于c端胞内区。
26.其中，野生型kcnj16基因的dna序列获取网址为：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/3773。
27.整流性钾离子通道5.1(kir 5.1，inward rectifying potassium channels 5.1；np_001257351)蛋白的氨基酸序列获取网址为：https://www.uniprot.org/uniprot/q9npi9。
28.实施例2
29.kcnj16 e213x点突变转基因小鼠的构建，具体方法为：委托上海南方模式生物公司，采用crispr/cas9技术，利用同源重组修复的方式，引入目的点突变。简要过程如下：通过体外转录的方式，获得cas9 mrna和guiderna，通过合成获得oligo donor dna，将cas9 mrna、grna(aaaccatgtggtagagggcacgg)和donor dna(gggaagctttgcctcatgtggcgcataggtgacttccgaccaaaccatgtggtatagggcaccgtgagagcccaacttctgcgctattcagaagacagtgaagggaggat)显微注射到c57bl/6j小鼠的受精卵中，获得f0代小鼠。pcr产物测序阳性的f0代小鼠与c57bl/6j小鼠交配，共获得3只阳性f1代小鼠。
30.突变目的基因名称(ensembl号)：kcnj16(ensmusg00000051497)
31.突变目的基因ensembl网址链接：http://asia.ensembl.org/mus_musculus/gene/summary？db＝core；g＝ensmusg00000051497；r＝11:110968033-111027968；t＝ensmust00000180023
32.突变针对的转录本(ensembl号)：kcnj16-201(ensmust00000180023.7)
33.突变针对的位点：e213x
34.检测本实施例构建的kcnj16 e213x点突变转基因小鼠的体重、饮水量、尿量、血/尿电解质、骨密度、听力、甲状旁腺素、甲状腺激素等指标，并与野生型小鼠、杂合子小鼠进行对比，结果如表1和图1所示所示；
35.其中，杂合子小鼠的构建方法为：利用f1代小鼠进行交配获得的下一代小鼠，采集鼠尾提取cdna，并进行基因测序，鉴定所产生的杂合子。
36.表1 检测结果
[0037][0038][0039]
注：表中数据以均数
±
标准误的形式呈现。*p《0.05；**p《0.01；***p《0.001；****p《0.0001vs野生型。野生型，n＝8～43；杂合子，n＝8～47；纯合子，n＝8～45；其中，n为小鼠的数量，各个组别以其平均值作为检测结果；以上各个指标的检测方法为：
①
血压采用coda tail-cuff系统(kent scientific corporation)进行测定，将小鼠固定在特定的支架上，人工加热以维持正常血压，采用专门的容积压力记录(vpr)传感器，测量置于动物尾部上方的血容量变化；
②
饮水量及尿电解质测定：通过小鼠代谢笼收集各组小鼠24小时尿，测定饮水量、尿量并称重，以小鼠体重标准化24小时尿量及饮水量，尿电解质(钾、钠、氯、钙、鳞)的测定在陆军军医大学第一附属医院检验科完成；
③
动脉血气分析：通过腹主动脉取血，采用gem premier 3000血气分析仪(instrumentation laboratory,usa)检测各组小鼠动脉血中ph值、碳酸氢根离子浓度、碱剩余(be)等；
④
血电解质及激素水平的测定方法：通过摘眼球取血，离心后获得血清，一部分送陆军军医大学第一附属医院检验科测定血电解质(钾、钠、氯、钙、鳞)的浓度，另一部分采用酶联免疫吸附试验(elisa)检测三碘甲状腺原氨酸(t3；货号ml422038-c),甲状腺素(t4；货号ml001955-c),促甲状腺素(tsh；货号ml1001956-c)和甲状旁腺素(pth 1-84(intact)；cat#ml037705-c)，试剂盒均购自上海酶联生物。
[0040]
由表1可知，生理学指标显示，与野生型小鼠相比，纯合子小鼠体重较野生型明显下降、饮水量及尿量增加，血压无明显变化。动脉血气分析结果显示，纯合子小鼠存在代谢性酸中毒；血清离子检测结果显示纯合子小鼠低钾血症、高氯血症、低钙血症、高磷血症；尿电解质分析结果显示，纯合子小鼠存在高尿钙、低尿磷，而血钠、尿钠正常。激素水平检测显示，纯合子小鼠存在促甲状腺激素水平升高，t3及t4正常，甲状旁腺激素水平下降。
[0041]
综上，纯合子小鼠存在多饮、多尿、体重下降，高氯性代谢性酸中毒、原发性甲状旁腺功能减退、亚临床甲状腺功能减退。
[0042]
对本实施例构建的kcnj16 e213x点突变转基因小鼠(野生型、杂合子、纯合子分别标记为wt、he、ho)进行同周龄三组雄性小鼠之间的体型及外观比较，结果如表2所示；
[0043]
其中，体型的检测方法为：采用电子秤测量各组小鼠的体重(单位：g)；
[0044]
外观的检测方法为：采用佳能相机拍照；
[0045]
对本实施例构建的kcnj16 e213x点突变转基因小鼠(野生型、杂合子、纯合子分别标记为wt、he、ho)进行免疫印迹检测整流性钾离子通道5.1(kir 5.1，inward rectifying potassium channels 5.1；np_001257351)蛋白的羧基端表达量，结果如表3所示；
[0046]
kir5.1羧基端表达量的检测方法为：以1％戊巴比妥钠麻醉小鼠后取肾脏，pbs漂洗后，取左肾上极约50mg组织，采用ripa裂解液(lysis buffer，凯基生物)提取总蛋白，采用考马斯亮蓝法进行蛋白定量；按照免疫印迹(western blot)的常规流程：配制10％分离胶，凝固后配制浓缩胶，按照每组50ug的等总蛋白量上样，以80-100v恒压电泳，满意后将胶条组装在转膜装置上(pvdf膜)湿转1小时(恒压100v)，5％脱脂奶粉常温封闭2小时，以kir5.1羧基端抗体(alomone labs，apc-123,稀释比例1:1000)孵育，4℃过夜，tbst漂洗3次，每次10分钟；以山羊抗兔igg二抗于常温下孵育1小时，tbst漂洗3次，每次10分钟，显影并采集图片。本实验以辣根过氧化物酶(hrp)标记的β肌动蛋白(actb)为内参。应用imagej软件(https://imagej.nih.gov/ij/)计算灰度，进行统计分析。
[0047]
对本实施例构建的kcnj16 e213x点突变转基因小鼠(野生型、杂合子、纯合子分别标记为wt、he、ho)进行听力检测(abr)，结果如图2所示；
[0048]
听力检测(abr)的方法为：用1％戊巴比妥腹腔麻醉小鼠后，使用bio sig rz平台的tdt-iii系统(tucker-davis-technologies,fl,美国)记录听性脑干诱发电位(abr)，采用click和纯音刺激模式，分别记录8、16和32千赫频率下的反应，从90d b声压级(spl)开始，以5d b为间隔进行递减声强级，阈值为产生可重复波形的最低刺激水平。
[0049]
表2 体型及外观检测结果
[0050]
[0051]
[0052]
[0053][0054]
由表2可知，同周龄三组雄性小鼠比较，突变小鼠体型偏小。
[0055]
表3 羧基端表达量检测结果
[0056] 野生型杂合子纯合子 10050.46.1 10055.51.5 10043.85.3 10048.48.1 10051.55.1
[0057]
由表3可知，同周龄三组雄性小鼠比较，突变小鼠整流性钾离子通道5.1kir蛋白的羧基端表达量显著降低
[0058]
由图2可知，突变后小鼠的听力明显下降。
[0059]
对本实施例构建的kcnj16 e213x点突变转基因小鼠(野生型、杂合子、纯合子分别标记为wt、he、ho)进行股骨微ct及三维成像检测，结果如图3所示；
[0060]
其中，股骨微ct的检测委托上海南方模式生物科技股份有限公司完成，采用微ct扫描各组小鼠股骨，获取各参数：骨密度(bmd)、骨小梁分离度(tb.sp)、骨表面积组织体积比值(bs/tv)、骨小梁数量(tb.n)、骨小梁厚度(tb.th)的数值，并作统计分析；
[0061]
三维成像的检测委托上海南方模式生物科技股份有限公司完成，采用mutimodal 3d visualization软件对微ct的数据进行分析和三维重建。
[0062]
由图3可知，与突变型相比，kcnj16点突变后小鼠骨结构发生明显变化。
[0063]
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。