种为"红丰"或"市原 虎尾"，反之则否。
[0029] 本发明有益效果主要体现在：本发明分子特异性标记引物可对樱花品种"红丰"和 "市原虎尾"进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能 替代的分子手段。 (四）【附图说明】
[0030] 图1为对樱花品种进行PCR扩增的结果；M为DNA分子量标准；编号8和13分别 为樱花品种"红丰"和"市原虎尾"，扩增出了分子量为466bp的特异DNA条带；其余编号为 其它的樱花品种，未见有400bp多大小的特异DNA条带产生。 (五）【具体实施方式】
[0031] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于 此：
[0032] 实施例1 :
[0033] (1)樱花品种基因组DNA的提取：
[0034] 取待测樱花品种幼嫩叶片O.Olg，加液氮彻底磨碎，基因组DNA的提取采用 SDS-CTAB法，经多次抽提，来提取获得樱花品种的基因组DNA粗提物。DNA粗提物再经 Magabio核酸纯化试剂盒进行纯化（博日Bioer，杭州，中国）后，通过1. 5%的琼脂糖凝胶 电泳和DNA/RNA紫外分光光度计（GeneQuant Pro, GE Healthcare)来检测完整性、纯度及 浓度。0D260/0D280>1. 8的DNA样品用于后续PCR扩增。DNA提取物于-20°C冰箱贮藏备 用。
[0035] (2)设计特异PCR扩增引物，引物对的序列为：
[0036] 上游引物：5，-AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC-3 ，和下游引物： 5' -AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA-3'，由上海生物工程技术有限公司合成。
[0037] (4) PCR 扩增：
[0038] PCR 反应液组成：10XPCR Buffer 2. 5 yL，lOmmol/L dNTPs 2. 5 yL，25mmol/ L MgCl22. 5 μ L，5U/ μ L Taq DNA 酶 0· 2 μ L，IOmM 特异引物对各 I μ L，20ng/ μ L 模板 DNA 3 μ L，ddH20 补足至 25 μ L。
[0039] 扩增反应在TC-XP型扩增仪上进行。扩增条件：95°C预变性3min ;95°C变性40s， 65°C退火40s，72°C延伸2min，共35个循环；最后于72°C补平7min，终止温度为4°C。
[0040] (4)电泳检测：取步骤（3) PCR扩增产物5 yL，与I yL 0. 25 %溴酚兰缓冲液混匀， 点样于1. 5%的琼脂糖凝胶上，于IXTAE缓冲液中，5V/cm电压下电泳，电泳结束后，在含 0. 5 μ g/mL EB的水溶液中染色30分钟，然后在上海培清JS-380A自动凝胶图像分析仪上照 相。
[0041] 按照上述方法，分别对20个樱花品种（编号1?20代表樱花品种依次 为：1、红笠（C. serrulata 'Benigasa'）、2、红华（C. serrulata 'Kouka'）、3、一 叶（C.serrulata 'Hisakura'）、4、福绿寿（C.serrulata 'Contorta'）、5、普贤 象（C.serrulata 'Albo_rosea'）、6、松月（C.serrulata 'Superba'）、7、郁金 (C. serrulata <Grandifora, ) 红丰(Cerasus X sieboldii iBeni - yutaka'）、 9、御衣黄（C. serrulata 'Gioiko'）、10、关山（C. serrulata 'Kanzan'）、11、大提灯 (C.serrulata '0jochin'）、12、八重红枝垂（C.spachiana 'Plena Rosea'）、13、市原虎 尾（C.serrulata 'Albo Plena'）、14、咲耶姬（CerasusXyedoensis 'Sakuyahime'）、 15、朱雀（C.serrulata 'Shujaku'）、16、杨贵妃（C.serrulata 'Mollis'）、17、雨情枝垂 (C. spachiana 'Ujou - shidare'）、18、菊垂楼（C. serrulata 'Plena-pendula'）、19、平野 妹背（C.serrulata 'Imose'）、20、旭山楼（C.serrulata 'Asahiyama'）的PCR 扩增图谱进 行电泳检测，结果见图1。
[0042] 其中仅从编号分别为8和13的樱花品种"红丰"和"市原虎尾"中各扩增出了一 条清晰明亮、稳定的分子量约为400bp多大小的特异DNA条带，而其余编号的樱花品种，未 见有400bp多大小的特殊DNA条带产生，也未有其它非目的条带产生，可见本发明开发出的 分子特异性标记引物用于樱花品种"红丰"和"市原虎尾"的早期鉴定，其稳定性、特异性非 常1?。
【主权项】
1. 樱花品种"红丰"和"市原虎尾"的分子特异性标记引物，所述引物序列如下： 上游引物：5' -AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC-3'， 下游引物：5, -AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA-3,〇
2. -种利用权利要求1所述的分子特异性标记引物对樱花品种"红丰"和"市原虎尾" 进行快速鉴定的方法，所述方法为：提取待测樱花品种叶片的基因组DNA作为模板，以所述 分子特异性标记引物作为扩增引物，进行PCR扩增，对扩增产物进行电泳检测，若电泳结果 出现466bp的特异DNA条带，则待测樱花品种为樱花品种"红丰"或"市原虎尾"，反之则否； 所述分子特异性标记引物序列为： 上游引物：5' -AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC-3'， 下游引物：5, -AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA-3, 〇
3. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述PCR扩增条件如下：95°C预变性3min; 95°C变性40s，65°C退火40s，72°C延伸2min，共35个循环；最后于72°C补平7min，终止温 度为4°C。
4. 如权利要求2所述的方法，其特征在于所述方法如下： (1) 取待测樱花叶片，加液氮磨碎，以SDS-CTAB法提取待测樱花叶片的基因组DNA; (2) 以步骤⑴提取的基因组DNA为模板，以所述分子特异性标记引物作为扩增引物， 进行PCR扩增： PCR扩增体系每25yL组成如下： lOxPCRBuffer 2_5j.iL 10nrmol/LdNTPs 2.5j.lL 25mmol/LMgCU 2.5j.iL 5U/|iLTaqDNA酶 0.2)aL IOjiM上、下游引物 各lfiL 20iig/|iL模板DNA 3(iL ddH20补足至25|aL; PCR扩增条件如下： 95°C预变性3min;95°C变性40s，65°C退火40s，72°C延伸2min，共35个循环；最后于 72°C补平7min，终止温度为4°C; (3) 取步骤（2)扩增产物5yL，与1yL0. 25 %溴酚兰缓冲液混匀，点样于1. 5%的琼 脂糖凝胶上，于1XTAE缓冲液中、5V/cm电压下电泳，电泳结束后EB染色，于自动凝胶图像 分析仪上照相，若电泳结果出现466bp的DNA条带，则待测樱花品种为"红丰"或"市原虎 尾"，反之则否。
【专利摘要】本发明涉及一对特异性高的樱花品种“红丰”和“市原虎尾”的分子特异性标记引物，以及一种能对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速鉴定的方法。所述引物序列如下：上游引物：5′-AGCGGCCGCTACTAAATAGACAGC-3′，下游引物：5′-AGCGGCCGCTAGAAGAAGAACAAA-3′。本发明分子特异性标记引物可对樱花品种“红丰”和“市原虎尾”进行快速的早期鉴别，方法简单、快捷、准确，是表观特征辨别樱花品种所不能替代的分子手段。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104611330
【申请号】CN201510024037
【发明人】徐梁, 李海波, 杨少宗, 魏海龙, 赵庆杰, 柳新红
【申请人】浙江省林业科学研究院
【公开日】2015年5月13日
【申请日】2015年1月16日