专利名称:Hla－a中分辨度配型芯片的制备及应用的制作方法
背景技术：
HLA抗原位于人的第6号染色体短臂的一个狭窄区域，是人体内最复杂的遗传多态性系统，在免疫调控过程中发挥重要作用。HLA多态性检测在医学实践和科研中具有十分重要意义，为器官、组织移植配型，疾病相关性研究，人类学及法医学上的应用等领域的发展提供了可靠的技术方法和有价值的资料。血清学方法是HLA-B抗原传统的经典分型方法，但是随着对HLA研究的深入和对分型技术要求的不断提高，以及越来越多的等位基因陆续被发现和命名，血清学方法已经无法获得足够的单特异性抗体，不能够分辨出所有的特异性，而且标准抗血清的筛选技术复杂，难度大，人力物力消耗大，另外血清学方法之间存在较多，较强的交叉反应，使HLA-A类抗原亚型的分辨较为困难。
随着生物学技术的不断发展，基因分型已成为HLA分型的主要方法。近年来对A类抗原的基因分型研究取得了较大进展。其中PCR-SSP、PCR-SSO、PCR-SSCP(单链构像多态性分析)3种分型方法对抗原的分型均获得成功.但这些方法也存在一些明显的不足，如PCR-SSP方法，主要依赖于PCR技术，对某一基因个体进行分型时往往要设计大量的引物，这将很难避免接下来的PCR过程中的污染问题而导致的假阳性，而且操作复杂，需要通过多次的电泳来判断最后的结果，不适合大批量样本的分型，使其在临床上的应用受到限制；PCR-SSCP法对分析小于400bpPCR扩增产物十分有效，但此法仅能探知基因变异的存在，而无法确定变异的确切位置及内容，一般仅用作HLA匹配程度的分析，而不用来进行HLA的具体分型。
基因芯片是近年来兴起的一项前沿生物技术，是对传统生物技术如检测、DNA杂交、分型和测序技术重大的飞跃和创新，是涉及到生物信息学，微电子技术，计算机科学，半导体技术等诸多自然学科的综合性技术，在生命科学领域中显出了巨大的潜能和诱人前景。基因芯片是指将许多特定的寡核昔酸片段或基因片段作为探针，有规律的排列固定于支持物上，然后与待测的标记过的样本基因进行特异性杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统对芯片进行扫描，并配以计算机系统对每一个探针上的荧光信号进行检测，从而得出大量信息。基因芯片具有高度集成和并行处理的特点，所需试剂和样本量少，结果由计算机软件自动分析，是解决HLA众多等位基因分型的有效方法。由于HLA个体遗传学差异的本质是在编码其抗原产物的基因水平上，所以分析HLA基因型无疑是对HLA型别分析的最准确的方法，其准确性远高于血清与细胞学分型，并已逐渐取代了前两者的位置，因此HLA抗原的DNA分型成为必然趋势。
发明内容本发明采用寡核苷酸芯片分型方法，依据第十三届国际组织相容性工作会议报告及相关文献，同时考虑遗传的连锁不平衡，及强脊炎，幼年型糖尿病等与HLA密切相关的遗传病等因素，选择了中国人群基因频率较高的等位基因，根据HLA-A不同基因亚型的独特序列，完成了探针的设计与筛选，最后设计了HLA-A56条探针制成基因分型芯片，这些探针可完成中分辨度分辨，完全可以满足临床配型工作的需要。通过带荧光标记的引物将待测样本经PCR扩增后所要目的片断带上荧光标记，带有荧光标记的PCR产物与芯片上的探针杂交，根据杂交信号强弱及位置确定样品的基因型。本发明在玻片上固定探针，完全可以完成HLA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗产性疾病的人群筛查。
本发明的目的是针对HLA-A基因设计了一套探针(见表1)。将这些探针固定在环氧处理的芯片片基上，制成完整的HLA-A类基因寡核苷酸芯片，并提供包含实验操作所必需的所有组分，组成了一套完整的试剂盒。可用于HLA基因分型、骨髓移植器官移植的HLA配型、与HLA有密切关系的遗产性疾病的人群筛查。
优点及效果本发明的实施实现了对HLA-A基因快速、准确、高通量分型，可实现一张芯片多人份，满足临床器官移植的配型要求，适于临床推广，并可用于其他相关领域，具有重大的社会和经济效益。
实施方法下面结合本发明的具体实施方法图1芯片外观1玻片表面处理环氧玻片处理普通玻片，洗液浸泡，清水冲洗，蒸馏水洗三遍，晾干备用。
2％3-glycidoxypropyltriethoxysilane乙醇溶液超声2min混合，放入玻片1hr浸泡，95％乙醇洗两次5min，自然晾干。
2引物设计及PCR条件HLA-A选择有意义外显子片段，设计自己的引物。在HLA-A座位的exon2和exon3区域分别设计上下游引物，为双下游和双上游引物进行嵌套氏PCR，产物长度在800bp左右，序列如下正链5’-GGCCTCTGT/CGGGGAGAAGCAA-3’，5’-GTCCCAATTGTCTCCCCTCCTT-3’，反链5’-AGCCGCGCCG/TGGAAGAGGGTCG-3’，5’-GGCCCCTGGTACCCGTGCGCTG-3’。扩增条件为第一次PCR96℃3min；96℃25s、65℃45s、72℃30s，26个循环；96℃25s、55℃1min、72℃2min，4个循环；72℃5min。第二次PCR(Nested PCR)96℃3min；96℃30s、56℃30s、72℃ 30s，30个循环；96℃30s、56℃1min、72℃2min，4个循环；72℃5min。方法同前选择最佳条件，建立引入荧光标记的PCR体系。
3探针处理探针经NH2-修饰后用于芯片点样。通过NH2与环氧基的化学结合，探针固定在环氧片基上。将浓度为100umol/L的寡核苷酸探针与点样缓冲液(0.2M NaOH)1∶1混合加在96孔板里，用点样仪点成所需矩阵(见图1)。从左往右，每五个点代表一条探针，共分三个矩阵，分别是阳性对照，HLA-A，阴性对照的三组探针。点样后封闭过夜，待其自然干燥后，130℃烘烤30min、95℃水浴1min、封闭待其自然干燥、-20℃保存备用。
4杂交将10ul杂交buffer，18ulPCR产物与1ul鲑精DNA(鲑精DNA用来降低杂交背景)充分混合，将同一样本的阳性对照，HLA-A阴性对照的三种不同PCR产物用移液器加样到相应点样区域，根据区域大小选择合适大小的盖玻片，盖上盖玻片。放入分子杂交仪杂交，杂交条件为40℃，1小时。
5洗涤取出芯片，5×洗脱液(20*SSC)洗脱，浸泡5分钟；取出芯片，放入3×洗脱液中浸泡5分钟ddH2O洗2次(每一步浸泡清洗后，都必须迅速离心)。将洗过的芯片置于室温自然晾干，干燥后用ScanarryGX扫描。
6扫描通过分析软件，将直观的信号强弱转化为信号比值，根据比值及具体位置上标记的探针序列，即可确定样本的基因型。在图2中，最左边是阳性定位点，最右边是阴性定位点，用于分析软件识别行列和定位。当带荧光标记的PCR产物与芯片上的探针杂交时，探针如果与PCR产物完全互补，则扫描出的杂交信号强，颜色在黄白之间；如果与PCR产物完全不互补，扫描出的信号弱，颜色为蓝或无色；如果与PCR产物部分互补，则扫描出的信号和颜色介于两者之间。通过特定分析软件，将直观的颜色强弱转化为信号的比值，可以方便的得出分型结果。HLA配型芯片设计了阳性对照和阴性对照而且每个探针都有5次重复，使系统的可靠性、稳定性、科学性得到了有效保证。
图2杂交结果显示7结果芯片检测结果用国际知名的one lambda公司的Micro SSPTM Class I&II Generic Tray进行平行对照试验。基因分型结果与用国际公认的one lambda试剂盒所得出的基因分型结果基本一致。
对不一致的样本进行了测序对照，测序结果与芯片分析结果完全一致。1HLA配型芯片可分辨HLA-A抗原特异性21个，等位基因196个(见表6)。
表6基因芯片分辨HLA-A位点等位基因及其对应的抗原特异性
注()内为可分辨的等位基因数。
序列表1<110>天津医科大学<120>HLA-A中分辨度配型芯片的制备及应用<160>56<210>1<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>1TATTTCTTCA CATCCGTGT 19<210>2<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>2TATTTCTACA CCTCCGTGT 19<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>3TCTACACTTC CGTGTCCCG 19<210>4<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>4TACACCTCCA TGTCCCGGC 19<210>5<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>5CAGGAGAGGC CTGAGTATT 19<210>6
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>6GACGAGGAGA CAGGGAAAG 19<210>7<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>7GGGACCGGAA CACACGGAA 19<210>8<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>8GGGACCTGCA GACACGGAA 19<210>9<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>9GGAACACACG GAAAGTGAA 19<210>10<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>10GGGACGGGGA GACACGGAA 19<210>11<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>11
ACACGGAATA TGAAGGCCC 19<210>12<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>12GACACGGAAT GTGAAGGCC 19<210>13<211>15<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>13TCTGTGACTG GGCCT 15<210>14<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>14TGAAGGCCCA CTCACAGA 18<210>15<211>16<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>15GTCAGTCTGT GAGTGG 16<210>16<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>16TCACAGACTC ACCGAGTGG 19<210>17<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>17CACAGATTGA CCGAGTGGA 19<210>18<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>18ACAGACTGAC CGAGTGGAC 19<210>19<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>19CCGAGCGAAC CTGGGGACC 19<210>20<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>20CCGAGTGGAC CTGGGGAC 18<210>21<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>21CCGAGAGAAC CTGCGGAT 18<210>22<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>22ACCGAGAGAG CCTGCGGAT 19<210>23<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>23CCGAGAGAAC CTGGGGACC 19<210>24<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>24GTGGACCTGG CGACCCTGC 19<210>25<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>25CACACCATCC AGATAATGT 19<210>26<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>26CACACCGTCC AGAGGATGT 19<210>27<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>27TACCGGCAGG ACGCCTACG 19<210>28<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>28TACCAGCAGGACGCTTACG 19<210>29
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>29TATGAACAGC ACGCCTACG 19<210>30<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>30TACCACCAGT ACGCCTACG 19<210>31<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>31TACCAGCAGG ACGCCTACG 19<210>32<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>32TCGCCTTGAA CGAGGACC 18<210>33<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>33TCGCCCTGAA AGAGGACC 18<210>34<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>34
CCTGCGCTCT TGGACCGCG 19<210>35<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>35TCAGATCACC CAGCGCAAG 19<210>36<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>36TCAGARCACC AAGCGCAAG 19<210>37<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>37TCAGACCACC AAGCACAAG 19<210>38<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>38GGAGGCGGCC CATGTGGCG 19<210>39<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>39GGAGACGGCC CATGAGGCG 19<210>40<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>40GGAGGCGGCC CATGAGGCG 19<210>41<211>14<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>41CCTCATGGGC CGCC 14<210>42<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>42AGGCGGCCCA TGCGGCGGA 19<210>43<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>43AGGCGGCCCG TCGGGCGGA 19<210>44<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>44AGGCGGCCCG TGTGGCGGA 19<210>45<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>45GGAGCAGCGG AGAGTCTAC 19<210>46<211>19<212>DNA
<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>46GGCGGAGCAG TTGAGAGCC 19<210>47<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>47GGCGGAGCAG TGGAGAGCC 19<210>48<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>48GGCGGAGCAG CAGAGAGCC 19<210>49<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>49CCTGGATGGC ACGTGCGTG 19<210>50<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>50GCACGTGCGT GGAGTGGC 18<210>51<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>51GCCGGTGCGT GGACGGGC 18<210>52
<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>52GGCGAGTGCG TGGAGTGGC 19<210>53<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>53GCACGTGCGT GGACGGGC 18<210>54<211>18<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>54GCCGGTGCGT GGAGTGGC 18<210>55<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>55GGCGAGTGCG TGGACGGGC 19<210>56<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>根据多态性位点及Tm值设计<400>56TGCGTGGACG GGCTCCGCA 19。
权利要求
1 一种HLA-A基因中分辨度分型方法，其特征在于根据中国人群HLA-A类常见的基因位点以及临床应用中对分型分辨度的实际需要，设计特异性寡核苷酸中分辨度分型探针，制成基因分型芯片。采用带荧光标记的引物，用合适的PCR方法扩增HLA-A类抗原上的多态性区域，产物与芯片上探针杂交。杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断阳性探针，以此确定样品基因型，以及该方法的试剂组成和在临床及科学研究中的应用。芯片试剂盒组分如下检测用片基、信号标记系统、寡核苷酸探针、引物、洗涤液、点样液。
2 根据权利要求
1所述的方法，片基上每孔固相化的探针为寡核苷酸探针，其序列依据第十三届国际组织相容性工作会议报告及相关文献，同时考虑遗传的连锁不平衡，及强脊炎，幼年型糖尿病等与HLA密切相关的遗传病等因素，选择了中国人群基因频率较高的等位基因，根据HLA-A不同基因亚型的独特序列，完成了探针的设计与筛选，最后设计了HLA-A的56条探针制成基因分型芯片，其长度范围在14-30个碱基，一般为18个碱基，其Tm值在满足上述基因中等分辨度分型需要。
3 根据权利要求
1所述的办法，其各种引物是根据HLA-A基因序列特点设计，在HLA-A座位的exon2和exon3区域分别设计上下游引物，为双下游和双上游引物进行嵌套氏PCR，引物长度在18-25个碱基之间，分别用于上述基因的扩增。
4 根据权利要求
书1所述的办法，用于信号显示的信号分子标记是针对HLA-A基因序列扩增的引物。
5 根据权利要求
书4，用于信号显示的信号分子为CY3。
6 根据权利要求
书1所述方法，可应用于医院或血站对人群HLA-A基因所有座位进行分型，为组织配型和干细胞移植提供依据。也可应用于科研单位、法医领域为分析与HLA-A相关的遗传疾病及个人识别提供依据。
专利摘要
根据中国人群HLA－A类常见的基因位点以及临床应用中对分型分辨度的实际需要，设计特异性寡核苷酸中分辨度分型探针，制成基因分型芯片。采用带荧光标记的引物，用合适的PCR方法扩增HLA－A类抗原上的多态性区域，产物与芯片上探针杂交。杂交结果经荧光扫描并用特定软件分析判断阳性探针，以此确定样品基因型，以及该方法的试剂组成和在临床及科学研究中的应用。
文档编号C12Q1/68GK1995381SQ200610013012
公开日2007年7月11日 申请日期2006年1月6日
发明者郭刚, 张瑞, 张镜宇, 梁东春, 王宝利 申请人:天津医科大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan