技术特征：
1.一种装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞，其特征在于：以巨噬细胞装载减毒沙门氏菌，所述的巨噬细胞为巨噬细胞系raw264.7或腹腔及血液来源的原代巨噬细胞，所述的减毒沙门氏菌为减毒鼠伤寒沙门氏菌vnp20009及其衍生或基因改造菌株，菌株为不携带或携带表达治疗基因、示踪基因外源基因的表达质粒。2.根据权利要求1所述的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞，其特征在于：所述的治疗基因为能够在减毒沙门氏菌表达的、具有治疗作用的蛋白质的编码基因，包括细胞凋亡类抗肿瘤基因、血管生成抑制剂基因或免疫检查点阻断剂抗体基因，所述的示踪基因为能够在减毒沙门氏菌表达荧光蛋白rfp或荧光素酶示踪蛋白luxcdabe的基因，包括来源于绿色荧光蛋白gfp或红色荧光蛋白rfp及其衍生荧光蛋白的基因，所述的荧光素酶蛋白基因luxcdabe的序列为seq id no.4所示的核苷酸序列；所述的荧光蛋白rfp的序列为seq id no.5所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞，其特征在于：所述的表达质粒上有在减毒沙门氏菌中常用的启动子，包括j23100组成型启动子、nirb启动子、adhe启动子或扩增sifb启动子环境影响的启动子；质粒上含有防质粒丢失元件at；所述的扩增防质粒丢失元件at的序列为seq id no.1所示的核苷酸序列；所述的扩增sifb启动子psifb的序列为seq id no.2所示的核苷酸序列；所述的j23100组成型启动子的序列为seq id no.3所示的核苷酸序列；所述的psifb 上游引物的序列为seq id no.6所示的核苷酸序列；所述的psifb下游引物的序列为seq id no.7所示的核苷酸序列。4.权利要求1所述的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的制备方法，其特征在于：将经25-500 ng/ml lps诱导处理4-48小时的raw264.7巨噬细胞系，或通过5%淀粉肉汤腹腔注射刺激2-4天联合贴壁培养法纯化获得的原代单核细胞或巨噬细胞分别与减毒沙门氏菌以1:5-1:100比例分别共培养30-150分钟，然后用 50-100
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g/ml 庆大霉素处理细胞 30-60分钟以杀死细胞外细菌；使用稀释涂板计算巨噬细胞吞噬后活vnp的数量，以记录不同处理条件下胞内的有效装载菌株数目与细胞活性，并用于最终共培养时间的确定以及后续细胞实际给药剂量的计算。5.权利要求1所述的单核细胞或巨噬细胞的细菌装载效率和组织分布水平的评价和示踪方法，其特征在于包括如下步骤：单核细胞或巨噬细胞中装载能够表达或定量检测的荧光蛋白或荧光素酶示踪蛋白，包括可稳定组成型表达红色荧光rfp的vnp20009菌vnp-rfp或表达荧光素酶luxcdabe的vnp20009菌vnp-luxcdabe，评价和示踪装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的细菌装载效率和组织分布及水平；所述的示踪基因为能够在减毒沙门氏菌表达荧光蛋白rfp或荧光素酶示踪蛋白luxcdabe的基因，包括但不限于来源于绿色荧光蛋白gfp或红色荧光蛋白rfp及其衍生荧光蛋白的基因。6.根据权利要求5所述的单核细胞或巨噬细胞的细菌装载效率和组织分布水平的评价和示踪方法，其特征在于：用包括dir近红外染料在内的常用光学染料标记单核细胞或巨噬细胞，定量检测光学染料，评价和示踪装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞的组织分布及水平。7.根据权利要求6所述的单核细胞或巨噬细胞的细菌装载效率和组织分布水平的评价和示踪方法，其特征在于：未经处理的m0型巨噬细胞raw264.7，以25-500 ng/ml lps诱导4-48小时后，raw264.7转变为m1型巨噬细胞；或通过5%淀粉肉汤腹腔注射刺激2-4天联合贴壁
培养法纯化获得的原代单核细胞或巨噬细胞；将经lps诱导处理的raw264.7或原代单核细胞或巨噬细胞与表达示踪蛋白或治疗蛋白的减毒沙门氏菌以1:5-1:100比例分别共培养30-150分钟，借助50-100
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g/ml庆大霉素处理细胞30-60 分钟以杀死胞外游离或粘附的减毒沙门氏菌后，荧光定量检测raw264.7吞噬表达示踪蛋白或治疗蛋白的减毒沙门氏菌的数量与共培养时间的相关性；通过梯度稀释法，获得表达示踪蛋白或转载自治疗蛋白的减毒沙门氏菌数量与对应荧光强度间的线性关系，用来有效间接计算巨噬细胞胞内的表达示踪蛋白或转载自治疗蛋白的减毒沙门氏菌数目；酶标仪检测示踪蛋白荧光强度，结合细菌数目-荧光线性关系算得平均每100个巨噬细胞所装载的总细菌数。8.根据权利要求7所述的单核细胞或巨噬细胞的细菌装载效率和组织分布水平的评价和示踪方法，其特征在于：将装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞转至pbs配置的0.3% tritonx-100中静置10-15 min，以穿孔巨噬细胞而释放出胞内的减毒沙门氏菌；梯度稀释后涂带有卡纳霉素抗性的lb平板，分析检测单核细胞或巨噬细胞装载的活减毒沙门氏菌数及其装载效率与共培养时间的相关性；利用台酚蓝分析检测巨噬细胞与减毒沙门氏菌共培养30、60、90、120、150分钟后，细胞的活性状态；为了进一步验证巨噬细胞有效装载了减毒沙门氏菌，在获得装载有减毒沙门氏菌的巨噬细胞后，使用4%多聚甲醛对细胞进行固定，室温，避光，静置30 min，pbs清洗23次，借助鬼笔环肽与dapi按照厂商说明书分别对巨噬细胞骨架与细胞核染色，室温，避光，静置30 min，pbs清洗23次，使用正置荧光显微镜观察并拍摄。9.权利要求1至8任一项所述的装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述应用包括装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞单独用于制备抗肿瘤药物，或与现有的抗肿瘤药物组成组合物，或与现有化学药物治疗、中药治疗、生物治疗、物理治疗方法在抗肿瘤治疗中联合运用；提高减毒沙门氏菌在肿瘤内的滴度，并通过巨噬细胞与溶瘤菌的联用，降低溶瘤菌治疗的副作用，提高肿瘤抑制效果。
技术总结
本发明公开了一种装载减毒沙门氏菌的单核细胞或巨噬细胞及其制备方法和应用。具体地，通过将工程改造的减毒沙门氏菌装载于单核细胞或巨噬细胞中，装载的细胞被招募至肿瘤微环境，有效避免了细菌脱靶至正常脏器中。细胞的包裹伪装也有效避免了细菌的过早暴露。其通过直接杀死肿瘤细胞或释放胞内工程菌以激活/调节免疫系统间接抑制肿瘤，而充当有效的免疫效应物。效应物。效应物。
技术研发人员：华子春 吴乐阳 李霖
受保护的技术使用者：江苏靶标生物医药研究所有限公司
技术研发日：2022.03.18
技术公布日：2022/7/12