一种新型冠状病毒肺炎疫苗的构建与应用的制作方法

1.本发明涉及疫苗技术领域，具体涉及一种新型冠状病毒肺炎疫苗的构建与应用。


背景技术：

2.新型冠状病毒肺炎以发热、干咳、乏力等为主要表现，少数患者伴有鼻塞、流涕、腹泻等上呼吸道和消化道症状。重症病例多在1周后出现呼吸困难，严重者快速进展为急性呼吸窘迫综合征、脓毒症休克、难以纠正的代谢性酸中毒和出凝血功能障碍及多器官功能衰竭等。而轻型患者仅表现为低热、轻微乏力等，无肺炎表现。新型冠状病毒具有较强的传染性，其传播途径主要为直接传播、气溶胶传播和接触传播。其中，直接传播是指患者喷嚏、咳嗽、说话的飞沫，呼出的气体近距离直接吸入导致的感染；气溶胶传播是指飞沫混合在空气中，形成气溶胶，吸入后导致感染；接触传播是指飞沫沉积在物品表面，接触污染手后，再接触口腔、鼻腔、眼睛等粘膜，导致感染。
3.目前，新型冠状病毒肺炎治疗药物相继上市，例如辉瑞公司生产的小分子药物paxlovid，其主要由两种抗病毒药物奈玛特韦片和利托那韦片组成，可用于新冠轻症至中症的治疗。此外，新冠单克隆中和抗体安巴韦单抗/罗米司韦单抗联合疗法、阿斯利康长效抗体(laab)组合evusheld(tixagevimab与cilgavimab的组合)也在进一步研究中。研制有效的预防性和/或治疗性疫苗是除了物理隔离以外预防和/或治疗新型冠状病毒肺炎的有效手段。以sars-cov-2病毒表面蛋白spike(刺突蛋白)即s蛋白为抗原的疫苗，包括核酸疫苗，亚单位疫苗和病毒载体疫苗，其s蛋白的表达水平、蛋白结构决定了疫苗的有效性。如专利cn111218459b公开了一种以人5型复制缺陷腺病毒为载体的新型冠状病毒疫苗，可在短时间内诱导机体产生细胞及体液免疫反应，具有良好的免疫保护效果。该专利中的新冠疫苗为病毒载体疫苗。专利cn111778264a则公开了一种基于新型腺病毒载体sad23l和/或ad49l的新型冠状病毒肺炎covid-19疫苗，能够在动物体内诱导产生高水平的体液和细胞免疫，在动物免疫之后没有发现副作用的出现。
4.目前，新型冠状病毒疫苗种类较少，且新冠病毒变异能力强，变异株较多，因此，亟需提供一种针对多种变异株均有高效价的新型冠状病毒肺炎疫苗。


技术实现要素：

5.针对上述不足，本发明提供了一种新型冠状病毒肺炎疫苗及其应用。本发明所述的新型冠状病毒肺炎疫苗包含sars-cov-2冠状病毒的s蛋白基因密码子优化序列，将该序列导入复制缺陷型5型腺病毒载体，制备得到相应的疫苗。本发明所述的疫苗对新型冠状病毒野生型、南非突变株及印度突变株均能产生高效价保护作用，覆盖面广，且起效快。
6.为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
7.一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒肺炎疫苗的构建核苷酸，所述的构建核苷酸序列包括分泌肽编码核苷酸序列和sars-cov-2s蛋白结构域(11-685位氨基酸)的突变体编码核苷酸序列。
8.具体地，所述的分泌肽编码核苷酸序列为seq id no:4所示的核苷酸序列。
9.具体地，所述的sars-cov-2s蛋白结构域的突变体编码核苷酸序列为seq id no:3所示的核苷酸序列。
10.具体地，所述的构建核苷酸序列为seq id no:5所示的核苷酸序列。
11.另一方面，本发明提供了一种载体，所述的载体包含上述核苷酸序列。
12.具体地，所述的载体包括但不限于质粒、病毒、噬菌体、rna。
13.进一步具体地，所述的载体为病毒载体，优选为复制缺陷型腺病毒载体。
14.进一步具体地，所述的复制缺陷型腺病毒为e1和/或e3区完全缺失和/或部分缺失的c亚类的5型腺病毒。
15.进一步具体地，所述的复制缺陷型腺病毒内装cmv启动子和bgh基因polya序列。
16.又一方面，本发明提供了上述核苷酸或载体在制备新型冠状病毒肺炎疫苗中的应用。
17.又一方面，本发明提供了一种新型冠状病毒肺炎疫苗，所述的疫苗包含上述核苷酸或载体。
18.所述的疫苗还包括包括药学上可接受的运载体、赋形剂和/或佐剂。
19.又一方面，本发明提供了上述核苷酸、载体或新型冠状病毒肺炎疫苗在制备预防和/或治疗sars-cov-2病毒相关疾病的药物中的应用。
20.与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
21.本发明所述的新型冠状病毒肺炎疫苗包含sars-cov-2冠状病毒的s蛋白基因密码子优化序列，将该序列导入复制缺陷型5型腺病毒载体，制备得到相应的疫苗。本发明所述的疫苗对新型冠状病毒野生型、南非突变株及印度突变株均能产生高效价保护作用，覆盖面广，且起效快。
附图说明
22.图1为体外表达检测结果图。
23.图2为针对野生型新冠病毒的血清效价检测结果图。
24.图3为针对印度delta突变株的血清效价检测结果图。
具体实施方式
25.下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
26.实施例中未注明具体技术或条件者，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件(如参考j.萨姆布鲁克等著，黄培堂等译的《分子克隆实验指南》，第三版，科学出版社)或者按照产品说明书进行。
27.1.除非特别指明，本文中的“sars-cov-2”均指“新型冠状病毒”。
28.2.除非特别指明，本文中的“s蛋白”均指“sars-cov-2病毒表面蛋白spike(刺突蛋白)”。
29.3.实验所用试剂或材料
30.(1)pshuttle载体与病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre购自microbixbiosystems，货号为pd-01-64。
31.(2)293细胞购自atcc，货号为crl-1573。
32.(3)balb/c小鼠购自广东省实验动物中心。
33.实施例1：sars-cov-2病毒s蛋白编码核苷酸序列优化及腺病毒载体构建
34.1.编码sars-cov-2病毒s蛋白结构域11-685位氨基酸序列的野生型核苷酸序列如seq id no:1所示(从https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/mt108784.1可以获得)，其中，将该蛋白结构域462位氨基酸由亮氨酸突变为精氨酸，494位氨基酸由谷氨酸突变为谷氨酰胺。突变后的蛋白结构域编码核苷酸序列如seq id no:2所示，同时对该突变序列的编码核苷酸序列进行优化，优化后的核苷酸序列如seq id no:3所示。针对野生型、突变型及突变型优化后的编码核苷酸序列分别进行全基因合成，同时在上述野生型、突变型及突变型优化后的核苷酸序列前添加分泌肽的编码序列，所述的分泌肽的编码序列如seq id no:4所示。
35.2.构建重组质粒：
36.将上述合成的核苷酸序列，分别经smai与hindiii酶切、t4连接酶连接、转化构建至pshuttle质粒载体，并经pcr扩增、测序确认重组质粒构建成功。
37.实施例2：疫苗构建
38.将实施例1构建成功的重组质粒，与病毒骨架质粒pbhglox(delta)e1,3cre共同转染至293细胞中以包装重组腺病毒。病毒的收集采用挑空斑的方式：在培养液中加入低溶点琼脂糖，转染后一般在第10-21d可以在显微镜下看到小的空斑。空斑形成后将空斑与琼脂糖一起挑起，放入1ml新鲜培养基中过夜。通常挑取3-6个空斑不等，然后比较滴度，使用滴度最高的一个空斑进行后续实验。将收集的病毒加入新鲜293细胞培养液中进行病毒少量扩增，至细胞再次出现空斑，收集细胞及上清，反复冻融三次收集病毒。以此病毒为p1代病毒，以p1代病毒感染293细胞，连续进行三代感染，至p4代进行病毒的大量扩增，待空斑形成后收集病毒并对病毒进行体外纯化和浓缩。纯化后获得的病毒即为新型冠状病毒sars-cov-2疫苗。sars-cov-2疫苗包含本发明sars-cov-2病毒s蛋白或其突变体的编码核苷酸，和缺陷型腺病毒。缺陷型腺病毒为e1及e3区完全缺失的c亚类的5型腺病毒，不能在普通的人体细胞内复制。其中，采用野生型sars-cov-2病毒s蛋白编码核苷酸(seq id no:1)制备的重组腺病毒命名为ad/s1疫苗，采用突变型sars-cov-2病毒s蛋白编码核苷酸(seq id no:2)制备的重组腺病毒命名为ad/s1-m3疫苗，采用突变型sars-cov-2病毒s蛋白优化后的编码核苷酸(seq id no:3)制备的重组腺病毒命名为ad/s1-m2疫苗，经测序验证均制备成功。
39.实验例1：体外表达验证
40.取a549细胞，以2
×
105个细胞量接种到12孔板中，37℃5％co2培养24h后，每孔以moi50接种实施例2制备得到的ad/s1疫苗、ad/s1-m3疫苗和ad/s1-m2疫苗的病毒，37℃5％co2培养48h，收集细胞上清，提取蛋白，进行western bloting检测s蛋白的表达。检测结果如图1所示。
41.由图1可知，ad/s1疫苗、ad/s1-m3疫苗和ad/s1-m2疫苗均可成功表达。
42.实验例2：疫苗效价检测
43.将实施例2制备得到的ad/s1疫苗、ad/s1-m3疫苗和ad/s1-m2疫苗进行小鼠体内效价测试，将试验对象balb/c小鼠按照下表1所示分组进行实验。
44.表1
[0045][0046]
1.血清效价
[0047]
取血清利用elisa检测疫苗对野生型新冠病毒、印度delta突变株的体液免疫效价，具体方法为：小鼠麻醉后眼眶静脉采血。3000rpm，10min离心取上层血清，用于后续elisa检测。实验步骤为常规elisa间接法操作步骤。其中，包被抗原为sars-cov-2rbd蛋白或sars-cov-2rbd(delta)蛋白，浓度为10μg/ml。此外，待测血清由400倍起，按2倍递增稀释，直至51200倍稀释度制备血清稀释梯度。最后，以检测孔od值为阴性对照孔od值2.1倍及以上为阳性。根据阳性孔的最高稀释度作为待检血清的效价。
[0048]
检测结果见图2和图3。图2和图3表明，本发明制备得到的ad/s1-m2疫苗针对野生型新冠病毒、印度delta突变株均具有较强的血清效价。
[0049]
2.中和抗体效价
[0050]
检测方法如下：
[0051]
取50μl假病毒与50μl不同稀释度的血清37℃共孵育1小时后，侵染过表达ace2的细胞株，48-72小时后使用流式细胞仪检测gfp阳性细胞比例。根据gfp阳性细胞比例计算中和抑制率。中和抗体效价为50％细胞没有gfp信号的血清稀释度。根据gfp细胞比例，用reed-muench法计算50％血清中和终点。
[0052]
检测结果如下表2所示。
[0053]
表2
[0054][0055]
由表2可知，本发明制备得到的ad/s1-m2疫苗针对野生型新冠病毒、印度delta突变株均具有较强的中和抗体效价。
[0056]
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。