耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学领域，涉及耦合核酸扩增反应、核酸侵入反应及纳米颗粒 显色反应的封闭式可视化核酸检测新方法。
【背景技术】
[0002] 目前基于对核酸的检测技术已经广泛应用于临床诊断、环境监测以及传染性疾病 的预防与控制等很多方面，例如聚合酶链式反应技术（Polymerase Chain Reaction, PCR) 技术，该技术可以实现模板的指数扩增，放大百万倍，但是这类技术通常由于特异性的限 制，使得不能满足于对一些区分单碱基靶核酸的样本检测，例如，在检测基因突变的样本 时，由PCR发展起来的实时PCR (Real Time PCR，RT-PCR)技术不仅特异性有限，区分度低， 需要专门的仪器设备，而且检测成本也较高。而基于信号放大的核酸侵入反应是依赖于一 种特殊的核酸内切酶的信号扩增反应，该反应不仅特异性好，还具有恒温、反应成本低的优 点，目前已经有一种基于核酸侵入反应和生物纳米金技术相偶联进行分子检测的技术(见 专利"级联侵入信号放大反应结合纳米金-寡核苷酸探针可视化核酸检测方法"，专利申 请号"201110161736. 3")，但由于该技术灵敏度低，仅能检测模板含量为6X IO4拷贝/ μ L 以上的样本，仍不能满足绝大多数临床样本直接检测的要求。因此，在实际样本的检测过 程中，还需要对待测模板进行预先PCR扩增，开管后取出扩增产物，然后再进行核酸侵入反 应和生物纳米金显色反应；但是开管后取出扩增产物极易造成扩增产物的交叉污染，出现 假阳性结果。假阳性结果是临床中绝对应该避免的，为此我们发明了在单管中依次完成扩 增反应、侵入反应和显色反应的方法，无需开管操作，避免了开管造成的扩增产物的交叉污 染。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是针对现有技术的极易造成假阳性结果的不足，提供一种通过控制 反应温度的方式实现核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应以及生物纳米颗粒显色反应 在同一管中依次进行，实现对核酸模板中的特定序列进行闭管比色检测的方法。
[0004] 本发明通过温度控制实现将核酸扩增反应与核酸侵入反应（Invasive reaction) 以及生物纳米颗粒显色反应相偶联依次在同管闭管中进行，利用核酸修饰的纳米颗粒聚集 状态的改变对检测结果进行区分，建立了一种高灵敏度、高特异性、低成本且便捷的可视化 核酸检测新方法。
[0005] 通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米颗粒显示反应，对 核酸模板中的特定序列进行比色检测的方法，反应前加入核酸扩增反应、核酸侵入反应和 生物纳米显示反应所需的成分，通过控制反应温度实现基于三个反应的同管闭管检测核酸 模板；在反应过程中，通过控制温度条件，优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需 的靶序列，接着进行核酸侵入反应切割产生靶序列特异性的核酸片段，最后通过核酸探针 修饰的纳米颗粒（图5)进行杂交反应并对被切割的核酸片段进行比色检测，当待测样本中 存在靶核酸序列时纳米颗粒呈分散状态，否则呈聚集状态；
[0006] 所述的控制反应温度实现核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米显示反应同管 闭管进行，并且优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，要求核酸扩增 反应的最低温度要高于核酸侵入反应的反应温度至少：TC，优选5-KTC ;
[0007] 所述的核酸侵入反应的反应体系包括针对靶核酸特异性的一对探针，核酸5'外切 酶或5' flap内切酶、以及一个发卡探针；
[0008] 所述的靶核酸特异性的一对探针要求与靶核酸杂交后，上游探针3'端必须侵入下 游探针1个碱基，下游探针5'端有一段翘起片段，称为5'flap片段，利用核酸5'flap外切 酶或5' flap内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游双链至少一个碱基形成的 探针-待测核酸特异性结构（图1)，并将下游探针5' flap片段连同被侵入的碱基切断，而 形成的5' flap片段又与发卡探针进行杂交，进一步形成为核酸5' flap外切酶或5' flap 内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游双链的"侵入结构"（图4)，从而将发卡 探针切成两个部分，随着5' flap片段的积累，被切开的发卡探针也进一步积累；
[0009] 所述的下游探针（图2)，其3'和5'端是分别可以与纳米颗粒表面修饰的两种探针 互补的序列，中间部分为模板序列特异的互补序列。
[0010] 所述的发卡探针（图3)，其3'和5'端是分别可以与纳米颗粒表面修饰的两种探针 互补的序列，Btt邻3'端与纳米颗粒表面修饰的探针互补片段的序列与flap片段互补形成 侵入一个碱基的flap-发卡探针特异性侵入结构；被切开的发卡探针能够与所述的两种核 酸探针修饰的纳米颗粒杂交而使纳米颗粒保持分散状态。
[0011] 本发明所述的核酸扩增反应可以是指聚合酶链式反应PCR、核酸环介导等温扩增 反应LAMP、依赖核酸序列的扩增NASBA、恒温指数扩增方法EXPAR、滚环扩增反应RCA、连接 扩增反应LCR、解旋酶依赖的核酸扩增反应HDA，优选聚合酶链式反应进行核酸扩增。
[0012] 本发明所述的通过耦合核酸扩增反应、序列特异性核酸侵入反应和生物纳米金显 示反应，对核酸模板中的特定序列进行比色检测的闭关检测方法，具体技术方案如图6以 及图7所示，优选包括以下步骤 ：
[0013] 1)设计并合成核酸扩增反应使用的核酸模板特异性的扩增引物对，核酸侵入反应 使用的针对靶核酸特异性的一对探针和一个发卡探针(或者一条上游探针、一条两端带有 与纳米颗粒探针互补序列的下游探针)，以及能够与发卡探针(或者与两端带有与纳米颗粒 探针互补序列的下游探针）杂交的两种核酸探针修饰的纳米颗粒；其中，所述的针对靶核酸 特异性的一对探针，要求与靶核酸杂交后，上游探针3'端必须侵入下游探针1个碱基，下游 探针5'端有一段翘起片段，称为5' flap，并且其中下游探针与靶核酸互补区域的解链温度 在核酸5' flap外切酶或5' flap内切酶的酶切反应温度±1°C范围内，而上游探针与靶核 酸互补区域的解链温度要高于核酸5' flap外切酶或5' flap内切酶的酶切反应温度5? IO0C ；
[0014] 2)向同一管中加入包含步骤1)涉及的引物、探针以及核酸5' flap外切酶或 5' flap内切酶在内的核酸扩增反应、核酸侵入反应和生物纳米显示反应的反应体系；
[0015] 3)通过控制核酸扩增反应的最低温度要高于核酸侵入反应的反应温度至少：TC， 实现优先进行核酸扩增反应扩增出核酸侵入反应所需的靶序列，接着进行核酸侵入反应切 割产生靶序列特异性的核酸片段，最后通过核酸探针修饰的纳米颗粒进行杂交反应并对被 切割的核酸片段进行比色检测，具体过程为：
[0016] a)模板序列扩增阶段：通过核酸扩增反应扩增出核酸侵入信号扩增所需要序列长 度的靶核酸；
[0017] b)核酸侵入反应信号转化阶段：所述的靶核酸与所述的靶核酸特异性的一对探针 在核酸侵入反应体系中杂交形成探针-靶核酸特异性结构，反应体系中的核酸5'flap外切 酶或5' flap内切酶会识别所述的探针-靶核酸特异性结构，并将下游探针的5' flap连同 与模板配对的第一个碱基切下，因为所述的酶切反应温度接近下游探针与模板配对部分的 熔解温度，下游探针被切割后会很快与靶核酸分离，没有被切割的完整的下游探针会再次 与靶核酸杂交，而上游探针熔解温度高于反应温度，牢固地结合在靶核酸上，与新杂交的完 整的下游探针再次形成所述的探针-靶核酸特异性结构，进而继续被核酸5'flap外切酶或 5' flap内切酶切割，形成flap片段的积累；而切割形成的flap片段与发卡探针杂交进一 步形成核酸5' flap外切酶或5' flap内切酶能够特异识别DNA双链中上游探针侵入下游 双链的"侵入结构"，从而将发卡探针切成两个部分，随着5' flap片段的积累，被切开的发 卡探针也进一步积累；
[0018] c)核酸修饰纳米颗粒杂交显色阶段：核酸扩增反应和核酸侵入反应结束以后，反 应体系于30-65°C进行两种核酸探针修饰的纳米颗粒与发卡探针杂交；当反应体系中不含 有靶核酸时，不会发生步骤1)的核酸扩增反应和步骤2)的核酸侵入反应，不能将发卡探针 切开导致两种核酸探针修饰的纳米颗粒与发卡探针杂交，从而引起纳米颗粒聚集，结果是 阴性；当反应体系中含有靶核酸时，发生步骤1)的核酸扩增反应和步骤2)的核酸侵入反 应，发卡探针被切开，它们与纳米颗粒中的两种核酸探针杂交，使纳米颗粒保持分散状态， 结果是阳性；也可采用比色法，根据纳米颗粒分散或聚集时在一定波长下最大吸收峰的偏 移从而进行结果判读。
[0019] 当反应体系中为两端带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针时，在反应进行 到步骤2)核酸侵入反应阶段，下游探针与上游探针一起与模板进行互补配对，形成核酸 5'flap外切酶或5'flap内切酶会识别所述的探针-祀核酸特异性结构，在核酸5'flap外 切酶或5' flap内切酶将下游探针切割为两个部分，这种切割后的下游探针随着反应的进 行而积累。当进入步骤3)核酸修饰纳米颗粒杂交显色阶段后，反应体系于30-65°C进行两 种核酸探针修饰的纳米颗粒与之进行杂交反应。若体系中不含有靶核酸时，不会发生步骤 1)的核酸扩增反应和步骤2)的核酸侵入反应，带有与纳米颗粒探针互补序列的下游探针不 会被切开，在杂交反应以后使纳米颗粒聚集，结果是阴性；当反应体系中含有靶核酸时，发 生步骤1)的核酸扩增反应和步骤2)的核酸侵入反应，带有与纳米颗粒探针互补序列的下 游探针被切开，在杂交反应以后纳米颗粒仍然为分散状态，结果是阳性。
[0020] 本发明所述的核酸优选DNA或RNA。
[0021] 本发明所述的核酸扩增反应、核酸侵入反应和纳米颗粒杂交反应的反应体系至少 包含Tris、Na离子、Mg离子、核酸模板扩增酶、核酸5'