一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法与流程

1.本发明涉及核酸检测领域，具体是一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法。


背景技术：

2.鸭细小病毒是细小病毒科依赖病毒属成员，1～30日龄雏番鸭最为易感，番鸭细小病毒的典型临床症状为呼吸困难、胰腺坏死、渗出性肠炎导致的腹泻等，感染番鸭的死亡率可达10％～80％，并且与日龄呈负相关，且会影响病愈番鸭的生长发育速度，使其失去经济价值。番鸭细小病毒病，该病在世界范围内呈广泛流行，由于其高发病率和高死亡率，使番鸭养殖业遭受了巨大的经济损失。mdpv是单股dna病毒，其长度约为5.1kb。基因组两侧翼有约 440个碱基组成的末端倒置的重复序列。
3.目前检测鸭细小的方法有rt-pcr、荧光定量pcr、elisa、病毒分离、病毒中和等svv实验室诊断方法，但上述方法操作繁琐，需依赖昂贵的仪器，且耗时较长，在2h以上。环介导等温扩增技术是一种新型的核酸扩增方法，其反应过程始终维持在恒定的温度下进行。根据鸭细小病毒诊断标准，结合流行病学史、临床表现，实验室pcr核酸检测是鸭细小确诊、治疗效果和治愈的重要依据。
4.因此，本领域技术人员提供了一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的问题。


技术实现要素：

5.本发明的目的在于提供一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，以解决上述背景技术中提出的目前检测鸭细小的方法有rt-pcr、荧光定量pcr、 elisa、病毒分离、病毒中和等svv实验室诊断方法，但上述方法操作繁琐，需依赖昂贵的仪器，且耗时较长，在2h以上。环介导等温扩增技术是一种新型的核酸扩增方法，其反应过程始终维持在恒定的温度下进行。根据鸭细小病毒诊断标准，结合流行病学史、临床表现，实验室pcr核酸检测是鸭细小确诊、治疗效果和治愈的重要依据的问题。
6.为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
7.一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，包括：
8.步骤一：检测试剂和材料准备，检测试剂包括检测猪是否感染鸭细小的引物组、反应液、阴性对照组和材料，引物组包括引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6，引物组中各引物干粉1od；反应液包括核酸反应液，核酸反应液包括具有链置换活性的dna聚合酶、buffer、dntp、mgso4、betaine 和荧光染料；阴性对照组包括不含目的基因反应液；材料包括未感染鸭细小病毒的鸭血清样本和鸭坦步苏病毒核酸样本；
9.步骤二：病毒dna提取，使用病毒dna提取试剂盒提取样本dna；
10.步骤三：引物稀释，将试剂盒中引物1和引物2稀释成40um,引物3和引物4稀释成5um,引物5和6稀释成20um；
11.步骤四：扩增反应体系，反应浓缩液15ul，引物组6ul,模板4ul和总反应体系25ul；
12.步骤五：扩增曲线和溶解曲线获得，将步骤四中的反应浓缩液、引物组、模板和总反应体系25混匀，放入定量pcr仪或恒温荧光基因扩增仪，设置 65℃、30s/循环，60个循环或者65℃30分钟，通过fam通道，每15s收集一次荧光信号，扩增结束后设置98℃-80℃的退火程序，间隔10-15秒收集一次荧光信号；可选循环完成后获得扩增曲线和溶解曲线和基因快速检测系统中获得扩增曲线和溶解曲线；
13.步骤六：判定，根据步骤五所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定。
14.作为本发明的一种优选实施方式：所述
15.引物1：tgaacgctccggtagctctcttgattggcacattgagatgg
16.引物2：aaaagcaccacttgaaaatgcctccaatgaaatagtctgtggc
17.引物3：gagcatcaagcttcaactgt
18.引物4：taatctccagaactgggtct
19.引物5：agccagtgttttgcagaggt
20.引物6：cgagcagaattgctactaacaa
21.作为本发明的一种优选实施方式：所述引物组设计根据鸭细小病毒特异性保守片段，使用primer explorer软件设计引物组。
22.作为本发明的一种优选实施方式：所述引物稀释过程中，稀释引物要达到的浓度(pmol/ul)＝母液浓度(pmol/ul)
×
汲取母液的体积(ul)
÷
(汲取母液的体积(ul)+加水量(ul)。
23.作为本发明的一种优选实施方式：所述引物组中引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6对应目标序列8个特异区域。
24.作为本发明的一种优选实施方式：所述基因快速检测系统中，64℃、30 分钟，获得扩增曲线和溶解曲线。
25.作为本发明的一种优选实施方式：所述步骤六过程中，根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定，扩增曲线有明显的“s”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显“s”型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显“s”型曲线，但溶解曲线不峰型单一判定为非特异性扩增；阴性质控品的检测结果是阴性结果，则是本次实验有效，否则本次实验无效。
26.与现有技术相比，本发明的有益效果是：
27.本发明一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法,具有以下优点：
28.(1)高特异性：6条引物对应目标序列8个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性；
29.(2)操作简单：只要将待测样本、设计的特异引物和反应液混合，上机扩增30分钟即可得到检测结果；
30.(3)在使用一个反应管中即可检测出样本是否感染了鸭细小病毒，检测成本低；
31.(4)试剂盒使用了嵌入式的荧光染料，在定量pcr仪或恒温荧光基因扩增仪上反应，实现了实时监控过程，并且可以针对扩增产物做溶解曲线分析，克服了普通检测试剂盒中没办法对产物特异性分析的问题；
32.(5)试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在基因快速检测仪和定量pcr仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上，如金属浴等。
附图说明
33.通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
34.图1为一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法的步骤流程的结构示意图；
35.图2为一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法中的快检体系灵敏度梯度实验扩增曲线的结构示意图；
36.图3为一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法中的快检体系灵敏度梯度实验溶解曲线的结构示意图；
具体实施方式
37.请参阅图1-3，本发明实施例中，一种针对鸭细小病毒的核酸快速检测方法，包括：
38.步骤一：检测试剂和材料准备，检测试剂包括检测猪是否感染鸭细小的引物组、反应液、阴性对照组和材料，引物组包括引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6，引物组中各引物干粉1od；反应液包括核酸反应液，核酸反应液包括具有链置换活性的dna聚合酶、buffer、dntp、mgso4、betaine 和荧光染料；阴性对照组包括不含目的基因反应液；材料包括未感染鸭细小病毒的鸭血清样本和鸭坦步苏病毒核酸样本；
39.步骤二：病毒dna提取，使用病毒dna提取试剂盒提取样本dna；
40.步骤三：引物稀释，将试剂盒中引物1和引物2稀释成40um,引物3和引物4稀释成5um,引物5和6稀释成20um；
41.步骤四：扩增反应体系，反应浓缩液15ul，引物组6ul,模板4ul和总反应体系25ul；
42.步骤五：扩增曲线和溶解曲线获得，将步骤四中的反应浓缩液、引物组、模板和总反应体系25混匀，放入定量pcr仪或恒温荧光基因扩增仪，设置 65℃、30s/循环，60个循环或者65℃30分钟，通过fam通道，每15s收集一次荧光信号，扩增结束后设置98℃-80℃的退火程序，间隔10-15秒收集一次荧光信号；可选循环完成后获得扩增曲线和溶解曲线和基因快速检测系统中获得扩增曲线和溶解曲线；
43.步骤六：判定，根据步骤五所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定。
44.引物1：tgaacgctccggtagctctcttgattggcacattgagatgg
45.引物2：aaaagcaccacttgaaaatgcctccaatgaaatagtctgtggc
46.引物3：gagcatcaagcttcaactgt
47.引物4：taatctccagaactgggtct
48.引物5：agccagtgttttgcagaggt
49.引物6：cgagcagaattgctactaacaa
50.引物组设计根据鸭细小病毒特异性保守片段，使用primer explorer软件设计引物组。引物稀释过程中，稀释引物要达到的浓度(pmol/ul)＝母液浓度(pmol/ul)
×
汲取母液的体积(ul)
÷
(汲取母液的体积(ul)+加水量(ul)。引物组中引物1、引物2、引物3、引物4、引物5和引物6对应目标序列8个特异区域。基因快速检测系统中，64℃、30分钟，获得扩增曲线和溶解曲线。步骤六过程中，根据所获得扩增曲线和溶解曲线进行判定，扩增曲线有明显的“s”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，则判定为阳性结果；扩增曲线没有出现明显“s”型曲线，则判定为阴性结果；扩增曲线有明显“s”型曲线，但溶解曲线不峰型单一判
定为非特异性扩增；阴性质控品的检测结果是阴性结果，则是本次实验有效，否则本次实验无效。
51.定量pcr平行实验：
52.定量pcr扩增检测体系，无菌无核酸酶水7ul、pcr反应液12.5ul、酶混合液1ul、荧光探针2.5ul、dna模板2ul；在荧光pcr以上进行一下反应：95℃ 10s,一个循环；95℃5s，60℃35s,在每个循环第二步(60℃35s)收集荧光信号，40个循环；
53.特异性检测：
54.使用步骤四、步骤五和步骤六中提及的体系，分别检测鸭细小病毒dna 和阴性血清及鸭坦步苏病毒核酸；
55.灵敏性试验检测：
56.使用分光光度计测定cdna浓度，10梯度稀释，分别为100、10-1
、10-2
、 10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，使用上述步骤四、步骤五和步骤六中提及的体系对每个浓度进行检测；
57.试验结果：
58.引物组及体系检测：
59.使用扩增体系25ul，包括反应液15ul、鸭细小病毒引物组混合液6ul、鸭细小dna样本4ul，扩增曲线有明显的“s”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，判定为阳性结果，且阴性对照组的检测结果是阴性，表示引物之间并无二聚体等非特异扩增，与荧光定量pcr检测结果一致；
60.特异性实验：
61.使用扩增体系25ul，包括反应液15ul、鸭细小病毒引物组混合液6ul，核酸样本4ul,分别检测鸭细小病毒dna和未感染鸭细小病毒的血清核酸样本及鸭坦步苏病毒核酸样本，鸭细小dna模板反应管有明显的“s”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，且阴性对照组的检测结果是阴性，而未感染鸭细小病毒的血清核酸样本及鸭坦步苏病毒核酸样本的反应孔没有扩增，表示该引物组及扩增体系可有效区分鸭细小病毒和其他类似病原；
62.快检体系灵敏度梯度实验：
63.使用分光光度计测定cdna浓度，10梯度稀释，分别为100、10-1
、10-2
、 10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，使用上述步骤四、步骤五和步骤六中提及的体系对每个浓度进行检测，结果如所获得扩增曲线和溶解曲线，可以看出样品浓度为10-4时，依旧会产生扩增曲线，并且溶解曲线峰型单一且尖锐，说明本发明鸭细小检测试剂盒灵敏度可达到10-4
。
64.本发明的工作原理是：定量pcr平行实验：定量pcr扩增检测体系，无菌无核酸酶水7ul、pcr反应液12.5ul、酶混合液1ul、荧光探针2.5ul、dna 模板2ul；在荧光pcr以上进行一下反应：95℃10s,一个循环；95℃5s， 60℃35s,在每个循环第二步(60℃35s)收集荧光信号，40个循环；
65.特异性检测：
66.使用步骤四、步骤五和步骤六中提及的体系，分别检测鸭细小病毒dna 和阴性血清及鸭坦步苏病毒核酸；
67.灵敏性试验检测：
68.使用分光光度计测定cdna浓度，10梯度稀释，分别为100、10-1
、10-2
、 10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，使用上述步骤四、步骤五和步骤六中提及的体系对每个浓度进行检测；
69.试验结果：
70.引物组及体系检测：
71.使用扩增体系25ul，包括反应液15ul、鸭细小病毒引物组混合液6ul、鸭细小dna样本4ul，扩增曲线有明显的“s”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，判定为阳性结果，且阴性对照组的检测结果是阴性，表示引物之间并无二聚体等非特异扩增，与荧光定量pcr检测结果一致；
72.特异性实验：
73.使用扩增体系25ul，包括反应液15ul、鸭细小病毒引物组混合液6ul，核酸样本4ul,分别检测鸭细小病毒dna和未感染鸭细小病毒的血清核酸样本及鸭坦步苏病毒核酸样本，鸭细小dna模板反应管有明显的“s”型曲线，以及溶解曲线峰型单一且较为尖锐，且阴性对照组的检测结果是阴性，而未感染鸭细小病毒的血清核酸样本及鸭坦步苏病毒核酸样本的反应孔没有扩增，表示该引物组及扩增体系可有效区分鸭细小病毒和其他类似病原；
74.快检体系灵敏度梯度实验：
75.使用分光光度计测定cdna浓度，10梯度稀释，分别为100、10-1
、10-2
、 10-3
、10-4
、10-5
、10-6
、10-7
，使用上述步骤四、步骤五和步骤六中提及的体系对每个浓度进行检测，结果如所获得扩增曲线和溶解曲线，可以看出样品浓度为10-4时，依旧会产生扩增曲线，并且溶解曲线峰型单一且尖锐，说明本发明鸭细小检测试剂盒灵敏度可达到10-4
。
76.具有以下优点：
77.(1)高特异性：6条引物对应目标序列8个特异区域的识别保证了检测反应的高度特异性；
78.(2)操作简单：只要将待测样本、设计的特异引物和反应液混合，上机扩增30分钟即可得到检测结果；
79.(3)在使用一个反应管中即可检测出样本是否感染了鸭细小病毒，检测成本低；
80.(4)试剂盒使用了嵌入式的荧光染料，在定量pcr仪或恒温荧光基因扩增仪上反应，实现了实时监控过程，并且可以针对扩增产物做溶解曲线分析，克服了普通检测试剂盒中没办法对产物特异性分析的问题；
81.(5)试剂盒可用于多个检测平台上，不仅可以用在基因快速检测仪和定量pcr仪，也可以用在其他可以提供恒定温度的设备上，如金属浴等。
82.以上所述的，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。