异源和同源纤维素酶表达体系的制作方法
【专利说明】异源和同源纤维素酶表达体系
[0001] 本申请是发明人于2008年6月5日提交的题为"异源和同源纤维素酶表达体系" 的中国专利申请200880101989. 8号的分案申请。
[0002] 与相关申请的交叉参考
[0003] 本发明要求2007年6月8日提交的美国临时申请系列号No. US60/933, 894的权 益和优先权，所述临时申请完整引入本文作为参考。
[0004] 关于联邦政府赞助研宄的声明
[0005] 通过与美国能源部（United States Department of Energy)的主合同 No. DE-AC36-99G010337 下与国家可再生能源实验室（National Renewable Energy Laboratory)的分合同No. ZC0-0-30017-01，为本工作的部分提供资金。因此，美国政府可 对本发明具有某些权利。
[0006] 引言
[0007] 纤维素和半纤维素是光合作用产生的最大量的植物材料。它们可以被大量微生物 降解并用作能量来源，所述微生物包括细菌、酵母和真菌，它们产生能够将多聚体底物水解 为单体糖的胞外酶。
[0008] 纤维素酶是水解纤维素（β-1，4-葡聚糖或β D-糖苷键）导致形成葡萄糖、纤 维二糖、纤维寡糖等的酶。纤维素酶传统上被分为三个主要的类别：内切葡聚糖酶（EC 3. 2. L 4) ( "EG"），外切葡聚糖酶或纤维二糖水解酶（EC3. 2. L 91) ( "CBH"）和β -葡糖苷 酶（[β]-?-葡萄糖苷葡萄糖水解酶；EC3. 2. 1.21)( "BG"）。内切葡聚糖酶主要作用于纤 维素纤维的无定形部分，而纤维二糖水解酶也能够降解结晶纤维素。为了有效地将微晶纤 维素转化为葡萄糖，需要包含来自CBH、EG和BG分类中每一类的组分的完整纤维素酶体系， 分离的组件在水解结晶纤维素中效率较低（Filho等，Can. J. Microbiol. 42:1-5, 1996)。为 了工业规模的纤维素酶生产，在丝状真菌中表达这些多组件纤维素酶体系纤维素酶会是有 利的。
[0009] 概述
[0010] 因此，本发明提供了表达异源和同源多肽的组合的丝状真菌，包含异源和同源多 肽的组合的多肽混合物，和产生多肽混合物的方法。
[0011] 在一些实施方案中，本发明提供了丝状真菌，其包含一种或多种编码两种或更多 异源多肽的多核苷酸，和编码同源多肽的多核苷酸。该丝状真菌能够表达异源和同源多肽， 所述异源和同源多肽一起形成功能性混合物。
[0012] 在一些实施方案中，本发明提供了包含本发明的丝状真菌群体的培养基。
[0013] 在一些实施方案中，本发明提供了多肽混合物，其包含两种或更多的异源多肽和 同源多肽。该多肽混合物可得自本发明的丝状真菌。
[0014] 在一些实施方案中，本发明提供了生产纤维素酶混合物的方法。该方法包括从本 发明的丝状真菌中获得包含两种或更多异源多肽和同源多肽的的多肽混合物。在一些实施 方案中，异源多肽是外切纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶，同源多肽是外切纤维二糖水解 酶。异源外切纤维二糖水解酶和同源外切纤维二糖水解酶可以，但不必须是相同的外切纤 维二糖水解酶成员。
[0015] 本发明的这些特性和其他特性在下文中公开。
[0016] 附图概述
[0017] 熟练的技术人员会理解，附图仅用于阐述的目的。附图不旨在以任何方式限制本 发明的范围。
[0018] 图1提供了包含2656个碱基的异源纤维素酶融合构建体的核苷酸序列（SEQ ID ΝΟ:1)〇
[0019] 图2提供了以图1的核酸序列为基础预测的纤维素酶融合蛋白的氨基酸序列（SEQ ID NO:2)〇
[0020] 图3A-F展示了含有El催化结构域的pTrex4载体的核苷酸序列（SEQ ID NO: 14)。
[0021] 图4展示了里氏木霉（Τ· reesei)表达载体pTrex3g的质粒图谱。
[0022] 图5A展示了用于制造示范性三部分菌株（tripartite strain)的表达载体 pTrex3g-Hgrisea_cbhl〇
[0023] 图5B-E提供了图5A的表达载体的核苷酸序列（SEQ ID NO:7)。
[0024] 图6展示了被转化进cbhl缺失菌株中用于创建4-部分菌株的三条DNA片段。
[0025] 图7A提供了表达经改造的CBHI蛋白质的多核苷酸从起始密码子到终止密码子的 核苷酸序列（SEQ ID NO:8)。
[0026] 图7B提供了经改造的CBHI蛋白质的序列（SEQ ID N0:9)。CBHI信号序列加有王 划线。
[0027] 图 8A 展示了 cbhl 表达载体 pTrex3g_cbhl。
[0028] 图8B-F提供了表达载体pTrex3g-cbhl的核苷酸序列（SEQ ID NO: 10)。
[0029] 图9A提供了表达经改造的CBHI蛋白质的多核苷酸从起始密码子到终止密码子的 核苷酸序列（SEQ ID NO: 11)。
[0030] 图9B提供了经改造的CBHI蛋白质（SEQ ID NO: 12)的氨基酸序列。信号序列加 有下划线。
[0031] 图 10A 展示了 cbhll 表达载体 pExp-cbhll。
[0032] 图10B-G提供了表达载体pExp-cbhll的核苷酸序列（SEQ ID NO: 13)。
[0033] 多个实施方案的详述
[0034] 接着将仅通过参照的方式，使用以下的定义和实施例详细描述本发明。除非在本 文中另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所述领域的普通技术人员通 常所理解的相同的含义。数值范围包括定义该范围的数值。本文提供的标题不是多个方面 或实施方案的限制，所述限制可以由作为整体的本申请文件具有。因此，下文紧接着定义的 术语由作为整体的本申请文件更详尽地定义。
[0035] 在本文中使用时，术语"多肽"表示由通过肽键相连的氨基酸残基单链组成的化合 物。在本文中使用时，术语"蛋白质"可与术语"多肽"互换使用。
[0036] 术语"核酸"和"多核苷酸"可互换使用，并且包括单链或双链的DNA、RNA、cDNA及 其化学修饰。因为遗传密码子是简并的，所以可以使用多于一种密码子编码具体的氨基酸， 并且本发明包括编码具体氨基酸序列的所有多核苷酸。
[0037] 关于细胞、核酸、蛋白质或载体使用时，术语"重组体"表示已通过引入异源核酸或 蛋白质或者改变天然的核酸或蛋白质修饰了该细胞、核酸、蛋白质或载体，或者所述细胞来 自被如此修饰的细胞，或者蛋白质在非天然的或经遗传修饰的环境中表达，例如在用于原 核或真核体系的表达载体中表达。因此，例如，重组细胞表达在细胞的天然（非重组）形式 中不存在的核酸或多肽，或者表达以其他方式异常表达、表达不足、超量表达或完全不表达 的天然基因。
[0038] 关于多核苷酸或多肽的术语"异源的"表示具有下述序列的多核苷酸或多肽，所述 序列不天然存在于宿主细胞中。在一些实施方案中，多肽是商业上重要的工业蛋白质，在一 些实施方案中，异源多肽是治疗性蛋白质。该术语旨在包括由天然基因、突变的基因和/或 合成的基因编码的蛋白质。
[0039] 关于多核苷酸或多肽的术语"同源的"表示具有下述序列的多核苷酸或多肽，所述 序列在宿主细胞中天然序列相同。
[0040] 在本文中使用时，"融合核酸"包括有效连接在一起的两条或更多条核酸。核酸可 以是DNA，基因组DNA和CDNA均可，或为RNA，或为RNA和DNA的杂合体。编码多肽序列全 部或部分的核酸可以用于构建融合核酸序列。在一些实施方案中，使用编码全长多肽的核 酸。在一些实施方案中，可以使用编码部分多肽的核酸。
[0041] 术语"融合多肽"是指包含至少两个分开且不同区域的蛋白质，所述区域可来自于 或不来自于相同的蛋白质。例如，与目的蛋白质连接的信号肽可以被称作融合多肽或融合 蛋白质，其中所述信号肽通常不与所述目的蛋白质结合。
[0042] 术语"回收的"、"分离的"和"分开的"在本文中可互换使用，表示从与之天然结合 的至少一种组分中取出的蛋白质、细胞、核酸、氨基酸等。
[0043] 在本文中使用时，术语"基因"表示涉及生产多肽链的多核苷酸（例如DNA区段）， 其可包含或不包含编码区之前和之后的区域，例如5'非翻译区（5'UTR)或"前导"序列和 3'UTR或"非转录尾区"序列，以及个体编码区段（外显子）之间的间隔序列（内含子）。 [0044] 在本文中使用时，术语"启动子"表示功能是指导下游基因转录的核酸序列。启动 子通常应适合于在其中表达靶基因的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调节核酸序列 (也称作"控制序列"）一起是表达给定基因所必需的。通常，转录和翻译调节序列包括但 不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列，和增强 子或激活子序列。
[0045] 在本文中使用时，术语"有效连接的"表示转录核酸以使得转录引发的方式相对于 编码序列放置。通常，这应表示启动子和转录引发或起始序列位于编码区的5'。转录核酸 通常会适合于用于表达蛋白质的宿主细胞。本领域中已知用于多种宿主细胞的大量适合的 表达载体类型和合适的调节序列。
[0046] 在本文中使用时，术语"表达"表示以基因的核酸序列为基础生产多肽的过程。该 过程包括转录和翻译二者。
[0047] 在本文中使用时，术语"载体"表示被设计为向一个或多个细胞类型中引入核酸的 多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等等。
[0048] 在本文中使用时，术语"表达载体"表示能够将异源DNA片段掺入外来细胞中并在 其中表达的载体。可商业获得许多原核和真核表达载体。
[0049] 在本文中使用时，术语"DNA构建体"、"转化DNA"和"表达载体"可互换使用，表示 用于将序列引入宿主细胞或生物中的DNA。可以通过PCR或者本领域技术人员已知的任何 其他合适的技术，例如使用Sambrook等中所述的标准分子生物学方法，体外产生DNA。另 外，表达构建体的DNA可以是人工合成的，例如是化学合成的。DNA构建体、转化DNA或重组 表达盒可以被掺入质粒、染色体、染色体外元件、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。 通常，表达载体、DNA构建体或转化DNA的重组表达盒部分在其他序列中包含要被转录的核 酸序列和启动子。在优选的实施方案中，表达载体能够将异源DNA片段整合进宿主细胞中 并在其中表达。
[0050] 在将核酸序列插入细胞中的语境中，术语"引入的"表示"转染"或"转化"或"转 导"，并且包括涉及将核酸序列引入真核或原核细胞中，在所述细胞中核酸序列可以被掺入 细胞的基因组中（例如染色体、染色体外元件、质粒、质体或线粒体DNA)，转化进自主复制 子中，或者被瞬时表达（例如转染的mRNA)。
[0051] 术语"宿主细胞"表示下述细胞，其含有载体，并且支持表达构建体的复制和/或 转录或转录和翻译（表达）。
[0052] 在本文中使用时，术语"培养"表示在液体、半