一种肝癌基因ndc80及其应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及生物基因工程技术领域，具体涉及一种肝癌基因NDC80及其应用。
【背景技术】
[0002]原发性肝癌(HCC)是常见的恶性肿瘤，其发生率和死亡率分别占全球恶性肿瘤的第5位和第3位1，占我国恶性肿瘤的第3位和第2位，在部分地区和农村其死亡率已经上升到第一位。在全球范围内其发病率逐年上升，每年约新增加60余万病例，其中50%以上病例发生在中国。肝炎病毒感染是肝癌的主要危险因素，高达80%的肝癌归因于乙肝病毒或丙型肝炎病毒感染。在我国，则主要是乙肝病毒感染为主，90%肝癌患者有HBV感染或者HbsAg阳性。但是，目前对于乙肝病毒导致肝细胞癌变的具体机制并不清楚，因此，寻找并确定一种表达肝癌的基因，对于研究肝细胞癌变的具体机制、制定预防或治疗肝癌的方法有重要意义。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种肝癌基因。
[0004]本发明的另一个目的是提供一种肝癌基因的应用。
[0005]为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的:
一种肝癌基因NDC80，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。该基因的登录号为NC_000018.10。
[0006]发明人研究发现乙肝病毒感染肝细胞后，导致NDC80上调，上调后NDC80进一步使乙肝病毒继续扩增，从而形成正反馈，最终，高表达的NDC80促使肝细胞增殖癌变，引起肝癌发生。因此，本发明首次确定NDC80是乙肝病毒感染导致肝癌发生的关键因子。
[0007]在确定NDC80基因为乙肝病毒感染导致肝癌发生的关键因子后，本发明同时保护NDC80基因在作为预防或治疗乙肝病毒性肝癌的基因靶点中的应用。
[0008]进一步地，本发明还要求保护一种防或治疗乙肝病毒性肝癌的制剂，该试剂含有定量的抑制NDC80基因的抑制剂。
[0009]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明通过研究首次发现NDC80是乙肝病毒感染导致肝癌发生的关键因子。首先，乙肝病毒感染肝细胞后，导致NDC80上调，上调后NDC80进一步使乙肝病毒继续扩增，从而形成正反馈，最终，高表达的NDC80促使肝细胞增殖癌变，引起肝癌发生。该基因有助于进一步了解癌症机制，为肝癌的防治提供新思路及策略。
【附图说明】
[0010]图1.相对正常肝组织，癌基因NDC80在原发性肝癌(HBV-)中表达上调，在原发性肝癌(HBV+)上调更加明显。
[0011]图2.干扰NDC80能抑制乙肝病毒活性。
[0012]图3.干扰NDC80能明显抑制肝癌细胞的增殖。
【具体实施方式】
[0013]下面结合说明书附图和具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的简单修改或替换，均属于本发明的范围，若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
[0014]实施例中所述HBV阴性肝癌是指非乙肝病毒性肝癌，HBV阳性肝癌是指乙肝病毒性肝癌。
[0015]实施例1
一、免疫组织化学染色:分别对正常肝组织、HBV阴性肝癌组织、HBV阳性肝癌组织进行染色观察，详细步骤如下:
1.标本来源:分别从正常肝组织、HBV阴性肝癌组织、HBV阳性肝癌组织处收集得到用石蜡包埋的组织块，在显微镜下用薄片切片机将所有的组织块切成4_的薄片，制成玻片；
2.脱蜡、水化:组织薄片在二甲苯中脱蜡后，再依据标准操作步骤利用分级的酒精(无水、95%、70%)将其水化；
3.抗原修复:将组织浸泡在EDTA(pH=8.0)中，在121°C下高压蒸汽处理5min，再用PBS冲洗3次，每次5min ；
4.灭活酶:将经PBS冲洗后的组织放入3%的过氧化氢中，在室温下孵育15min，以阻断内源性过氧化物酶的活性；
5.抗原-抗体反应:在每张组织薄片上滴加一抗(以含有0.5%的BSA的PBS为稀释剂，NDC80抗体(sc-135934)按照1:100稀释)，在4°C下孵育过夜，然后用缓冲液冲洗，除去游离抗体；
6.滴加二抗试剂(生物素化二抗工作液)，加PBS反应30min；
7.使用试剂盒显色；
8.与苏木精进行对比染色，再依次序在酒精和二甲苯中脱水；
9.以PBS代替一抗作为阴性对照。
[0016]染色结果见图1中的A图，由免疫组织化学染色结果可知:正常肝组织很少表达NDC80蛋白，HBV阴性肝癌组织表达中等，HBV阳性肝癌组织表达最多。
[0017]二、Western Blot 分析
利用商品化的试剂盒提取正常肝组织，HBV阴性肝癌组织和HBV阳性肝癌组织的蛋白，提取步骤按照试剂盒说明操作，粗略步骤如下:
1.将正常肝组织，HBV阴性肝癌组织和HBV阳性肝癌组织剪碎后置入裂解液中进行富集(HBV阳性肝癌组织设为实验组，HBV阴性肝癌组织，正常肝组织设为对照组，)，加入
0.5mM原钥;酸钠、ImM PMSF、lmg/ml抑肽酶、2ug/ml亮抑肽酶；
2.将裂解物于4°C下HOOOrpm离心1min；
3.将从癌症或非癌症组织中匀浆提取的组织样品加入到缓冲液中，加入0.2mM PMSF,lug/ml抑肽酶、lug/ml亮抑肽酶；
4.BCA试剂盒测定步骤3得到的各种上清液的蛋白浓度，并加入SDS-PAGE凝胶电泳进行 western blot 实验。
western blot检测结果见图1中的B图，由western blot检测结果可知:正常肝组织很少表达NDC80蛋白，HBV阴性肝癌组织表达中等，HBV阳性肝癌组织表达最多。
[0018]三、qRT-PCR定量分析
利用商品化的RNA提取试剂盒分别提取正常肝组织、HBV阴性肝癌组织、HBV阳性肝癌组织的RNA，然后用商品化的RT-PCR试剂盒定量分析各种组织的RNA，检测RNA含量所用PCR引物如下:
F:5’ -CCTCTCCATGCAGGAGTTAAGA-3’ ；
R:5’ -GGTCTCGGGTCCTTGATTTTCT-3’ ；
GAPDH-F:5， -GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3，；
GAPDH-R-R:5’ -GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’ ；
RT-PCR的操作步骤按照RT-PCR试剂盒操作进行，检测结果见见图1中的C图，由RT-PCR检测结果可知:正常肝组织很少表达NDC80 mRNA, HBV阴性肝癌组织表达中等，HBV阳性肝癌组织表达最多。
[0019]由实施例1中的3项检测结果可知:相对正常肝组织，NDC80基因在原发性肝癌(HBV-)中表达上调，在原发性肝癌(HBV+)上调更加明显。
[0020]实施例2
本实施例用到H印G2.2.15细胞和shNDC80细胞共2种细胞，实验组为转染了 siRNA的H印G2.2.1.5细胞(简称shNDC80细胞)，对照组为H印G2.2.1.5细胞。
[0021]一、乙肝病毒DNA和cccDNA的检测
1、乙肝病毒DNA的检测:分别收集培养96h的H印G2.2.15细胞和shNDC80细胞以及其培养上清液；利用商品化的DNA提取试剂盒分别提取2种细胞的DNA，用RT-PCR检测2种HBV感染细胞的DNA。PCR检测引物如下:
HBV-DAN-F:5，-ATGGAGAACACAACATCAGG-3，，
HBV-DNA-R:5’ -GAGGCATAGCAGCAGGATG-3’ ；
GAPDH-F:5，-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3，，
GAPDH-R-R: 5’ -GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3’。
[0022]检测结果见图2中的A图。
[0023]2、乙肝病毒cccDNA的检测
Cl)用PBS冲洗两种细胞，4°C条件下，将两种细胞分别在裂解液(50mM Tris, 10MmNaCl,0.l%Tr1n X_100，5mM MgCl2, ρΗ8.0)中裂解 1min ；
(2)在4°C下，离心2min，将细胞核从270g细胞质中分离；
(3)附加型DNA按照商品化的试剂盒操作从细胞核中提取；
(4)没有链酶蛋白酶的条件下，细胞在裂解液中裂解，另加0.25ml 2.5M的KCl沉淀得到蛋白质-洗涤液复合物；
(5)摇晃以混合溶菌产物，离心除去细胞DNA；
(6)上清液中的病毒性cccDNA从等体积的苯酚中提取；
(7)HBV cccDNA用一种新的方法进一步净化。(该方法通过RT-PCR对HBV cccDNA进行定量) (8)净化后的HBV cccDNA通过RT-PCR检测，PCR引物为:
HBV-cccDNA-F:5，-GTCTGTGCCTTCTCATCTGCC-3，,
HBV-cccDNA-R:5，-ACAGCTTGGAGGCTTGAACAG-3，
之后，按照RT-PCR试剂盒操作进行目标RNA的定量检测。
[0024]乙肝病毒的DNA和cccDNA的检测结果见图2中的A图，由图A结果分析可知，在H印G2.2.15 shNDC80细胞系中，干扰NDC80使RNA水平处于低表达。
[0025]二、HBsAg、HBcAg的检测:通过免疫组织化学染色实验间接分析H印G2.2.1.5细胞和shNDC80细胞的HBsAg和HBcAg。具体步骤如下:
1.在4°C下，用4%多聚甲醛将转染细胞固定20min，在TritonX-100中通透；
2.在37°C下，用含有10%山羊血清的PBS孵化细胞；
3.在4°C下，用含有HBsAg(BM0064)或HBcAg(BM0060)的特定的鼠类单克隆抗体孵化细胞过夜；
4.滴加二抗试剂(生物素化二抗工作液)Jppcs30min ；
5.使用试剂盒显色；
6.与苏木精进行对比染色，再依次序在酒精和二甲苯中脱水；
7.以PBS代替一抗作为阴性对照。
[0026]染色结果见图2中的B图。
[0027]实施例3 一、细胞生长曲线
1.将H印G2.2.15细胞和shNDC80细胞分别用0.25%的胰蛋白酶消化，制成单细胞悬液，转染了 siRNA的H印G2.2.1.5细胞为实验组，未转染siRNA的H印G2.2.1.5为对照组；
2.用Freshney计数板对存活细胞计数:细胞浓度调整至lxl05/ml,即Iml细胞中大约有IxlO5个细胞,置于12孔板中的3个孔内；
3.分别于24h、48h和72h后对存活细胞进行计数，并用平均值绘制细胞生长曲线。
[0028]结果见图3中的A图。
[0029]二、细胞活性测定
用MTS含量测定不同时间点的细胞活性:在96孔托盘中，通过MTS含量定量测定细胞活性。96孔托盘中，细胞密度为I X 130培养24小时后，加入测试药物(测试药物为MTT，全称为3- (4，5_ 二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名:噻唑蓝)，在37°C下，将培养液孵化不同的时间(0h，24h，48h，72h)。被治疗的细胞以1:10的比例浸在MTS试剂中，在培养基中培养4h。每个孔的吸收值用酶标仪测定，吸收波长设定为490nm。每个样品测定3次，做三次平行实验，并绘制扩散曲线。
[0030]测定结果见图3中的B图，从图B中可以看出，在shNDC80细胞系中，肝癌细胞增殖的数量很少，活性很低。
[0031]由实施例1-3的结果可知，NDC80是乙肝病毒感染导致肝癌发生的关键因子，该基因有助于进一步了解癌症机制，为肝癌的防治提供新思路及策略。
【主权项】
1.一种乙肝病毒性肝癌基因NDC80，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。
2.权利要求1所述NDC80基因在作为预防或治疗乙肝病毒性肝癌的基因靶点中的应用。
3.一种防或治疗乙肝病毒性肝癌的制剂，其特征在于，含有定量的抑制NDC80基因的抑制剂。
【专利摘要】本发明涉及生物基因工程技术领域，具体公开了一种肝癌基因NDC80及其应用。本发明研究发现乙肝病毒感染肝细胞后，导致NDC80上调，上调后NDC80进一步使乙肝病毒继续扩增，从而形成正反馈，最终，高表达的NDC80促使肝细胞增殖癌变，引起肝癌发生。所以，本发明首次确定NDC80是乙肝病毒感染导致肝癌发生的关键因子，该基因有助于进一步了解癌症机制，为肝癌的防治提供新思路及策略。
【IPC分类】C12N15-12, A61K45-00, A61P35-00
【公开号】CN104673801
【申请号】CN201510072049
【发明人】刘波, 姚志成, 杨扬, 胡昆鹏, 黄河, 许石磊, 王庆亮
【申请人】中山大学附属第三医院
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2015年2月12日