针对疑难检材的八色系统STR位点复合扩增试剂盒及应用的制作方法

针对疑难检材的八色系统str位点复合扩增试剂盒及应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学领域，涉及采用化学荧光分子标记引物进行基因检测，具体为针对疑难检材的八色系统str位点复合扩增试剂盒及应用。


背景技术：

2.目前，法医实践中常用的案件检验荧光标记str分型试剂盒来源于美国应用生物系统公司(abi)和普洛麦格公司(promega)。abi公司最新推出了verifilerplus pcr扩增试剂盒，该试剂盒是六色荧光系统，包含23个常染色体位点、2个性别位点amelogenin和y-indel，扩增产物大小范围是80bp-430bp。promega公司的案件检验新品是versaplex 27py str试剂盒，该试剂盒也是六色荧光系统，包含23个常染色体位点、1个性别位点amelogenin和3个y-str基因座(dys391、dys576和dys570)，扩增产物大小范围是75bp-480bp。以上两款str试剂盒检测降解检材时，均会出现扩增片段越长扩增结果越差，即一些大片段str基因座分型结果较差的现象。而增加模板量和增加循环次数、扩增次数、减小扩增体系，或采用巢式pcr等提高pcr灵敏度的方法可提高降解检材检验的成功率，但也存在着实验结果重复性差，实验室污染难控制等缺点。
3.随着对检验降解dna检材研究的不断深入，str分型技术有了新的进步，在原来str的基础上，重新设计引物，使前后引物尽可能接近或达到核心重复序列处，减少扩增片段大小，即mini-str技术。abi和promega公司曾分别推出minifiler和s5 system两款试剂盒，但它们均存在很大的局限性，位点少且与其他商品化试剂盒联合应用的互补性和通用性较差。国内基于六色荧光系统，无锡中德美联公司也推出了包含16个位点的mini-str产品，虽然个体识别效能达到了identifiler同等水平，但受限于遗传分析仪的荧光通道数，该试剂盒仍然满足不了客户对于更多位点和更高识别能力的要求。


技术实现要素：

4.解决的技术问题：为了克服现有技术的不足，结合最新型的八色荧光染料标记体系，并采用迷你str的概念来设计引物，开发一种包含26个位点、针对来源于案件现场的微量、降解、含有高抑制剂等疑难检材的八色荧光标记迷你型str引物组、及其试剂盒和应用，且同时具有高效、快速、高灵敏度和强抗抑制能力的优点。
5.本发明试剂盒包含了公安部推荐的20个核心和4个优选基因座的全部信息，以及辅助性别判断的y染色体基因座dys391和yindel。较市场上现有案件试剂盒，本发明所述试剂盒针对疑难检材、降解检材的检出率更高，能够获得更多的基因座信息，极大地提高了疑难检材利用率。鉴于此，本发明提供了针对疑难检材的八色系统str位点复合扩增试剂盒及应用。
6.技术方案：针对疑难检材的八色系统str位点复合扩增试剂盒，所述试剂盒包括26个str基因座的特异性扩增引物，其中str基因座为：csf1po、fga、th01、tpox、vwa、d3s1358、d5s818、d7s820、d8s1179、d13s317、d16s539、d18s51、d21s11、penta d、penta e、d6s1043、
amelogenin、d2s1338、d12s391、d19s433、d1s1656、d2s441、d22s1045、d10s1248，及两个性别辅助位点dys391和yindel。
7.优选的，所述26个基因座的特异性扩增引物序列如下：csf1po、seq id no.1～2；fga、seq id no.3～4；th01、seq id no.5～6；tpox、seq id no.7～8；vwa、seq id no.9～10；d3s1358、seq id no.11～12；d5s818、seq id no.13～14；d7s820、seq id no.15～16；d8s1179、seq id no.17～18；d13s317、seq id no.19～20；d16s539、seq id no.21～22；d18s51、seq id no.23～24；d21s11、seq id no.25～26；penta d、seq id no.27～28；penta e、seq id no.29～30；d6s1043、seq id no.31～32；amelogenin、seq id no.33～34；d2s1338、seq id no.35～36；d12s391、seq id no.37～38；d19s433、seq id no.39～40；d1s1656、seq id no.41～42；d2s441、seq id no.43～44；d22s1045、seq id no.45～46；d10s1248、seq id no.47～48；dys391、seq id no.49～50；yindel、seq id no.51～52。
8.优选的，所述26个基因座的特异性扩增引物的浓度如下：seq id no.1～2、0.15μm；seq id no.3～4、0.17μm；seq id no.5～6、0.12μm；seq id no.7～8、0.13μm；seq id no.9～10、0.12μm；seq id no.11～12、0.14μm；seq id no.13～14、0.12μm；seq id no.15～16、0.13μm；seq id no.17～18、0.15μm；seq id no.19～20、0.14μm；seq id no.21～22、0.17μm；seq id no.23～24、0.12μm；seq id no.25～26、0.12μm；seq id no.27～28、0.17μm；seq id no.29～30、0.16μm；seq id no.31～32、0.17μm；seq id no.33～34、0.12μm；seq id no.35～36、0.11μm；seq id no.37～38、0.10μm；seq id no.39～40、0.08μm；seq id no.41～42、0.14μm；seq id no.43～44、0.17μm；seq id no.45～46、0.15μm；seq id no.47～48、0.14μm；seq id no.49～50、0.12μm；seq id no.51～52、0.14μm。
9.所述试剂盒中的引物及其序列和浓度如下表所示：
10.11.[0012][0013]
优选的，所述26个基因座的特异性扩增引物分为7组；具体为：d3s1358、d1s1656、d8s1179、d21s11为一组；d2s441、d13s317、d16s539、csf1po、d10s1248为一组；amelogenin、yindel、d5s818、th01、d6s1043为一组；d22s1045、d19s433、d7s820、tpox为一组；dys391、vwa、d2s1338、d12s391为一组；fga、d18s51为一组；penta d、penta e为一组。
[0014]
优选的，采用荧光染料标记7组特异性扩增引物，且对每对引物中至少一条引物的5’端进行标记；其中荧光染料为af475、fam、tet、af555、af575、af01或af10，且每组采用的荧光标记不同。
[0015]
优选的，26个str基因座的特异性扩增引物的pcr扩增产物长度均小于300bp。
[0016]
优选的，所述试剂盒包括pcr缓冲液unique mix，2ml；sdh2o，1.95ml；pcr增强剂；其中，pcr缓冲液unique mix成分为：热启动u-taq酶0.2u/μl～0.4u/μl，ph8.25～8.3的tris-hcl 50mm～125mm,dntps 5.0mm～7.5mm,kcl 50mm～125mm，bsa 2mg/ml～5mg/ml；pcr增强剂为聚乙二醇、triton x-100、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)和二硫苏糖醇中的至少一种。
[0017]
优选的，所述试剂盒包括分子内标，具体为：分子内标由14片段组成，大小分别为75bp、100bp、139bp、150bp、160bp、200bp、250bp、300bp、340bp、350bp、400bp、450bp、490bp、500bp；分子内标采用橙色荧光af633标记。
[0018]
以上任一所述针对疑难检材的八色系统str位点复合扩增试剂盒在检测常量检材如血液、精斑，及微量、高度降解、高抑制剂含量的样本如野外环境复杂环境采集的样本、擦拭样本、脱落细胞、指甲等样本中的应用。
[0019]
优选的，所述试剂盒能够对低至30pg dna含量的样本进行完整分型。
[0020]
有益效果：
[0021]
1、本发明建立的八色str荧光检测系统，较市面上常见的六色荧光检测系统荧光通道增加2道，因此在同一个试剂盒内可以排布更小更多的str位点；
[0022]
2、本发明所述的基于八色str荧光检测系统的迷你型str复合扩增试剂盒可同时扩增26个基因座，其中涵盖了公安部建议的全部20个核心基因座，此外还包括了针对中国人群遗传多态性高的4个优选基因座，多态性好，个体识别率高；
[0023]
3、本发明针对微量、降解、含高抑制剂等案件现场疑难检材的检测，不仅扩增时间短，效率高，在灵敏度和抗抑制剂能力方面的表现也很突出，如在29个循环扩增后，本发明可获得30pg标准dna模板的完整分型。此灵敏度高于abi公司的现场常染色体str试剂盒verifilerplus灵敏度50pg，更高于我国行标ga/t 815-2009所制定的125pg的灵敏度要求。
[0024]
4、本发明建立的26个基因座的迷你型str扩增体系，扩增位点多，扩增片段短，最大不超过300bp，适用常量检材如血液、精斑，及微量、高度降解、高抑制剂含量的样本如野外复杂环境采集的样本、擦拭样本、脱落细胞、指甲等样本中生物检材的str分型。
[0025]
5、本发明所述的体系，较abi公司的现场常染色体str试剂盒verifilerplus引入dys391基因座，与yindel位点搭配，更能够对性别基因amelogenin起到辅助判定的作用。
[0026]
6、本发明所述试剂盒整个pcr过程不超过60分钟，检测更快速，可有效的协助刑侦人员短时间内准确获得疑难样本分型。
附图说明
[0027]
图1是本发明所述试剂盒扩增30pg 9948标准品结果图；
[0028]
图2是本发明所述试剂盒扩增0.5ng 9948标准品结果图；
[0029]
图3是本发明所述试剂盒扩增某鼠标擦拭检材结果图；
[0030]
图4是本发明所述试剂盒扩增某陈旧检材结果图。
具体实施方式
[0031]
以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0032]
实施例1
[0033]
30pg和0.5ng标准品9948，使用本发明试剂盒进行检测。
[0034]
本发明所述的试剂盒由如下组成：引物混合物，1ml；pcr缓冲液unique mix，2ml；sdh2o，1.95ml；pcr增强剂。
[0035]
所述pcr缓冲液unique mix成分为：热启动taq酶0.2u/μl～0.5u/μl，ph8.25～8.4的tris-hcl 50mm～125mm,dntps 5.0mm～7.5mm,kcl 50mm～125mm，bsa 2mg/ml～5mg/ml。
[0036]
pcr增强剂可选的种类为：聚乙二醇、triton x-100、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)或二硫苏糖醇，选择其中的一种或两种直接加入到pcr缓冲液unique mix中。
[0037]
1、操作步骤如下：
[0038]
1.1扩增体系
[0039]
组份体积unique mix10.0μl30pg/0.5ng 99481μl引物组5.0μlsdh2o补足至25μl
[0040]
1.2扩增程序为：
[0041][0042]
1.3、扩增产物在溯远基因honer 1816型基因测序仪上进行荧光检测
[0043]
将扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μl扩增产物或allelic ladder与0.5μl agcu marker siz-500和12μl去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟后冰浴，通过毛细管电泳检测；用遗传分析仪检测分析。
[0044]
2、结论
[0045]
用配套的片段分析软件genemapper id-x分析步骤中遗传分析仪检测收集的数据，将样品分析数据和等位基因分型标准物的分型结果进行比较，得到实际样品的分型数据。对标准品30pg和0.5ng 9948(promega公司美国)进行扩增，30pg标准品9948扩增图谱见图1，0.5ng标准品9948图谱见图2。从图中可以看出，对标准品9948的检测结果与其基因型一致，3500电泳可检出全部基因座分型，该发明涉及的试剂盒可对标准品准确分型，30pg标准品可获得完整分型。
[0046]
实施例2
[0047]
实际案件中的检材唾液斑、鼠标擦拭检材、陈旧降解检材等样本共24份，使用本发明试剂盒进行检测。
[0048]
本发明所述的试剂盒由如下组成：引物混合物，1ml；pcr缓冲液unique mix，2ml；sdh2o，1.95ml；pcr增强剂。
[0049]
所述pcr缓冲液unique mix成分为：热启动taq酶0.2u/μl～0.5u/μl，ph8.25～8.4的tris-hcl 50mm～125mm,dntps 5.0mm～7.5mm,kcl 50mm～125mm，bsa 2mg/ml～5mg/ml。
[0050]
pcr增强剂可选的种类为：聚乙二醇、triton x-100、聚乙烯吡咯烷酮(pvp)或二硫苏糖醇，选择其中的一种或两种直接加入到pcr缓冲液unique mix中。
[0051]
1、样本准备：采用磁珠法提取，具体方法参考《ga/t 383-2002法庭科学dna实验室检验规范》。
[0052]
2、操作步骤如下：
[0053]
2.1扩增体系
[0054]
组份体积unique mix10.0μl提取样本6μl引物组5.0μl
sdh2o补足至25μl
[0055]
2.2扩增程序为：
[0056]
本发明试剂盒
[0057][0058]
2.3、扩增产物在溯远基因honer 1816型基因测序仪上进行荧光检测
[0059]
将扩增产物3000rpm离心5分钟，取1μl扩增产物或allelic ladder与0.5μl agcu marker siz-500和12μl去离子甲酰胺混合，95℃变性3分钟后冰浴，通过毛细管电泳检测；用遗传分析仪检测分析。
[0060]
3、结论
[0061]
使用溯远基因honer 1816型基因测序仪配套的片段分析软件genemapper id-x，对样本数据和等位基因分型标准物的分型结果进行比较。共检测唾液、鼠标擦拭检材、陈旧降解检材等样本共24份。本发明所述试剂盒整体检出率为42.9％，唾液检材检出率最高，鼠标擦拭检材检出率次之，陈旧降解检材检出率最低，这与擦拭检材dna量较低、陈旧检材dna降解较多而导致检出率降低的预期相一致。以某鼠标擦拭检材扩增结果作为示例(图3)，以某陈旧降解检材扩增结果作为示例(图4)。样本dna浓度及检出情况见下表。
[0062]