一种鉴定新型冠状病毒的引物组、试剂盒及其应用的制作方法

1.本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种鉴定新型冠状病毒的引物组、试剂盒及其应用。


背景技术：

2.冠状病毒在系统分类上属冠状病毒属(coronavirus)，基因组为线性单股正链的rna病毒，是自然界广泛 存在的一大类病毒。2019爆发的目前仍在世界范围内流行的新冠肺炎的病原菌新型冠状病毒(2019-ncov或 sars-cov-2)，是目前已知的第7种可以感染人的冠状病毒。
3.新冠肺炎爆发后，包括美国thermo scientific、华大基因公司等国内多家机构陆续推出了基于测序技术 检测新型冠状病毒的方法或试剂盒。已有的基于二代测序技术的检测均是通过检测新型冠状病毒基因组上的单 核苷酸(single nucleotide polymorphisms，snp)变异对新冠病毒进行鉴定和变异分析。snp标记是二态性 标记，在对包括病毒在内的以群体形式存在的微生物进行鉴定时，存在多态性低，分型错误率高的缺陷，且现 有技术不能用于测定样本中新型冠状病毒的绝对的拷贝数，这不利于新型冠状病毒的检测。


技术实现要素：

4.为了解决现有技术的问题，本发明实施例提供了一种鉴定新型冠状病毒的引物组、试剂盒及其应用。所述 技术方案如下：
5.一方面，本发明提供了一种鉴定新型冠状病毒的引物组，所述引物组包括第1引物对至第168引物对中的 至少一对，每个所述引物对均包括正向引物和反向引物，所述第1引物对的正向引物、所述第1引物对的反向 引物至所述第168引物对的正向引物和第168引物对的反向引物依次如序列表中seq id no：1至seq id no： 336所示。
6.另一方面，本发明实施例提供了一种鉴定新型冠状病毒的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述的引物组。
7.具体地，所述试剂盒还包括如序列表中seq id no：337至seq id no：346所示的9个内标dna。
8.具体地，所述试剂盒还包括多重pcr预混液。
9.又一方面，本发明实施例提供了一种引物组的应用，所述应用包括：利用所述引物组对新型冠状病毒基因 组上的168个mnp标记位点中的至少一个进行检测，根据获得的mnp标记位点的序列进行非诊断目的的新型冠 状病毒的定性鉴定、定量鉴定、遗传变异鉴定、mnp指纹数据库的构建和精细分型。
10.本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的引物组对新冠病毒基因组上168个 mnp标记位点进行检测，且检测结果具有较高的扩增特异性和稳定性，使用该引物组的试剂盒对新型冠状病毒 的检测同具有良好的灵敏度、重现率和准确
率。该引物组针对本发明实施例提供的mnp标记位点进行检测，能 够用于非诊断目的的新型冠状病毒的定性鉴定、定量鉴定、遗传变异鉴定、mnp指纹数据库的构建和精细分型。
附图说明
11.为了更清楚地说明本公开实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍， 显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本公开的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性 劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
12.图1是本公开实施例提供的用于新型冠状病毒定量的标准曲线图。
具体实施方式
13.为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
14.本发明实施例提供的新型冠状病毒的来源为湖北省疾病预防控制中心赠予。
15.实施例一
16.本发明提供了一种鉴定新型冠状病毒的引物组，该引物组包括第1引物对至第168引物对中的至少一对， 每个引物对均包括正向引物和反向引物，第1引物对的正向引物、第1引物对的反向引物至第168引物对的正 向引物和第168引物对的反向引物依次如序列表中seq id no：1至seq id no：336所示。
17.在实现时，可以对引物组的碱基进行修饰。
18.本发明实施例提供了一种鉴定新型冠状病毒的试剂盒，该试剂盒包括上述引物组。
19.具体地，该试剂盒还可以包括如序列表中seq id no：337至seq id no：346所示的9个内标dna。
20.具体地，该试剂盒还可以包括多重pcr预混液。
21.本发明实施例提供了一种引物组的应用，利用引物组对新型冠状病毒基因组上的168个mnp标记位点中的 至少一个进行检测，用于非诊断目的的新型冠状病毒的定性鉴定、定量鉴定、遗传变异鉴定、mnp指纹数据库 的构建和新型冠状病毒的精细分型。同时，本发明实施例提供的引物组及其对应的mnp标记位点如表1所示。
22.表1为引物组的序列以及对应的mnp标记位点
23.24.25.26.27.28.[0029][0030]
评估该引物组的性能，具体如下：
[0031]
将拷贝数已知的sars-cov-2的核糖核酸国家标准品(gbw(e)091099)加入到2ng人基因组dna中，该人 基因组dna的来源为本实验室保存的人huh-7细胞系，分别制备成1拷贝/检验、10拷贝/检验和100拷贝/检 验的新型冠状病毒模拟样本，同时，在每个模拟样本中加入1μl的内标dna，同时设置由无菌水和1μl内标 dna组成的两种阴性对照。结果共计检测了如表2所示的2个阴性对照、1拷贝/检验、10拷贝/检验和100拷 贝/检验共计5个样本。每天使用本发明实施例提供的试剂盒对5个样本进行扩增，每次扩增进行3次重复，得 到扩增产物，将该扩增产物连接上购买的商业化样本标签，获得适用于高通量测序的文库。连续构建4天，即 每个样本获得12个文库，5个样本共计获得60个文库。将60个文库按照等摩尔量进行混合，混合后进行高通 量测序。
[0032]
内标dna的制备方法具体如下：
[0033]
从本发明实施例提供的168个mnp标记位点中选择1个或多个mnp标记位点；
[0034]
针对选择的每个mnp标记位点，分别设计至少3条与所选的mnp标记位点扩增引物一致，且扩增区长度相 同，但是dna序列与所有mnp标记位点均不同的dna序列，本实施例设置3条dna序列；
[0035]
将上述每条dna序列连接到质粒载体上，生成3条dna质粒模板；
[0036]
对3条dna质粒模板单位体积的拷贝数进行定量，并按比例混合，获得单位体积(每μl)含3个dna质粒 模板分别是10拷贝、100拷贝和1000拷贝的内标dna。
[0037]
为了保证定量的准确性，本实施例选择3个mnp标记位点，共获得3套内标dna，共产生如序列表中seq idno：337至seq id no：346所示的9条内标dna序列。将3套内标dna混合，制备成本实施例使用的内标dna， 其最终单位体积(每μl)10拷贝、100拷贝和1000拷贝的dna质粒模板各3条。在进行新型冠状病毒的定量 鉴定时，采用的是同一次检测内相同拷贝数的3条内标dna所对应的测序片段数目的平均值。
[0038]
表2为检测新型冠状病毒的灵敏度及稳定性分析
[0039][0040][0041]
高通量测序结果如表2所示，在每个样本的12组重复实验中(每天3次重复，共计重复4天)，在两种阴 性对照样本和新型冠状病毒核酸标准品的重复间，新型冠状病毒的mnp标记位点的检出效果稳定，可见本发明 实施例提供的试剂盒检测新型冠状病毒的稳定性良好。由于mnp标记检测方法的极度灵敏，致使在部分阴性对 照中也检出了新型冠状病毒的序列，可见该检测过程中的数据污染容易出现假阳性的结果。因此本发明实施例 制定如下质控方案，用于避免假阳性的出现。
[0042]
质控方案具体如下：
[0043]
1)测序数据量大于250兆碱基，且要求内标dna全部检出。测算依据是根据我们对已知新型冠状病毒拷贝 数的样品的多次检验，当测序数据量不大于250兆碱基时，含新型冠状病毒10拷贝/检验及以上的样品会出现 检出mnp标记位点不足6个，且增加测序量也不能满足检出mnp标记位点达到6个的情况；而当测序数据量大 于250兆碱基时，所有含新型冠状病毒10拷贝/检验及以上的样品的检出mnp标记位点都不少于6个。
[0044]
2)计算样本中的新型冠状病毒的信噪比，其中，信噪比指的是新型冠状病毒在测试样本中的信号指数s
t
和同批次阴性对照中的信号指数sc的比值，阴性对照包括：无菌水阴性对照和内标dna阴性对照，其中：
[0045]
新型冠状病毒的信号指数按式(1)计算:
[0046]
s＝n/n
×
100％...................................式(1)
[0047]
式(1)中：
[0048]
s为新型冠状病毒的信号指数(％)；
[0049]
n为样本中，新型冠状病毒的测序片段的数量；
[0050]
n为样本中，内标dna的测序片段的数量；
[0051]st
为待测样本中，新型冠状病毒的信号指数；
[0052]
sc为阴性对照样本中，新型冠状病毒的信号指数；
[0053]
在本实施例中，新型冠状病毒在每个样本中的信噪比具体如表3所示。
[0054]
表3为样本中新型冠状病毒的信噪比
[0055][0056][0057]
结合表3可知，在内标dna阴性对照中的信号指数最大值是0.04％，而在1拷贝/检验中的信号指数平均值 是0.08％，在10拷贝/检验中的信号指数平均值是0.73％，在无菌水阴性对照中，新型冠状病毒的信号指数最大 值为0.72％，可见，无菌水阴性对照的信号指数和10拷贝/检验的样本的信号指数平均值相当，这难以准确鉴 定10拷贝/检验及其以下浓度的样本，而用内标dna作为阴性对照时，能将检测的灵敏度提高到10拷贝/检验 甚至1拷贝/检验。可见，本发明实施例采用内标dna作为阴性对照，能显著提高检测的灵敏度。
[0058]
以内标dna作为阴性对照时，1拷贝/检验中样本的新型冠状病毒的最大信噪比是9(0.18％/0.02％)。因此， 本发明实施例判定标准是以内标dna作为阴性对照，将样本中新型冠状病毒的信噪比大于10，作为判定样本中 检出了新型冠状病毒的核酸的条件之一。在阴性对照样本中检出最多6个mnp标记位点(见表2)。为了避免 少数位点的偏好扩增引起的高的信噪比，本发明实施例对新型冠状病毒核酸阳性的判定标准如下：
[0059]
1)当待测样本中新型冠状病毒的检出标记位点数目不小于6个，且信噪比不小于10时，判定待测样本中 检出新型冠状病毒核酸；
[0060]
2)当待测样本中新型冠状病毒的检出标记位点数目小于6个或信噪比小于10时，判定待测样本中未检出 新型冠状病毒核酸。
[0061]
针对灵敏度
[0062]
为了展示内标dna作为阴性对照对提高检测灵敏度的影响，本实施例同时测试了无菌水作为阴性对照的平 行实验。测序结果具体如表3所示，由表3可知，当使用内标dna作为阴性对照，能将检测样本的灵敏度提高 到10拷贝/检验甚至1拷贝/检验的水平。
[0063]
针对重现率和准确率的评估
[0064]
基于每个样本的12次重复实验，任意两次重复实验中，采用共同检出的mnp标记位
点的主基因型是否可重 现用于评估检测新型冠状病毒的重现率和准确率。具体地，对表2中100拷贝/检验的样本的12组数据分别进 行比较，共计比较1721对mnp标记位点的基因型。比对结果如表4所示，主基因型存在差异的mnp标记位点数 目都为0；依据2次重复实验间可重现的基因型认为是准确的原则进行评估，准确率a＝1-(1-r)/2＝0.5+0.5r， 式中r代表重现率，重现率为主基因型可重现的位点数目占共有位点数目的比率。结果如表4所示。
[0065]
表4为重现率和准确率的评估
[0066][0067]
由表4可知，在重现率实验中每个样本的不同文库间和不同建库批次间mnp标记主基因型的差异对数为0， 即重现率r＝100％，准确率a＝100％。
[0068]
针对特异性的评估
[0069]
将新型冠状病毒和人冠状病毒hcov-229e、hcov-hku1、hcov-nl63、hcov-oc43、人副流感病毒、偏肺病毒、 人鼻病毒、流行性腮腺炎病毒、麻疹病毒、呼吸道合胞病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、 禽流感病毒和寨卡病毒的核酸按照等拷贝数混在一起，制备成混合模板，以内标dna作为阴性对照，采用本发 明实施例提供的引物组对混合模板中的新型冠状病毒进行检测。进行3个重复实验，按照上述质控方案和判定 阈值进行分析后，在3个重复实验中获得测序片段都仅能特异地比对到新型冠状病毒的mnp标记位点，3个重 复实验中，新型冠状病毒检出的mnp标记位点数目分别为153、155和155，信噪比依次是893、690.4和785.4。 按照本发明提供的质控方案和判定标准，在3次重复中，新型冠状病毒的检出率均达到100％，可见本发明实施 例提供的引物组在复杂模板中检测新型冠状病毒的特异性较高。
[0070]
对临床样本中新型冠状病毒的鉴定
[0071]
利用本发明实施例提供的试剂盒对收集到38份咽拭子样本中的新型冠状病毒进行鉴定，38份咽拭子样本 均来源于湖北省疾控预防控制中心，每个样本获得的可比对到新型冠状病毒mnp标记位点的测序片段数最少为 1,510,000条，最多覆盖到全部168个mnp标记位点，每个标记位点的平均覆盖倍数达到近9000倍。每个样本 中9个内标dna均检出，因此38个样本的质控结论均为合格。
[0072]
表5为试剂盒对38份临床样本中新型冠状病毒的检测
[0073][0074]
检测结果显示：本发明实施例提供的试剂盒在4例(s22、s26、s27、s28)和现有的基于荧光定量pcr的 核酸检测方法结果相悖，在进一步的复核中，证实本发明实施例所提供检测结果是正确的。
[0075]
实施例二
[0076]
本发明实施例提供了一种引物组的应用，该应用包括：利用引物组对新型冠状病毒基因组上的168个mnp 标记位点进行检测，根据获得的mnp标记位点的序列进行非诊断目的的新型冠状病毒进行定量鉴定。
[0077]
下面简单介绍一下mnp(多核苷酸多态性)标记位点的制备方法：
[0078]
基于网上公开的hcov-229e的547个基因组、hcov-hku1的518个基因组、hcov-nl63的913个基因组、 hcov-oc43的1426个基因组、mers-cov的1438个基因组、sars-cov-2的
40855个基因组和sars-cov的44326 个基因组作为参考序列，通过序列比对，筛选新型冠状病毒特异的、且在物种内具有多个核苷酸多态性的、两 端保守的基因组区域；对这些区域设计多重pcr引物，并以新冠病毒核糖核酸国家标准品(gbw(e)091099) 为模板进行测试，最终获得检测新型冠状病毒的168个mnp标记位点；
[0079]
获得如表1所示的mnp标记位点，且mnp标记位点在参考序列上的起始位置如表1所示。
[0080]
对于网上不存在基因组数据的物种，也可以通过高通量测序获得待检测微生物物种代表小种的基因组序列 信息，其中高通量测序可以是全基因组或简化基因组测序。为了保证所筛选标记的多态性，一般使用至少10个 分离株的基因组序列作为参考。
[0081]
本实施例中，在每个样本中加入试剂盒中提供的内标dna；统计样本的测序数据中，每条内标dna检出的 测序序列数；绘制内标dna的拷贝数和相应的测序序列数的曲线图，使用excel自带的分析工具生成dna拷贝 数和测序序列数的计算公式。在本实施例中，计算公式为y＝0.9091x-0.0662(r2＝0.9667)。根据样本中，和内 标dna具有相同引物的mnp标记位点的检出测序序列数，使用所产生的计算公式，获得样本中新型冠状病毒的 绝对拷贝数，实现对新型冠状病毒的绝对定量检测。
[0082]
本实施例中，为了避免内标dna检测失败和单个标记位点导致的偏差，该内标dna包括3个mnp标记位点 的扩增引物，每对引物组的内标dna又有3个浓度梯度，分别为10拷贝、100拷贝和1000拷贝。在绘制标准 曲线时，采用的是同一个拷贝数下所对应的测序序列数的平均值。
[0083]
本实施例中，首先对表2所示的1拷贝/检验、10拷贝/检验和100拷贝/检验的新冠病毒核糖核酸标准品 进行检测，绘制标准曲线和定量，结果如图1所示，统计在表2产生的新冠病毒核糖核酸标准品的36组测序数 据中，根据内标dna的拷贝数和对应的测序序列数，绘制了标准曲线。统计和内标dna检测引物相同的mnp标 记位点检出的新型冠状病毒的有效序列数，有效序列指的是比对到目标mnp标记位点上的序列数。然后根据公 式y＝0.9091x-0.0662，计算每个样本中新型冠状病毒的拷贝数。结果发现，对1拷贝/检验样本定量的结果和 预期结果正负偏差在20％左右，而对于10拷贝/检验和100拷贝/检验样本的定量结果和已知结果的正负偏差均 小于5％，由此证明，利用本发明实施例提供的引物组对新型冠状病毒基因组上的168个mnp标记位点进行检测， 从而实现对新型冠状病毒进行精准的定量。
[0084]
采用本发明实施例提供的定量方法对表5检测的38例样本进行新冠病毒的拷贝数定量，拷贝数最低在4拷 贝，最高的能达到6362个拷贝。
[0085]
由此可见，利用上述168个mnp标记位点具有的高多态性、低的检测错误率和基因组高覆盖度，使得本发 明实施例所提供的引物组和试剂盒可以高灵敏地且高准确度地对待测样本中的新型冠状病毒进行定性及定量鉴 定。
[0086]
实施例三
[0087]
采用本发明实施例提供的引物组中的36对引物对，即第1引物对至第36引物对，对新型冠状病毒进行定 性鉴定和定量鉴定。基于表2中1拷贝/检验的标准品的检测结果，选择在1拷贝/检验的s-1～s-12样本中共同 检出的36个mnp标记位点的36对引物对，其中包含了扩增内标dna的3个mnp标记位点的引物对，对表5中 的38例样本进行定性和定量检测，
该36对引物对所获得的定性和定量的检测效果和168对引物对的定性和定 量的检测效果相当，即单独使用该36对引物对也能准确地对新型冠状病毒的阳性样本。由此可见，使用本发明 提供的部分引物对，在含内标dna引物对的条件下，即能够实现对新型冠状病毒准确且灵敏的定性和定量鉴定。 而使用168对引物对能在鉴定病毒变异和构建数据库的应用中发挥更好的效果，鉴定更全面的病毒变异和构建 更精细的指纹数据库。在本实施例中，采用上述168个引物对中的36对引物对共同进行定性鉴定和定量鉴定， 在其他实施例中，还可以采用上述168个引物对中的任一个或任意几个的组合制备内标dna，并进行定性鉴定 和定量鉴定。
[0088]
实施例四
[0089]
本发明实施例提供了一种引物组的应用，该应用包括：利用引物组对新型冠状病毒基因组上的168个mnp 标记位点进行检测，根据获得的mnp标记位点的序列进行非诊断目的的新型冠状病毒的遗传变异鉴定。
[0090]
自新型冠状病毒爆发以后，新型冠状病毒在基因组的很多位置发生了变异，产生了不同的变异株，比如德 尔塔(delta)和欧密克戎(omicron)变异株。mnp标记位点覆盖了新型冠状病毒大部分的基因组区域，通过测 序分析mnp标记位点的序列变异，由此可以准确的揭示样本间所含毒株的遗传变异。本实施例对表5展示的38 个临床样本中，检出150个mnp标记位点以上的7个样本(s1-s7)中病毒的mnp基因型进行序列比对，结果如 表6所示。
[0091]
表6为部分样本感染毒株的基因型比较分析
[0092][0093]
由表6可知，部分样本间的新冠病毒在2～5个mnp标记位点的主基因型存在差异，表明感染的毒株存在变 异。使用引物组鉴定菌株间遗传变异也可以用于保证不同实验室相同命名新型冠状病毒毒株的遗传一致性，从 而保证研究结果的可比较性，这对于新型冠状病毒的科学研究具有重要意义。在本实施例中，采用上述168个 mnp标记位点共同进行新型冠状病毒的遗传变异鉴定，鉴定比较全面的病毒变异。在其他实施例中，还可以采 用上述168个mnp标记位点中的任一个或任意几个的组合进行新型冠状病毒的遗传变异鉴定。
[0094]
实施例五
[0095]
本发明实施例提供了一种引物组的应用，应用包括：利用引物组对新型冠状病毒基因组上的168个mnp标 记位点进行检测，根据获得的mnp标记位点的序列进行新型冠状病毒mnp指纹数据库的构建。
[0096]
将实施例一检测的38份样本的测序数据进行序列比对后，获得每个毒株的在本发明实施例提供的mnp标记 位点的主基因型，从而形成每个毒株的mnp指纹图谱，录入数据库文件，构建成新型冠状病毒的mnp指纹数据 库。所构建的mnp指纹数据库基于检测的毒株的基因序列，因此和所有的高通量测序数据兼容。通过将每次检 测获得的毒株的mnp指纹图谱同已构建的mnp指纹数据库进行比对，将主基因型存在差异的毒株的mnp指纹图 谱所构建的mnp指纹数据库，实现数据库的共建共享和时时更新。在本实施例中，采用上述168个mnp标记位 点共同进行mnp指纹数据库的构建，构建精细的指纹数据库。在其他实施例中，还可以采用上述168个mnp标 记位点中的任一个或任意几个的组合进行mnp指纹数据库的构建。
[0097]
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修 改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。