龙头鱼微卫星DNA标记及其引物和应用

龙头鱼微卫星dna标记及其引物和应用
技术领域
1.本发明涉及一种龙头鱼微卫星dna标记及其引物和应用，属于分子生物学dna标记技术和遗传学应用技术领域。


背景技术：

2.龙头鱼(harpadon nehereus hamilton，1822)又称豆腐鱼、鼻涕鱼、水潺。隶属于硬骨鱼纲(osteichthyes)、灯笼鱼目(myctophiformes)龙头鱼科、(harpadontidae)、龙头鱼属(harpadon)。我国主要分布于黄海南部、东海以及南海近岸或河口，尤其喜欢栖息于泥沙底质的环境中，对温度和盐度的升降变化有较强的适应性。龙头鱼肉质细嫩，蛋白质含量约达干重的70％，钙磷含量高于大黄鱼和带鱼等传统经济鱼类，营养价值丰富。20世纪80年代以来，以龙头鱼为代表的中小型鱼类生物量在较短的时间呈迅速增加趋势，逐渐成为了东海和南海海区的优势种群，甚至在浙江北部海域的主要生产季节龙头鱼在渔获物中所占比例最高达75％，经济地位和生态价值得到快速提升。但近年来，由于海洋生态环境破坏和捕捞压力的增大，舟山海域、温台渔场、闽江口渔场等海区龙头鱼群体呈现出低龄化、小型化趋势。甚至被“世界自然保护联盟濒危物种红色名录”(iucn red list of threatened species，iucn)列为近危种(near threatened，nt)，龙头鱼资源的可持续开发利用应受到更多的关注。
3.随着分子生物学技术的不断进步，从遗传学角度提供物种保护和渔业资源恢复措施，已广泛的被科研人员和政府部门接受和采纳。生物种群资源量的衰退常伴随着遗传多样性水平的下降及遗传结构的改变。对群体遗传背景的评估已成为保护生物学和生物种群管理的主要目标之一。评估工作的开展需要依托于有效的遗传标记。微卫星标记(microsatellite)，又称为短串联重复序列(simple tandem repeats，strs)或简单重复序列(simple sequence repeats，ssr)，由含少数几个(1-6个)碱基对的短串联重复dna序列组成。微卫星标记凭借其丰富的多态性、高度的杂合性、低重组率、共显性遗传、庞大的数量以及可重复性等优点，在群体遗传学研究中被广泛应用。
4.传统的通过磁珠富集法构建微卫星文库，已不能满足现代生物学研究的高效和低成本需求。近年来，高通量测序技术的发展为动植物大规模微卫星标记的开发提供了组学水平的全新策略。转录组测序能快速获得特定组织或器官在某一阶段或功能状态下的在转录本序列信息，是获得与已知功能基因相连的微卫星标记的方法之一。
5.龙头鱼是我国沿海一种重要的经济鱼类，也是近海海洋生态系统食物链中的重要环节，但由于海洋环境污染、栖息地破坏、过渡捕捞等状况的相继加剧，龙头鱼种质资源呈衰退迹象，亟需大力开展其种质资源的保护工作。


技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种龙头鱼微卫星dna标记，以利用其进行龙头鱼种质资源保护和遗传多样性评估及分析。
7.本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
8.龙头鱼微卫星dna标记，龙头鱼微卫星dna标记位点是如seq id no.53～seq id no.78所示的核苷酸序列。
9.用于扩增龙头鱼微卫星dna标记位点的引物组合物，所述的引物组合物是如seq id no.1～seq id no.52所示的核苷酸序列。
10.龙头鱼微卫星dna标记，龙头鱼微卫星dna标记位点是如seq id no.54、seq id no.56、seq id no.66、seq id no.67、seq id no.68和seq id no.69所示的核苷酸序列。前述的26对引物都具有多态性扩增，但该6对引物(lty-9、lty-15、lty-42、lty-45、lty-47和lty-58)的多态性最高，为最优组合。该6对引物对应的用于扩增龙头鱼微卫星dna标记位点的引物组合物，所述的引物组合物是如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.7、seq id no.8、seq id no.27、seq id no.28、seq id no.29、seq id no.30、seq id no.31、seq id no.32、seq id no.33、seq id no.34所示的核苷酸序列。
11.一种龙头鱼遗传多样性分析试剂盒，包括所述的引物组合物。
12.所述的引物组合物在龙头鱼群里遗传学分析中的应用。
13.一种所述的应用，包括如下步骤：
14.s1、龙头鱼基因组dna的提取；
15.s2、微卫星分子标记位点的pcr扩增：在所述的引物组合的正向引物5’端连接荧光基团进行修饰，以龙头鱼基因组dna为模板，用修饰后的正向引物和对应的反向引物进行pcr扩增；
16.s3、基因分型：将扩增产物进行分型；
17.s4、遗传多样性分析。
18.作为优选，s2中pcr扩增反应体系共25μl包括：2.5μl10
×
pcr缓冲液(trans，北京)，2μldntps，正反引物各1μl(10μm)，17.25μl去离子水，0.25μl easy taq dna聚合酶(trans，北京)和1μldna模板。
19.作为优选，s2中pcr扩增程序设置为：94℃预变性5min、94℃变性30s、最佳退火温度下退火30s、72℃延伸30s、循环33次，72℃延伸10min。
20.作为优选，所述的荧光基团为fam，hex和tamara。
21.作为优选，s4所述的遗传多样性分析：使用genemarker读取基因分型结果文件，经校正后读取最大峰值对应等位基因长度，记录于excel表格中；通过excel microsatelite toolkit加载宏、convert和genepop v.4.0软件实现文件类型转换；利用excel microsatelite toolkit计算各微卫星位点的遗传多样性参数，包括等位基因数(a)、观测杂合度(ho)、期望杂合度(he)和多态信息含量(pic)。
22.本发明的有益效果是：本发明根据高通测序得到的数据，开发出龙头鱼微卫星dna标记，同时筛选出龙头鱼具有多态性的微卫星标记引物，解决了现有技术开发龙头鱼微卫星分子标记效率低下的现状，为今后进一步开展遗传多样性研究和资源保护提供有利工具。
附图说明
23.图1是24尾龙头鱼样本在lty-75位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱，其中，qd：青岛；
zs：舟山；bh：北海；sy：三亚；m：dnamarker；不同长度的条带代表不同的等位基因。
具体实施方式
24.下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通和/或改变都将落入本发明保护范围。
25.在本发明中，若非特指，所有的份、百分比均为重量单位，所采用的设备和原料等均可从市场购得或是本领域常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
26.实施例1：
27.1.龙头鱼微卫星分子标记的获得
28.本发明通过转录组测序获得龙头鱼大量微卫星标记。
29.2.龙头鱼基因组dna的提取
30.采用苯酚-氯仿法提取基因组dna，经1％琼脂糖凝胶电泳检测dna降解和污染情况。
31.3.多态性微卫星分子标记的筛选
32.根据测距结果信息，使用primer32.37软件设计微卫星引物，引物设计标准如下：gc含量范围为40％-60％；微卫星序列重复基元的拷贝数大于6；预期目的片段产物长度为100-300bp。pcr扩增反应体系共25μl包括：2.5μl10
×
pcr缓冲液(trans，北京)，2μl dntps，正反引物各1μl(10μm)，17.25μl去离子水，0.25μl easy taq dna聚合酶(trans，北京)和1μl dna模板。pcr扩增程序设置为：94℃预变性5min、94℃变性30s、最佳退火温度(如表2所示)下退火30s、72℃延伸30s、循环33次，72℃延伸10min。
33.随机选择采集自舟山、青岛、北海、三亚4个不同地理群体共计24尾龙头鱼基因组dna作为模板，用100对引物进行温度梯度pcr扩增，筛选出每对引物的最佳退火温度。用2％琼脂糖凝胶电泳检测pcr产物，选择扩增产物条带单一、明亮、且条带大小符合预期的位点作为初选微卫星分子标记；用8％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(page)和银染法对初选微卫星分子标记进一步筛选，保留有明显多态性的26个标记(表1)。其中，24尾龙头鱼样本在lty-75位点的聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱如图1所示。
34.表1龙头鱼26对多态性微卫星分子标记位点(下划线标记的为核心重复序列)
35.36.37.[0038][0039]
表2龙头鱼26对多态性微卫星分子标记位点及相应的引物信息
[0040]
[0041]
[0042][0043]
应用例引物组合在龙头鱼群体遗传学分析中的应用
[0044]
在筛选出的26对多态性引物中挑选6对引物(lty-9、lty-15、lty-42、lty-45、lty-47和lty-58)，在每对引物的正向引物合成时分别添加fam，hex和tamara三种荧光染料进行修饰，重新合成荧光引物。以连云港(lyg)、南通(nt)、三门(sm)、泉州(qz)、湛江(zj)、北海(bh)和三亚(sy)7个群体，共165尾龙头鱼样本的基因组dna为模板，用修饰后的正向引物和对应的反向引物进行pcr扩增，pcr反应体系和扩增程序参照引物筛选实验。将pcr产物在abi 3730xl基因分析仪上进行毛细管电泳，进一步验证引物的多态性，并将扩增产物进行分型、开展群体间遗传差异的检测。
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遗传多样性分析：使用genemarker读取基因分型结果文件，经校正后读取最大峰值对应等位基因长度，记录于excel表格中；通过excel microsatelite toolkit加载宏、convert和genepop v.4.0软件实现文件类型转换；利用excel microsatelite toolkit计算各微卫星位点的遗传多样性参数，包括等位基因数(a)、观测杂合度(he)、期望杂合度(he)和多态信息含量(pic)(表3)。
[0046]
表3龙头鱼7个群体在6个微卫星位点的遗传多样性参数
[0047]
[0048][0049]
根据表2的结果可知，6个位点在所有群体中共检测到等位基因111个，平均每个位点的等位基因数为18.5个，各位点均表现出多态性。群体平均多态信息含量(pic)范围在0.673到0.768之间，除位点lty-42和lty-9分别在三门、泉州、湛江、北海、三亚和南通群体中表现出中度多态，其余位点在各群体中均表现为高度多态性，说明所有龙头鱼群体均表现出较高的遗传多样性水平。表明，本发明所提供的微卫星dna引物均可用于后续我国沿海龙头鱼群体遗传多样性和种质资源分析，为今后开展该经济鱼类的资源保护和管理提供参考依据。
[0050]
本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其它实施例的不同之处，各个实施例之间相同或相似部分互相参见即可。对于实施例公开的装置而言，由于其与实施例公开的方法相对应，所以描述的比较简单，相关之处参见方法部分说明即可。
[0051]
以上对本发明所提供的龙头鱼微卫星dna标记及其引物和应用进行了详细介绍。本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。