一种水稻柱头外露率主效QTL、检测引物、试剂盒和应用的制作方法

一种水稻柱头外露率主效qtl、检测引物、试剂盒和应用
技术领域
1.本发明涉及分子生物学技术领域，具体涉及一种水稻柱头外露率主效qtl、检测引物、试剂盒和应用。


背景技术：

2.水稻作为最重要的粮食作物之一，养活了全球一半以上的人口，水稻产量的丰欠将直接影响到粮食安全和社会稳定，提高单位面积的粮食产量一直是育种者最重要的目标。杂交水稻的商业化推广极大地促进了粮食产量的增加，其种子生产能力的提高发挥了重要的作用。不育系的异交性能是影响杂交水稻制种产量的关键因素，而柱头外露率则是提高不育系异交性能最为重要的性状。
3.水稻柱头外露率是多基因控制的数量性状，各世代均呈连续性变异。针对柱头外露率性状，研究人员利用不同的分离群体，基于连锁分析，进行了大量的qtl定位工作。此外，还有学者利用bsa法和关联分析对柱头外露率进行qtl定位。随着水稻基因组测序的完成以及二代测序技术的日趋成熟，qtl-seq法应运而生，相较于传统的图位克隆方法构建群体耗时，缺少足够的分子标记，qtl-seq法基于第二代测序产生的高密度遗传图谱，ngs结合bsa更快捷、效率更高、成本更低。研究报道定位的qtls数目很多，分布在水稻的12条染色体上，但是单个qtl解释的表型变异多在10％以内，表明柱头外露率是一个受多个微效qtl影响的典型的数量性状。利用分子标记辅助选择改良水稻柱头外露率性状是一个有效的手段。所以，挖掘稳定的、可靠的控制柱头外露率的qtl，对提高柱头外露率的改良效率起到重要作用，有利于杂交制种产量提高和成本降低，促进杂交水稻的商业化推广应用。


技术实现要素：

4.本发明的目的在于提供一种水稻柱头外露率主效qtl、检测引物、试剂盒和应用。本发明所述主效qtl能够控制水稻柱头外露率，将所述主效qtl导入水稻优良不育系中，能够提高水稻不育系的柱头外露率，提高制繁种产量，加快育种进程。
5.本发明提供了一种水稻柱头外露率主效qtl，所述主效qtl被定位在第9染色体上，位于连锁标记rm23662和rm3700之间。
6.本发明还提供了一组检测水稻柱头外露率主效qtl的引物，所述引物包括rm23662的引物和rm3700的引物；所述rm23662的引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示；所述rm3700的引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
7.本发明还提供了一种检测水稻柱头外露率主效qtl的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物和反应液。
8.本发明还提供了检测上述技术方案所述主效qtl的物质在培育或检测高柱头外露率的水稻品种中的应用。
9.本发明提供了一种水稻柱头外露率主效qtl。本发明利用沪旱1b和p3155b(沪旱1b/k17b//沪旱1b///沪旱1b)构建的f2群体，采用qtl-seq和ssr标记两种分析方法，在第9
染色体上重复鉴定到一个稳定影响柱头外露率的主效qtl位点，为进一步精细定位和候选基因克隆提供了可靠依据。利用qtl定位检测到的主效qtl的连锁分子标记，可以通过分子标记辅助选择将该主效qtl导入水稻优良不育系中，提高水稻不育系的柱头外露率，提高制繁种产量，加快育种进程。
附图说明
10.图1为本发明提供的
△
snp-index在全基因组上的分布结果图；其中，横坐标代表在染色体的物理位置；纵坐标代表δ(snp_index)值；黑色曲线表示δ(snp_index)的拟合值；玫红色线和蓝色线表示loess拟合值为99％的阈值线；
11.图2为本发明提供的第9染色体qtl定位示意图；
12.图3为本发明提供的沪旱1b/p3155b f2群体总柱头外露率频率分布图。
具体实施方式
13.本发明提供了一种水稻柱头外露率主效qtl，所述主效qtl被定位在第9染色体上，位于连锁标记rm23662和rm3700之间。在本发明中，rm23662的引物的核苷酸序列如seq id no.1(gagaggacgatggcactattgg)和seq id no.2(cgaggaacttgattcgcatgg)所示；所述rm3700的引物的核苷酸序列如seq id no.3(aaatgccccatgcacaac)和seq id no.4(ttgtcagattgtcaccaggg)所示。
14.本发明所述主效qtl的定位方法，包括以下步骤：
15.以沪旱1b为母本，柱头外露率高的三系保持系k17b为父本进行杂交，经过三次回交选育，得到保持系p3155b；所述保持系p3155b与沪旱1b相比，柱头外露率得到显著改良，农艺性状相似；
16.利用沪旱1b与保持系p3155b杂交构建f2群体，包含673个体；
17.调查f2群体的总柱头外露率表型数据，选择35个低柱头外露率个体构建low-pool，平均值为32.9％；选择35个高柱头外露率个体构建high-pool，平均值为78.3％；分别进行高通量测序，通过对比两个混池的snp-index进行qtl-seq分析；然后利用亲本沪旱1b和保持系p3155b之间多态性标记构建遗传连锁图谱，结合表型数据进行qtl分析，最终在第9染色体上定位一个主效qtl，即上述技术方案所述的水稻柱头外露率主效qtl。
18.本发明还提供了一组检测水稻柱头外露率主效qtl的引物，所述引物包括rm23662的引物和rm3700的引物；所述rm23662的引物的核苷酸序列如seq id no.1和seq id no.2所示；所述rm3700的引物的核苷酸序列如seq id no.3和seq id no.4所示。
19.本发明还提供了一种检测水稻柱头外露率主效qtl的试剂盒，所述试剂盒包括上述技术方案所述引物和反应液。
20.本发明还提供了检测上述技术方案所述主效qtl的物质在培育或检测高柱头外露率的水稻品种中的应用。通过分子标记辅助选择将所述主效qtl导入水稻优良不育系中，可以提高水稻不育系的柱头外露率，提高制繁种产量，加快育种进程。
21.下面结合具体实施例对本发明所述的一种水稻柱头外露率主效qtl、检测引物、试剂盒和应用做进一步详细的介绍，本发明的技术方案包括但不限于以下实施例。
22.实施例1
23.1.f2群体构建及柱头外露率表现
24.p3155b是以沪旱1b为母本，柱头外露率高的三系保持系k17b为父本进行杂交，经过三次回交选育出来的保持系，与沪旱1b相比，柱头外露率得到显著改良，农艺性状相似。用沪旱1b与p3155b杂交构建f2群体，包含673个体。沪旱1b和p3155b两亲本及其f2群体的柱头外露率表型数据见表1和图3(沪旱1b/p3155b f2群体总柱头外露率频率分布图)。从表1中可以看到两亲本的柱头外露率表型存在较大差异，f2群体的柱头外露率表型呈正态分布。
25.表1沪旱1b/p3155b f2群体及亲本柱头外露率表现
[0026][0027]
2.qtl-seq分析
[0028]
根据673个f2分离群体的柱头外露率表型，选择35个低柱头外露率个体构建low-pool，平均值为32.9％；35个高柱头外露率个体构建high-pool，平均值为78.3％。测序数据去除由于pcr引起的重复reads对、去除接头、去除低质量，以得到优质序列。结果显示high-pool获得167,151,875个短序列，比对到日本晴参考基因组上，覆盖整个基因组的93.52％，平均覆盖深度为44
×
，得到2,437,972个snps；low-pool获得162,898,799个短序列，覆盖整个基因组的93.54％，平均覆盖深度为45
×
，得到2,428,627个snps(表2)。
[0029]
表2测序数据统计
[0030][0031]
通过对比两个混池的snp位点的测序深度相关的一个参数(snp-index)来进行qtl分析。snp-index是一种通过混池间的基因型频率差异进行标记关联分析的方法，主要是寻找混池之间基因型频率的显著差异，用δ(snp_index)统计。标记snp与性状关联度越强，δ(snp_index)越接近于1。
[0032]
候选区间是δsnp_index在95％置信水平下超过阈值的滑动窗口。共检测到7个候选区间(图1，表3)，其中第8染色体上有2个，第9染色体上有5个。
[0033]
表3沪旱1b/p3155b f2群体qtl-seq分析
[0034][0035]
3.ssr标记分析
[0036]
用940对均匀分布水稻染色体的ssr标记对轮回亲本沪旱1b和供体亲本k17b进行多态性分析，发现92个标记在亲本间具有明显多态性，多态性比例为9.79％，利用获得的92个多态性标记对株系p3155b进行遗传背景分析，结果发现83个标记恢复到沪旱1b的基因型，仍有9个位点存在多态性差异，背景回复率为90％。利用这9个ssr标记对群体进行分子定位，单标记分析结果显示位于第9染色体的rm5688与总柱头外露率呈显著连锁关系(表4)。
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表4沪旱1b/p3155b f2群体单标记分析
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单标记分析和qtl-seq分析均在第9染色体上检测到显著相关区间，所以在第9染色体上继续筛选沪旱1b与3155b之间的多态性标记，共得到8个标记，利用这8个标记结合群体总柱头外露率表型进行qtl分析，定位到一个控制总柱头外露率的主效qtl，lod值为12.65，贡献率为11.58％(表5)，lod峰值与重测序定位区间位置相近(图2，第9染色体qtl定位示意图)。
[0041]
表5沪旱1b/p3155b f2群体第9染色体qtl定位
[0042][0043]
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。