家蚕核型多角体病毒抗性相关的SNP分子标记及其应用

家蚕核型多角体病毒抗性相关的snp分子标记及其应用
技术领域
1.本发明属于分子生物学及分子育种技术领域，具体涉及家蚕核型多角体病毒抗性相关的snp分子标记及其应用。


背景技术：

2.家蚕是生产蚕茧的重要经济昆虫，家蚕核型多角体病毒(nuclear polyhedrosis virus，bmnpv)引起的血液脓病是世界养蚕业一种重大的传染性疾病，该病引起的蚕茧损失大约占蚕病引起总损失的60％以上。现有的研究证明家蚕对bmnpv病的抗性存在主效控制基因；家蚕bmnpv的抵抗性及其遗传规律的试验研究表明家蚕品系间存在抗性差异，抗性对感性呈不完全显性，抗性是由两对以上基因控制的。对家蚕bmnpv病的防治，选育抗bmnpv新品种是最直接有效的途径，一直以来国内外许多研究都在致力于新的抗性家蚕品种的研究，其抗性基因的鉴定对抗病品种的选育与推广具有重要的作用。
3.分子标记辅助选择技术(marker assisted selection,mas)是一种利用性状相关的标记(如dna变异)来间接选择目的基因或目的性状的技术，包括rapd，rflp，ssr和snp等。
4.单核苷酸多态性(single-nucleotide polymorphism,snp)是指基因组水平上的单个核苷酸的变异引起的一种dna序列多态性，包括碱基的转换和颠换。随着高通量测序技术的发展，snp位点在基因组中被广泛的发现。作为第三代分子标记技术，snp具有数量多，在基因组上分布均一；遗传稳定性高，突变频率低；易于检测，适于快速、规模化筛查等特点而被广泛应用于遗传图谱构建、基因定位、辅助育种等。竞争性等位基因特异性pcr(kompetitive allele specific pcr,kasp)是snp标记检测常用的一种高通量基因分型技术，基于引物末端碱基的特异性匹配对snp分型，即通过2条位点特异性上游引物，一条通用下游引物和2个通用荧光探针对目标snp标记进行检测。kasp技术用于snp标记检测具有高度的稳定性和准确性，且能实现高通量筛选，是分子辅助育种及目的性状鉴定的主要技术手段。
5.目前研究发现的家蚕bmnpv病抗性相关基因连锁的分子标记多为rapd标记或ssr标记，但是这两种分子标记对于抗性基因的鉴定操作复杂，检测效率低，且与抗性性状呈现不完全连锁，不适用于分子标记辅助家蚕育种。
6.基于遗传规律的研究表明家蚕bmnpv病抗性性状是由2对或2对以上基因控制的，且存在叠加效应；现有的研究结果也表明基于单个抗性基因连锁的分子标记不能有效鉴定家蚕bmnpv病抗性性状。现阶段，家蚕bmnpv病抗性品种的选育主要依靠传统的表型鉴定方法，工作量大，周期长且准确性易受环境影响。因此，开发适用于高通量检测平台且能够快速、准确鉴定家蚕bmnpv病抗性性状的snp分子标记对于推广普及分子标记技术的应用、提高家蚕育种的效率和技术水平具有重要意义。


技术实现要素：

7.为了解决上述背景中的技术问题，本发明提供了家蚕bmnpv抗性snp分子标记组，
基于所述snp分子标记组结合kasp检测技术可以实现对家蚕bmnpv抗性品种的有效、快速、准确鉴定。
8.为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：
9.本发明首先提供一组家蚕bmnpv抗性snp分子标记，所述分子标记包括位于家蚕3号染色体上的chr3-746标记和位于家蚕27号染色体上的chr27-5071标记。
10.进一步的，所述chr3-746标记在3号染色体上的遗传距离为12.5cm，其定位3号染色体上抗性基因的区间为10.6cm～14.7cm；所述chr27-5071标记在27号染色体上的遗传距离为13.8cm，其定位27号染色体上抗性基因的区间为12.1cm～15.8cm。
11.所述chr3-746标记位于家蚕p50t基因组的3号染色体序列的第14951064位，碱基多态性为g/a，其中a等位基因和家蚕bmnpv病抗性基因紧密连锁；所述chr27-5071标记位于家蚕p50t基因组的27号染色体序列的第9462596位，碱基多态性为c/g，其中g等位基因和家蚕bmnpv病抗性基因紧密连锁。
12.本发明还提供检测所述snp分子标记的引物，所述检测上述snp分子标记的引物组合为kasp引物组合，每个kasp引物组合由两条末端碱基不同的等位基因正向特异性引物f1、f2和一条反向通用引物r构成。
13.进一步的，所述引物包括用于扩增chr3-746标记和用于扩增chr27-5071标记的引物组，其中，用于扩增chr3-746标记的引物组包括seq.id.no.1-3所示引物序列，用于扩增chr27-5071标记的引物组包括seq.id.no.4-6所示引物序列。
14.进一步的，所述用于扩增chr3-746标记的引物组中seq.id.no.1所示引物用于匹配a等位基因，seq.id.no.2所示引物用于匹配g等位基因；所述用于扩增chr27-5071标记的引物组中seq.id.no.4所示引物用于匹配g等位基因，seq.id.no.5所示引物用于匹配c等位基因。
15.进一步的，所述用于扩增chr3-746标记的引物组中seq.id.no.1所示引物和用于扩增chr27-5071标记的引物组中seq.id.no.4所示引物采用hex或vic荧光探针分别标记；用于扩增chr3-746标记的引物组中seq.id.no.2所示引物和用于扩增chr27-5071标记的引物组中seq.id.no.5所示引物采用fam荧光探针分别标记。
16.具体的，引物信息如下：
17.用于扩增chr3-746标记的引物组：
18.f1(seq.id.no.1):5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattgcatgctttaagtcaaaacgcattaa-3’19.(用于匹配a等位基因，小写字母部分为hex荧光标签序列)；
20.f2(seq.id.no.2):5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctgcatgctttaagtcaaaacgcattag-3’(用于匹配g等位基因，小写字母部分为fam荧光标签序列)；
21.r(seq.id.no.3):5
’‑
gaatcctattcacaatgcagggtg-3’。
22.用于扩增chr27-5071标记引物组：
23.f1(seq.id.no.4):5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattgaatcgagcccacgaccttg-3’(用于匹配g等位基因，小写字母部分为hex荧光标签序列)；
24.f2(seq.id.no.5):5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctgaatcgagcccacgaccttc-3’(用于匹配c等位基因，小写字母部分为fam荧光标签序列)；
25.r(seq.id.no.6):5
’‑
gtaatagtgcacggtagaatgacg-3’。
26.本发明还提供检测或辅助检测家蚕bmnpv抗性的产品，所述产品包括检测试剂、试剂盒或芯片等；所述产品包括家蚕bmnpv抗性snp分子标记或检测家蚕bmnpv抗性snp分子标记的引物。
27.本发明还提供一种家蚕bmnpv病抗性相关的snp分子标记开发方法，包括如下步骤：
28.s1、利用家蚕bmnpv病抗感材料亲本构建遗传作图群体；
29.s2、提取步骤s1抗感材料亲本及作图群体的基因组dna，通过简化基因组测序(rad-seq)开发亲本间snp标记；
30.s3、筛选步骤s2得到的snp标记构建遗传图谱；
31.s4、利用步骤s1的作图群体表型数据结合步骤s3构建的遗传图谱进行qtl区间定位；
32.s5、通过步骤s4的lod峰值筛选抗性基因连锁的snp分子标记；
33.s6、设计步骤s5筛选得到的snp分子标记的kasp引物；
34.s7、利用含有步骤s6的kasp引物的试剂盒，采用kasp方法验证snp分子标记。
35.本发明还提供所述snp分子标记或所述引物或所述产品或所述检测方法在以下任一方面的应用：
36.(1)家蚕种质资源或者品种的鉴定；
37.(2)家蚕种质资源或者品种纯度的鉴定；
38.(3)家蚕的bmnpv病抗性性状的鉴定；
39.(4)家蚕的分子标记辅助育种；
40.(5)家蚕的bmnpv病抗性基因的定位与鉴定；
41.(6)开发家蚕种质资源或性状鉴定的产品。
42.根据上述的应用，优选的，上述应用包括以下步骤：
43.提取待测家蚕样品的基因组dna；对提取的基因组dna进行chr3-746标记和chr27-5071标记的基因多态性或基因型的检测；根据检测结果进行判断、鉴定或辅助育种。
44.其中，所述检测利用kasp技术进行，采用hex或vic荧光探针分别标记chr3-746标记的a等位基因和chr27-5071标记的g等位基因；fam荧光探针分别标记chr3-746标记的g等位基因和chr27-5071标记的c等位基因。
45.只有chr3-746标记和chr27-5071标记同时检测出hex或vic荧光信号时，即所述chr3-746标记的基因型为aa或ag基因型且所述chr27-5071标记的基因型为gg或gc基因型，才能判定检测家蚕为bmnpv病抗性家蚕。
46.所述检测结果的判断、鉴定或辅助育种方法为：若chr3-746标记的基因型为gg或chr27-5071标记的基因型为cc，则待检家蚕为bmnpv病感病家蚕；若chr3-746标记的基因型为aa或ag且chr27-5071标记的基因型为gg或gc，则待检家蚕为bmnpv病抗病家蚕。
47.所述kasp技术的pcr扩增体系以5μl计为：2.5μl kasp master mix(2x)，0.7μlkasp引物组(10μm浓度的f1、f2引物各0.15μl，10μm浓度的r引物0.4μl)，1μl基因组dna(20～50ng/μl)，加ddh2o补充体系至5μl。
48.所述kasp技术的pcr扩增程序为：94℃预变性10min；94℃变性20s，65℃退火1min，每个循环退火温度降0.8℃，共10个循环；94℃变性20s，57℃退火1min，共27～30个循环；25
℃延伸30s，收集荧光信号。
49.优选的，通过选择上述chr3-746标记的基因型为aa或ag基因型且所述chr27-5071标记的基因型为gg或gc基因型的检测家蚕为亲本进行育种。
50.本发明的有益效果：
51.本发明利用抗bmnpv病家蚕品系和感bmnpv病家蚕品系杂交得到f1代，f1代自交得到f2代重组自交系，共152个个体构成遗传作图群体，对f2代遗传群体bmnpv病表型鉴定分为抗病群体和感病群体。提取亲本和遗传群体个体的基因组dna进行简化基因组测序(rad-seq)开发多态性标记，然后利用开发得到的3060个snp标记构建了遗传连锁图谱；通过抗病群体和感病群体，结合高密度连锁图谱，对性状进行qtl分析，得到3号染色体上和qtl基因紧密连锁的chr3-746标记以及27号染色体上和qtl基因紧密连锁的chr27-5071标记。利用chr3-746和chr27-5071双标记的检测能够有效鉴定出抗病性状个体，降低单个标记检测的假阳性率。
52.本发明开发的家蚕bmnpv病抗性snp分子标记能够有效鉴定出家蚕bmnpv病抗性性状，且不受时间、取材地点、环境等因素的影响，能够应用于辅助家蚕育种，加快家蚕bmnpv病抗性品种的选育。
53.本发明通过kasp基因分型检测技术检测上述snp分子标记，利用kasp技术高灵敏度、高通量、易于操作等特点能够快速、准确、高通量地对家蚕bmnpv病抗性品种进行检测、筛选，提高育种效率。
54.本发明通过开发上述snp分子标记组发现家蚕3号染色体和27号染色体上存在抗性主效基因，对于家蚕bmnpv病抗性基因的定位鉴定及其它家蚕bmnpv病抗性分子标记的开发具有重大的参考价值。
附图说明
55.图1为家蚕bmnpv病抗性snp分子标记组的开发流程示意图。
56.图2为家蚕遗传作图群体构建示意图。
57.图3为家蚕遗传连锁图谱。
58.图4为家蚕bmnpv病抗性性状关联分析结果。
59.图5为snp分子标记组在家蚕基因组染色体上的定位示意图，展示了chr3-746标记在家蚕3号染色体上的遗传距离以及3号染色体上的抗病qtl区间和chr27-5071标记在家蚕27号染色体上的遗传距离以及27号染色体上的抗病qtl区间。
60.图6为chr3-746标记在家蚕f2代遗传群体中的基因型图谱，aa和ag基因型为含有3号染色体上抗性基因的纯合和杂合型，gg为参考基因型(感性纯合型)。
61.图7为chr27-5071标记在家蚕f2代遗传群体中的基因型图谱，gg和gc基因型为含有27号染色体上抗性基因的纯合和杂合型，cc为参考基因型(感性纯合型)。
62.图8为分子标记辅助选择育种流程示意图。
具体实施方式
63.为了使本领域技术人员更好的理解本发明的技术方案，下面对本发明的较佳实施例进行详细的阐述，但是如下实施例并不限制本发明的保护范围。
64.下述实验方法，如无特殊说明，均为本技术领域常规方法；下述实验所用材料、试剂，如无特殊说明，均为市售可购得的产品。
65.所用家蚕品种为抗性品系
‘
nb’和感性品系
‘
306’，均为公开已知品种，江苏大学生命科学学院实验室保存。
66.实施例1.开发家蚕bmnpv病抗性snp分子标记组
67.家蚕bmnpv病抗性snp分子标记组的开发流程如图1，通过筛选验证得到包括chr3-746标记和chr27-5071标记的snp分子标记组，具体步骤如下：
68.(1)构建遗传作图群体
69.利用抗bmnpv病家蚕品系
‘
nb’作为父本，以感bmnpv病家蚕品系
‘
306’作为母本杂交得到f1代，f1代和家蚕品系
‘
306’侧交得到bc1代，侧交系共152个子代个体，在3龄期通过添食108bmnpv/ml浓度的npv病毒将bc1代群体分为抗病群(添毒后存活的)和感病群(添毒后死亡的)(图2)；
70.(2)简化基因组测序开发snp标记
71.利用酚氯仿提取法提取
‘
nb’、
‘
306’亲本和重组自交系共计154个个体的基因组dna；
72.对上述154个个体进行简化基因组测序(rad-seq)，通过比对家蚕参考基因组bombyx mori(http://silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/index.cgi)，基于亲本分型检测结果，进行亲本间多态性标记开发；过滤亲本信息缺失的位点，筛选符合该群体作图标记类型的亲本多态性位点，对于bc1代群体，筛选父母本纯合差异的多态性位点(例如：某个snp位点亲本1基因型为cc，亲本2基因型为aa，亲本基因型都为纯合且亲本间基因型不同)，共得到3060个snp标记。
73.(3)遗传连锁图谱构建
74.利用上述筛选得到的snp分子标记对子代群体进行分型并进行基因型编码，并计算每个位点异常碱基个体数、子代分型缺失个体数、偏分离卡方值等信息，将编码后的子代分型结果导入joinmap5软件中进行图谱构建，为保证图谱质量，使用joinmap5进行如下条件过滤：
75.a.位点异常碱基个体数为0；
76.b.子代分型缺失个体数＜20％；
77.完成过滤后，进行连锁群划分，lod值设置为2～10；对每个连锁群采用回归算法进行排序；采用kosambi函数将重组率转换为遗传距离。
78.(4)qtl定位分析及抗性snp分子标记的筛选
79.利用作图群体的抗病和感病表型数据结合步骤(3)所得到的连锁图谱(图3)，对性状利用mapqtl6软件进行qtl分析。具体分析步骤如下：
80.a.利用置换检验做1000次重复，估算单个连锁群及基因组范围内α＝0.05水平上的lod阈值；
81.b.利用区间作图法(interval mapping，im)进行qtl分析，在每条连锁群上每隔1cm对qtl存在的可能性扫描一次；
82.c.以单个连锁群范围内α＝0.05水平上的lod值作为阈值，即出现一个lod峰值大于或等于阈值时视为该位点存在一个qtl，lod峰值位置即为相应qtl基因最可能的位置。
83.利用plink(version：1.07)软件对连锁图谱上的3060个snp标记与家蚕bmnpv病抗性性状进行单个snp标记的关联分析，结果见图4。
84.性状的qtl分析结果表明，在设置阈值lod≥4的条件下，只有3号连锁群(3号染色体)和27号连锁群(27号染色体)出现明显大于阈值的lod峰值，即在3号染色体和27号染色体上分别存在明显的qtl(bmnpv病抗性)基因，其中lod峰值越高，代表对应的snp分子标记和qtl基因的连锁越紧密。
85.分别选取3号染色体和27号染色体上最高lod峰值位置对应的snp分子标记，最终筛选得到2个和抗性基因连锁的snp标记，分别命名为chr3-746和chr27-5071，所述chr3-746标记在3号染色体上的遗传距离为12.5cm，通过2-lod置信区间得到3号染色体上抗性基因的遗传距离区间为10.6cm～14.7cm(图5)；所述chr27-5071标记在27号染色体上的遗传距离为13.8cm，通过2-lod置信区间得到27号染色体上抗性基因的遗传距离区间为12.1cm～15.8cm(图5)；对应家蚕p50t基因组，所述chr3-746标记位于3号染色体序列的第14951064位，碱基多态性为g/a，其中a等位基因和家蚕bmnpv病抗性基因紧密连锁；所述chr27-5071标记位于27号染色体序列的第9462596位，碱基多态性为c/g，其中g等位基因和家蚕bmnpv病抗性基因紧密连锁。
86.qtl分析结果显示chr3-746标记的lod值为22.42，对表型的贡献率为49.8％；chr27-5071标记的lod值为17.38，对表型的贡献率为41.4％；所以chr3-746标记和chr27-5071标记与家蚕bmnpv病抗性性状高度关联，可作为家蚕bmnpv病抗性snp分子标记。
87.(5)kasp引物设计
88.根据家蚕参考基因组
89.bombyx mori(http://silkbase.ab.a.u-tokyo.ac.jp/cgi-bin/index.cgi)的序列分别提取chr3-746标记和chr27-5071标记左右各150bp的侧翼序列，优选的，利用primer5.0软件设计对应snp标记的kasp引物组合。
90.用于检测chr3-746标记和chr27-5071标记基因型的kasp引物组合具体见表1。
91.表1.kasp引物组合
[0092][0093]
(6)kasp验证snp分子标记
[0094]
以
‘
nb’抗性亲本和
‘
306’感性亲本构建的bc1代性状分离群体(添食bmnpv后，将存活个体分为抗性群，死亡个体分为感性群)为实验材料，提取基因组dna为模板，设置1个空
白对照(加水作为ntc)，共计156个样本。
[0095]
对扩增2个标记的引物做荧光标记：
[0096]
用于扩增chr3-746标记的引物组：
[0097]
f1(seq.id.no.1):5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattgcatgctttaagtcaaaacgcattaa-3’(用于匹配a等位基因，小写字母部分为hex荧光标签序列)；
[0098]
f2(seq.id.no.2):5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctgcatgctttaagtcaaaacgcattag-3’(用于匹配g等位基因，小写字母部分为fam荧光标签序列)；
[0099]
r(seq.id.no.3):5
’‑
gaatcctattcacaatgcagggtg-3’。
[0100]
用于扩增chr27-5071标记引物组：
[0101]
f1(seq.id.no.4):5
’‑
gaaggtcggagtcaacggattgaatcgagcccacgaccttg-3’(用于匹配g等位基因，小写字母部分为hex荧光标签序列)；
[0102]
f2(seq.id.no.5):5
’‑
gaaggtgaccaagttcatgctgaatcgagcccacgaccttc-3’(用于匹配c等位基因，小写字母部分为fam荧光标签序列)；
[0103]
r(seq.id.no.6):5
’‑
gtaatagtgcacggtagaatgacg-3’。
[0104]
加入kasp引物和lgc公司的kasp master mix(low rox)，在abi的quantstudio6(q6)荧光定量平台进行pcr扩增、荧光扫描和数据分析，优选的，pcr扩增体系见表2。
[0105]
表2.pcr扩增体系
[0106]
组分体积(μl)2
×
kasp master mix2.5f1 primer(10μm)0.15f2 primer(10μm)0.15r primer(10μm)0.4dna template(20～50ng/μl)1h2oup to 5
[0107]
优选的，荧光定量pcr反应条件为：94℃预变性10min；94℃变性20s，65℃退火1min，每个循环退火温度降0.8℃，共10个循环；94℃变性20s，57℃退火1min，共27～30个循环；25℃延伸30s，收集荧光信号。
[0108]
(7)结果分析
[0109]
荧光收集完成后由q6平台软件进行数据分析，得到chr3-746标记和chr27-5071标记的分型结果(分型图谱见图6、图7)，其中hex荧光标记抗性基因紧密连锁的等位基因型，hex荧光信号的检出意味着检测个体存在抗性基因，hex/hex代表抗性纯合型，hex/fam代表抗性杂合型，fam/fam代表感性纯和型；对于chr3-746标记来说，hex/hex为aa基因型，hex/fam为ag基因型，fam/fam为gg基因型；对于chr27-5071标记来说，hex/hex为gg基因型，hex/fam为gc基因型，fam/fam为cc基因型。
[0110]
分别统计chr3-746标记和chr27-5071标记在bmnpv病抗性群体和bmnpv病感性群体中的基因型，通过卡方检验来验证snp分子标记和性状关联的显著性，结果见表3，根据表3可知chr3-746标记和chr27-5071标记卡方检验的p值均小于0.001，呈现出与家蚕bmnpv病抗性性状关联的极显著性。
[0111]
表3.chr3-746标记和chr27-5071标记的卡方检验
[0112][0113]
结合家蚕遗传群体的表型数据，统计chr3-746标记抗性基因紧密连锁的a等位基因和chr27-5071标记抗性基因紧密连锁的g等位基因在家蚕bmnpv病抗性群体和感性群体中的检出情况，同时利用家蚕已知抗性rapd标记ay380833.1(genebank)对抗感群体进行检测并统计结果。
[0114]
由抗病群体的统计结果可知，92％以上的抗病家蚕同时检测出了chr3-746标记的a等位基因和chr27-5071标记的g等位基因(表4、表6)；由感病群体的统计结果可知，30％以上的感病家蚕检测出了chr3-746标记或chr27-5071标记或ay380833.1标记的抗性等位基因，但chr3-746标记的a等位基因和chr27-5071标记的g等位基因同时检出的概率不到4％(表5、表6)，说明利用chr3-746标记和chr27-5071标记组成的snp分子标记组进行抗性性状的鉴定能够有效区分抗bmnpv病家蚕和感bmnpv病家蚕，其对抗病家蚕的有效检出达92％以上，对感病家蚕的有效检出达96％以上。所以，chr3-746标记和chr27-5071标记组成的snp分子标记组能够有效鉴定出家蚕bmnpv病抗性个体，可以应用于家蚕种质资源的鉴定及辅助家蚕育种。
[0115]
表4.分子标记在家蚕bmnpv病抗性群体的检出情况
[0116][0117]
注：rapd标记ay380833.1在抗病性个体中扩增片段大小为736bp，在感病性个体中扩增片段大小为1628bp，扩增出736bp片段代表含有抗性基因；chr3-746标记基因型aa或ag为抗性基因紧密连锁的a等位基因的纯合或杂合型，代表含有3号染色体上的抗性基因；chr27-5071标记基因型gg或gc为抗性基因紧密连锁的g等位基因的纯合或杂合型，代表含有27号染色体上的抗性基因；chr3-746+chr27-5071标记组合基因型(aa或ag)+(gg或gc)代表既含有3号染色体上的抗性基因又含有27号染色体上的抗性基因。
[0118]
表5.分子标记在家蚕bmnpv病感性群体的检出情况
[0119][0120]
注：rapd标记ay380833.1在抗病性个体中扩增片段大小为736bp，在感病性个体中扩增片段大小为1628bp，扩增出736bp片段代表含有抗性基因；chr3-746标记基因型aa或ag为抗性基因紧密连锁的a等位基因的纯合或杂合型，代表含有3号染色体上的抗性基因；chr27-5071标记基因型gg或gc为抗性基因紧密连锁的g等位基因的纯合或杂合型，代表含有27号染色体上的抗性基因；chr3-746+chr27-5071标记组合基因型(aa或ag)+(gg或gc)代表既含有3号染色体上的抗性基因又含有27号染色体上的抗性基因。
[0121]
表6.bc1代性状分离群体分子标记基因型与样本已知表型对应结果
[0122]
[0123]
[0124]
[0125]
[0126]
[0127][0128]
注：下划线表示chr3-746标记和chr27-5071标记的组合基因型与个体表型不符合的情况。
[0129]
在该实施例中，通过检测家蚕已知bmnpv抗性rapd标记ay380833.1(genebank)作为对比，利用chr3-746标记和chr27-5071标记组成的snp分子标记组对抗性家蚕检测的准确率达92％以上(表4)，对感性家蚕检测的假阳性率在4％以下(表5)，对家蚕的抗感表型鉴定的准确率达94.86％，对比ay380833.1标记75.43％的鉴定准确率，提升19.43％(表6)；同时对比单一标记chr3-746、chr27-5071或ay380833.1在感性群体中的检测结果，发现单一标记的检测有30％以上的假阳性率；可见，本发明所述snp分子标记组的检测能够极大降低检测的假阳性率，对感性个体的有效鉴定达96％以上(表5)。
[0130]
实施例2.家蚕bmnpv病抗性snp分子标记组在辅助家蚕抗bmnpv病品系育种的应用
[0131]
(1)分子标记辅助选择流程见图8，具体如下：
[0132]
以
‘
nb’品系蚕蛾翅膀为材料，提取基因组dna，通过kasp方法检测chr3-746标记和chr27-5071标记的基因型，选取chr3-746标记为aa基因型且chr27-5071标记为gg基因型的
蚕蛾作为父本，选取经济性状优良的生产品种为母本进行杂交，然后和经济性状优良的轮回亲本连续回交到第8代，再自交2代以上选取抗性性状不分离的蛾区继代。为了保证抗性基因准确传递而不丢失，同时也考虑检测的简便性，每回交2个世代采用snp分子标记组选择，采用蛾区饲育——抽样检测法，凡蛾区能同时检测到chr3-746标记的a等位基因和chr27-5071标记的g等位基因的个体，则此蛾区继代，通过bc8的继代蛾区自交强化选择2次，kasp和攻毒筛选得到bmnpv病抗性基因型纯和的后代。
[0133]
(2)分子标记辅助选择技术对比传统抗病家蚕育种
[0134]
在相同的时间，相同的环境下开展育种实验，通过传统添毒选择育种作为对比，经过11个世代选择后获得2个抗bmnpv品系家蚕，即传统添毒选择育种获得的抗性品系
‘
nb-r1’和分子标记辅助选择技术育种获得的抗性品系
‘
nb-r2’。
[0135]
比较传统添毒选择和分子标记辅助选择抗病性效果：
[0136]
对
‘
nb-r1’品系和
‘
nb-r2’品系采用3.2
×
108bmnpv/ml经口添毒鉴定，用平均死亡率作为抗性的评判标准，其结果见表7。表7中传统育种获得的
‘
nb-r1’品系平均死亡率为13.3％，而采用分子标记选择的
‘
nb-r2’品系的平均死亡率仅为2.8％，选择效果非常理想。
[0137]
在本实施例中，和传统育种方法比较，本发明开发的snp分子标记的组合应用抗病家蚕的育种得到的抗性家蚕存活率提升20％以上(表7)。
[0138]
表7.传统抗病家蚕育种与分子标记辅助选择技术育种效果对比
[0139][0140]
本发明可以通过其它的不脱离其精神实质或必要特征的实施方案来实现，因此，上述公开的实施方案，都只是举例说明，并不是仅有的。所有在本发明范围内或在等同于本发明的范围内的改变均被本发明包含。