一种金龟子绿僵菌复壮方法

1.本发明涉及培养基领域，确切地说是一种金龟子绿僵菌菌种复壮方法，应用于草地贪夜蛾等鳞翅目害虫的防控。


背景技术：

2.金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae）属于子囊菌门、肉座菌目、麦角菌科、绿僵菌属，是一种广谱性的杀虫真菌。在自然界中主要进行无性繁殖，由昆虫体壁进行主动入侵而感染不同昆虫，在昆虫血腔中可进行酵母状繁殖，产生大量虫菌体，同时可产生破坏素(destuxin，非核糖体多肽类毒素）等杀虫毒素，抑制昆虫免疫、加速杀虫。已经发现金龟子绿僵菌能够侵染鳞翅目、鞘翅目、同翅目、半翅目、直翅目和双翅目20多种害虫。
3.随着草地贪夜蛾在我国定殖，防治由应急防控迅速转为重要害虫的长期防控工作，生物防治具有不污染环境、持续控制效果好的特点，将发挥越来越重要的作用，研究表明金龟子绿僵菌对草地贪夜蛾具有较好的毒力，且不易产生抗药性，因此金龟子绿僵菌将是防治草地贪夜蛾的重要的资源。
4.而拥有优良的菌种是生物防治工作中最关键的一环。菌种的保藏及复壮是日常生产中非常重要的环节，而菌种在保藏或使用过程中，经过多代培养后会产生退化现象，表现为菌丝生长慢，呈稀疏的长毛状，菌苔薄，用接种针挑取孢子时往往挑到一层白色的薄皮，孢子产生时间推迟，产孢量减少，产生不育孢子，导致毒力降低。一般菌种经过转接7～8代后必须进行菌种复壮，使其恢复或提高原有的特性。
5.金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040由安徽省农业科学院植物保护与农产品质量安全研究所生物防治团队从宁国玉米种植区调查发现田间有疑似感染虫生真菌的草地贪夜蛾僵虫中分离鉴定获得。保藏号为cgmccno.19273，2020年1月17日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。具体测序结果如下：18srdna序列：attatacagcgaaactgcgaatggctcattatataagttatcgtttatttgatagtaccttactacttggataaccgtggtaattctagagctaatacatgctaaaaatcccgacttcggaagggatgtatttattagatacaaaaccaatgcccctcggggctctctggtgattcatgataactcgtcgaatcgcacggccttgcgccggcgatggttcattcaaatttcttccctatcaactttcgatgtttgggtagtggccaaacatggtggcaacgggtaacggagggttagggctcgaccccggagaaggagcctgagaaacggctactacatccaaggaaggcagcaggcgcgcaaattacccaatcccgatacggggaggtagtgacaataaatactgatacagggctcttttgggtcttgtaattggaatgagtacaatttaaatcccttaacgaggaacaattggagggcaagtctggtgccagcagccgcggtaattccagctccaatagcgtatattaaagttgttgtggttaaaaagctcgtagttgaatcttgggcctggctggccggtccgcctcaccgcgtgtactggtccggccgggtctttcactctgcggaaccacatgcccttcagtgggtgtggcggggaagcaggacttttactttgaaaaaattagagtgctctaagcaggccaatgctcgaatacattagcatggaataataaaataggacgcgcggttctattttgttggtttctaggaccgccgtaatgatgaatagggacagtcgggggcatcagtattcagttgtcagaggtgaaattcttggatctactgaagactaactactgcgaaagcatttgccaaggatgttttcattaatcaggaac
gaaagttaggggatcgaagacgatcagataccgtcgtagtcttaaccataaactatgccgactagggatcggacgatgttatttagttgactcgttcggcaccttacgagaaatcaaagtgcttgggctccagggggagtatggtcgcaaggctgaaacttaaagaaattgacggaagggcaccaccaggggtggagcctgcggcttaatttgactcaacacggggaaactcaccaggtccagacacaatgaggattgacagattgagagctctttcttgattttgtgggtggtggtgcatggccgttcttagttggtggagtgatttgtctgcttaattgcgataacgaacgagaccttaacctgctaaatagtcagtattgctatggcagtacgcaggcttcttagagggaits序列：tgatatgcttaagttcagcgggtagtcctacctgattcgaggtcaactataaaaagttggggggttttacggcagtggaccgcgccgggctcctgttgcgagtgttttactactgcgcagaggagggccacggcgagaccgccaattgatttgagggacggctgtgctggaaaaccagcctcgccgatccccaacaccaagtccacaggggacttgaggggcgtaatgacgctcgaacaggcatgcccgccagaatactgacgggcgcaatgtgcgttcaaagattcgatgattcactgaattctgcaattcacattacttatcgcatttcgctgcgttcttcatcgatgccagaaccaagagatccgttgttgaaagttttgattcattttttttaaccactcagaagatacttattaaaaaattcagaaggtttgggtccccggcgggcgcgaagtcccgccgaagcaacaattaaaggtataattcacaggggttgggagttggataactcggtaatgatccctccgca金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040经过转接8代后，已表现出产孢量下降、徒长菌丝等现象。始终保持高产孢量、高毒力是决定金龟子绿僵菌菌株应用前景的重要因素。


技术实现要素：

6.草地贪夜蛾作为金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040寄主，菌株可在草地贪夜蛾虫体上不断繁殖。为了保持金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040菌株毒力，本文在活虫复壮法、虫尸复壮法的基础上，尝试以饥饿处理后草地贪夜蛾幼虫为寄主复壮金龟子绿僵菌ng-ma040菌株，分析对产孢量、毒力的影响，以寻找出一种更高效复壮金龟子绿僵菌菌种的方法，为金龟子绿僵菌ng-ma040应用提供支持。
7.本发明提供一种金龟子绿僵菌复壮方法，选取生长状况良好的草地贪夜蛾幼虫，饥饿处理4-7天后挑取活虫，将金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040分生孢子用质量浓度0.01-0.1%吐温-80配成悬浮液，浓度调至1-10
×
108个/ml，将饥饿处理后草地贪夜蛾幼虫在孢子悬浮液中浸10-30s，滤纸吸干表面水分，在培养箱中培养，待出现草地贪夜蛾僵虫后进行孢子分离及纯化。
8.本发明所述的金龟子绿僵菌复壮方法，优选的所述草地贪夜蛾幼虫为3龄幼虫；所述饥饿处理为5天；所述吐温-80的质量浓度为0.05%；所述孢子悬浮液浓度为1.0
×
108个/ml；所述的浸泡时间为20s。
9.优选的培养箱培养条件为：温度为25
±
1℃，湿度为95%。金龟子绿僵菌ng-ma040的保藏号为cgmccno.19273。
10.本发明提供一种金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040悬浮剂，采用饥饿处理后草地贪夜蛾幼虫复壮培养获得的金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040孢子粉，按照质量百分比：金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma0405
×
109孢子/g；el106%；
t-404%；十二烷基苯磺酸钙4%；独脚金内酯0.03%；有机硅消泡剂0.5%；硅酸镁铝0.5%黄原胶0.1%菜籽油余量。
11.相比于现有技术，本发明的有益效果为：相较于活虫复壮法、虫尸复壮法，本发明提供的饥饿虫复壮法能更好恢复的产孢量，降低lc
50
值和lt
50
值，即恢复菌株毒力和侵染力，有效保护金龟子绿僵菌ng-ma040杀虫活性。
具体实施方式
12.一、材料与方法1.材料金龟子绿僵菌ng-ma040（metarhiziumanisopliae）：由本试验室土壤中分离自草地贪夜蛾僵虫，并保存。
13.草地贪夜蛾幼虫：由实验室2019年采集于安徽黄山市种群继代饲养。
14.2.方法2.1活虫复壮法将金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040分生孢子用0.05%吐温-80配成悬浮液，浓度调至1.0
×
108个/ml，将草地贪夜蛾幼虫3龄幼虫在孢子悬浮液中浸20s，滤纸吸干表面水分，放入装有人工饲料的12孔板中，覆上打湿的卷纸，盖上盖子。置于(25
±
1)℃，湿度为95%的培养箱培养。待出现草地贪夜蛾僵虫后进行孢子分离及纯化后，接入pda培养14d后测产孢量等，以未经复壮的菌株为对照。
15.2.2虫尸复壮法将实验室人工饲养的草地贪夜蛾3龄幼虫，-20℃冷冻处理2h，吸干表面水分，分装至试管放入121℃灭菌20min，冷却后待用。将金龟子绿僵菌ng-ma040分生孢子用0.05%吐温-80配成悬浮液，浓度调至1.0
×
108个/ml，吸取200μl加入上述试管中的虫尸上，置于(25
±
1)℃条件培养，待孢子长满整头虫体后，挑取表面的孢子，分离及纯化后，接入pda培养14d后测产孢量等，以未经复壮的菌株为对照。
16.2.3饥饿虫复壮法将实验室人工饲养的草地贪夜蛾3龄幼虫，饥饿处理5天后，挑取活虫待用。将金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040分生孢子用0.05%吐温-80配成悬浮液，浓度调至1.0
×
108个/ml，将饥饿处理后草地贪夜蛾幼虫3龄活虫在孢子悬浮液中浸20s，滤纸吸干表面水分，装入12孔板中，覆上打湿的卷纸，盖上盖子。置于(25
±
1)℃，湿度为95%的培养箱培养。待出现草地贪夜蛾僵虫后进行孢子分离及纯化后，接入pda培养14d后测产孢量等，以未经复壮的菌株为对照。
17.2.4孢子计数及孢子悬浮液配制
将培养后孢子粉从培养基上的玻璃纸上刮下收集，放入到100ml的锥形瓶中，加入含有0.05%吐温-80的无菌水，在磁力搅拌器上搅30min，使孢子充分分散，稀释后血球板计数法确定孢子含量，按浓度要求配成均匀孢子悬浮液。
18.2.5复壮后金龟子绿僵菌ng-ma040菌株lc
50
值测定采用浸虫法。将复壮后的金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040培养后获得的孢子粉用0.05%吐温-80的无菌水溶液等比稀释成试验浓度，依次为109个/毫升，108个/毫升，107个/毫升，106个/毫升，105个/毫升。挑选虫龄大小一致的草地贪夜蛾3龄幼虫，于各系列浓度药液中浸渍20s，以0.05%吐温80水溶液为对照。处理后幼虫用滤纸吸取多余药液，将试虫转移至装有人工饲料12孔板中饲养。以虫子僵化确认为死亡，以7天死虫情况，计算lc
50
值。同时以108个/毫升试验浓度，调查每天死亡情况并记录死虫数，计算lt
50
值。
19.2.6金龟子绿僵菌ng-ma040盆栽试验结果复壮培养获得金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040孢子粉，按照质量百分比：金龟子绿僵菌ng-ma0405
×
109孢子/g；el106%；t-404%；十二烷基苯磺酸钙4%；独脚金内酯0.03%；有机硅消泡剂0.5%；硅酸镁铝0.5%黄原胶0.1%菜籽油余量。
20.制备方法：根据配方，将有效成分增稠剂等固型助剂在油相载体中通过砂磨机研磨，粒径达到2～3微米，按配方加入剩余助剂物质，然后加入金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040孢子粉，调节至要求浓度，充分剪切、搅拌均匀，得成品。
21.经室内盆栽获得的玉米苗，接入草地贪夜蛾3龄幼虫。按照亩用制剂量150克茎叶喷施50亿孢子/毫升金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040可分散油悬浮剂，分别于7、9、14、21天调查防治效果。
22.二、结果与分析1．不同复壮方法处理后金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040对草地贪夜蛾产孢量及毒力影响从表1试验结果可知：采用3种方法复壮金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040，活虫复壮法孢子量可达0.78
×
10
11
个/克、虫尸复壮法孢子量可达0.93
×
10
11
个/克、饥饿虫复壮法孢子量可达1.23
×
10
11
个/克，均高于未复壮菌株孢子量0.68
×
10
11
个/克，其中活虫复壮法、虫尸复壮法、饥饿虫复壮法与未复壮菌株差异显著；饥饿虫复壮法与活虫复壮法、虫尸复壮法差异显著。活虫法复壮法lc
50
值为1.55
×
108个/毫升、虫尸复壮法lc
50
值为1.70
×
108个/毫升、饥饿虫复壮法lc
50
值1.33
×
108个/毫升，均显著低于未复壮菌株lc
50
值1.98
×
108个/毫升；活虫法复壮法lt
50
值为4.88天、虫尸复壮法lt
50
值为6.28天、饥饿虫复壮法lt
50
值4.68天，均显著低于未复壮菌株lt
50
值8.35天。
23.由此可见，3种复壮方法，均可提高金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040的产孢量，降低lc
50
值和lt
50
值，有效恢复菌株毒力。其中饥饿虫复壮法产孢量显著高于活虫复壮法、也高于虫尸复壮法；饥饿虫复壮法lc
50
值均显著低于活虫复壮法、虫尸复壮法；饥饿虫复壮法lt
50
值显著低于虫尸复壮法、也低于活虫复壮法但差异不显著。相较于活虫复壮法、虫尸复壮法，饥饿虫复壮法能更好恢复的产孢量，降低lc
50
值和lt
50
值，即恢复菌株毒力和侵染力，有效保护金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040杀虫活性。
24.表1不同复壮方法处理后金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040对草地贪夜蛾产孢量及毒力结果统计表2．复壮后金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040盆栽试验结果从表6结果可知：3种复壮法处理后获得的孢子粉加工成的50亿孢子/毫升金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040可分散油悬浮剂在盆栽试验中对草地贪夜蛾具有较好的防治效果，均高于未复壮菌株。药后7、9、14、21天，经饥饿虫复壮法防治效果均高于活虫复壮法、虫尸复壮法。由此可知，饥饿虫复壮法更有利于维持金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040孢子对草地贪夜蛾幼虫的防治效果。
25.表6复壮后金龟子绿僵菌ng-ma040防治草地贪夜蛾效果结论：相较于活虫复壮法、虫尸复壮法，饥饿虫复壮法能更好恢复的产孢量，降低lc
50
值和lt
50
值，即恢复菌株毒力和侵染力，有效保护金龟子绿僵菌metarhiziumanisopliaeng-ma040杀虫活性。推测原因可能由于饥饿虫抵抗力下降，但具有与虫尸类似的丰富的营养物质，有利于孢子侵染繁殖；同时与活虫一样，具有了完整的免疫系统，更有利于保持侵染孢子的毒力。相关机理机制研究有待进一步深入。