一种含有藻类的水中“两虫”的富集、纯化方法及其含量测定方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及的是一种水中检测技术领域的方法，具体涉及一种含有藻类的水中隐 孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的富集、纯化方法以及其在含藻水中含量的测定方法。
【背景技术】
[0002] 隐孢子虫和贾第鞭毛虫(简称"两虫"）是两种寄生于人和动物体内的致病性原 生动物，近年来国外出现了多次由于水中"两虫"所导致的介水疾病的暴发，其危害已经 引起了广泛的重视。"两虫"作为两种重要的病原微生物已经列入《生活饮用水卫生标准》 (GB5749-2006)，明确规定其限值〈1个/10L。
[0003] 由于水中"两虫"的含量一般较低，现有对"两虫"的检测通常需要经过浓缩富 集、分离纯化及染色和镜检多个检测步骤完成。其中最为常用的检测方法是采用美国的 EPA1623方法("EPA1623方法"是由美国国家环保局制定的用于测定水中隐孢子虫和贾第 鞭毛虫的标准方法)。我国标准的检测方法（GB/T5750. 12-2006)参照美国环保局（USEPA) 制定的方法（815-R-05-002)，滤囊/滤芯富集结合免疫磁分离和免疫荧光染色显微观察。 然而由于专用的滤囊/滤芯以及免疫磁珠分离试剂盒，检测成本昂贵，并不利于日常检测 中的规模化推广。
[0004] 日本对检测环境水样中的"两虫"方法进行了改进，用膜过滤-丙酮溶解这一操作 步骤优替代1623中的滤筒/滤囊过滤，避免了洗脱过程中"两虫"的流失，提高了回收率。 然而在水源水中藻类浓度较高条件下，无论采用滤囊/滤芯或膜过滤的方式进行浓缩，往 往需要多个滤囊/滤芯或滤膜进行，不仅操作上麻烦，而且实验耗费较大；同时由于得到过 多的沉淀，不利于隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊的进一步分离纯化，导致回收率不高。但 是，藻类数量繁多的情况下，特别在夏秋季，有的水源水每毫升藻类数量可达千万以上，是 "两虫"的千万倍，需要通过多个滤囊/滤芯或滤膜才能完成浓缩富集，有些藻类(例如铜绿 微囊藻)和"两虫"的大小、形状非常相近，后续的分离纯化难度大，容易导致回收率过低，甚 至还能自发荧光，产生藻类掩蔽效应，干扰"两虫"镜检，对"两虫"含量通常较低的水源水 检测造成很大干扰。因此有必要针对高藻水条件下开发一种操作方便，且成本不高的富集 及分离纯化方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于针对上述现有技术中存在的问题和不足，提供一种含有藻类的 水中的隐孢子虫卵囊和贾第鞭毛虫孢囊检测回收率的富集、分离、纯化方法及其含量的检 测方法，本发明方法中"两虫"的回收率高，背景杂质干扰少，测定结果准确，同时本发明不 需要昂贵的仪器设备、耗材，操作简便，达到了降低测试成本的目的。
[0006] 为实现本发明的目的，本发明一方面提供一种含有藻类的水中隐孢子虫和贾第鞭 毛虫的富集、纯化方法，包括如下顺序进行的步骤：
[0007] I)加压处理
[0008] 对含有藻类的水进行加压处理，然后静置放置，获得上清液；
[0009] 2)浓缩、富集处理
[0010] 首先，采用醋酸纤维滤膜对上清液进行过滤；接着将过滤后醋酸纤维滤膜和滤膜 截留物加入到丙酮中，溶解、分散，获得丙酮溶解-分散混合物；然后对丙酮溶解-分散混合 物进行离心处理，收集沉淀，获得"两虫"富集沉淀；
[0011] 3)分离、纯化处理
[0012] 向"两虫"富集沉淀中加入磷酸盐-吐温缓冲溶液，混匀，制成"两虫"悬浮液，接 着向悬浮液中加入Percoll-蔗糖介质，然后进行密度梯度离心处理，离心混合液分为3层， 取中间层，即得纯化的隐孢子虫和贾第鞭毛虫。
[0013] 其中，步骤1)中所述含藻水中藻类的浓度< IX IO8个藻类细胞/升，即每IL含 藻水中含有的藻类细胞的个数< IXIO8个藻类细胞。
[0014] 特别是，所述含藻水中藻类的浓度优选为5X IO7~I X IO8个藻类细胞/升，即每 IL含藻水中含有5X IO7~IX IO8个藻类细胞。
[0015] 特别是，所述藻类为微囊藻。
[0016] 尤其是，所述藻类为铜绿微囊藻。
[0017] 其中，步骤1)中所述加压处理过程中相对压力为0· 7-1. OMPa，优选为 0. 8-0. 9MPa ;加压处理时间为5-20min，优选为5-15min，进一步优选为lOmin。
[0018] 特别是，所述静置放置处理的时间彡lOmin，优选为10-20min。
[0019] 特别是，将含有藻类的水放置于耐压容器内，进行所述的加压处理。
[0020] 尤其是，所述的耐压容器选择加压釜。
[0021] 其中，步骤2)中所述离心处理包括如下处理步骤：
[0022] 2A)将丙酮溶解-分散混合物进行离心处理，去除上清液，获得丙酮溶解-分散混 合物离心沉淀物；
[0023] 2B)向丙酮溶解-分散混合物离心沉淀物中加入乙醇和PBS缓冲溶液，混合后获得 乙醇-PBS缓冲混合液，对乙醇-PBS缓冲混合液进行离心处理，去除上清液，获得"两虫"富 集沉淀。
[0024] 特别是，还包括步骤2A-1)，将步骤2A)离心处理后的上清液加入到水中，产生白 色絮体，则继续向离心沉淀物中加入丙酮，溶解，混合均匀后再进行离心处理，直至离心处 理后的上清液加入到水中无白色絮体形成为止。
[0025] 特别是，步骤2B)中丙酮溶解-分散混合物离心沉淀物与乙醇的体积之比为 1:5-15,优选为1:9-10,进一步优选为1:10 ;丙酮溶解-分散混合物离心沉淀物与PBS缓冲 溶液的体积之比为1 :50-75,优选为1 :62-69。
[0026] 尤其是，所述乙醇选择质量百分比浓度为75%_95%的乙醇。
[0027] 尤其是，步骤2B)中所述PBS缓冲溶液(磷酸缓冲溶液）按照如下步骤制备而成：
[0028] 2B-1)按照如下用量备料（以IL水量计）
[0029] NaCl 8.0 g Να,ΗΡ〇Γ?2Η；>0 2.9 g KCI 0.2 g KH2PO4 0.2 g
[0030] 2Β-2)将上述原料加入纯水中，搅拌溶解均匀后定容至lOOOmL，调节pH到 7. 2-7. 4,制得磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲溶液)。
[0031] 特别是，步骤2)中所述离心处理过程中保持温度为15-25°C，优选为20°C。
[0032] 尤其是，离心处理过程中离心力为1000_2000g，优选为1050g。
[0033] 其中，步骤3)中所述磷酸盐-吐温缓冲溶液按照如下步骤制备而成：
[0034] 3A)按照如下用量备料（以IL水量计）
[0035] NaCl 8,0 g Na-HjjOi 2.9 g KCl 0.2 g KH2PO4 0.2 g
[0036] 3B)将上述原料加入到纯水中，搅拌溶解均匀后定容至1000 mL,调节pH到 7. 2-7. 4,制得磷酸盐缓冲溶液（PBS缓冲溶液）；
[0037] 3C)向磷酸盐缓冲溶液中加入吐温80,搅拌混匀，即得，其中每IOOmL磷酸盐缓冲 溶液中加入〇. 1-0. 2mL的吐温80。
[0038] 特别是，步骤3C)中每IOOmL磷酸盐缓冲溶液中加入0.1 mL的吐温80。
[0039] 其中，步骤3)中所述"两虫"富集沉淀与所述磷酸盐-吐温缓冲溶液的体积之比 为1:10-30,优选为1:12-20,进一步优选为1:20。
[0040] 特别是，还包括将所述"两虫"富集沉淀和所述磷酸盐-吐温缓冲溶液的混合物进 行搅拌均匀或置于涡旋震荡混合器中，振荡混合2-5min，制成混合均匀的"两虫"悬浮液（即 隐孢子虫和贾第鞭毛虫悬浮液)。
[0041] 其中，步骤3)中所述Percoll-鹿糖介质的密度为1. 10-1. 15g/cm3,优选为I. 12g/ cm3。
[0042] 特别是，每100ml所述Percoll-鹿糖介质含有45mL Percoll液，8. 55g鹿糖和余 量的水。
[0043] 尤其是，所述Percoll-鹿糖介质按照如下步骤制备而成：将45mL Percoll液， 8. 55g蔗糖，溶解定容到IOOmL纯水中，混匀。
[0044] 特别是，所述Percoll-蔗糖介质与所述"两虫"悬浮液的体积之比为1:1-2. 5,优 选为1:2。
[0045] 尤其是，所述Percoll-蔗糖介质从所述"两虫"悬浮液的底部加入后，再进行所述 的离心处理。
[0046] 其中，步骤3)中所述离心处理过程中离心力为1000_2000g，优选为1050g。
[0047] 特别是，离心处理过