一种鸡胚分离培养血清3型鸭甲型肝炎病毒的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种鸡胚分离培养血清3型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3)的方法，属于微 生物技术领域。
【背景技术】
[0002] 鸭甲型肝炎病毒（duck hepatitis A virus, DHAV)属微RNA病毒科成员（陆承 平.兽医微生物学.（第五版）北京：中国农业出版社，2012, 460-466.)，是引致雏鸭肝炎的 最重要病原，主要感染4周龄以下的雏鸭发生以肝脏出血为特征的急性肝炎，发病急、传播 快、发病率和死亡率可达90%以上。由DHAV引起的鸭肝炎自上世纪五十年代在美国被发现 以后，迅速在世界养鸭地区爆发和蔓延，我国黄均建（黄均建.小鸭病毒性肝炎研宄，上海 农业科学院畜牧兽医研宄所单行本，1963.) 1963年首次报道了上海地区鸭场爆发此病，王 平等（王平等.北京小鸭病毒性肝炎的研宄.北京大学学报（自然科学版），1980,1 :55) 于1980年首先在北京地区发病鸭场分离到病毒，之后我国养鸭地区均有本病的发生和流 行。随着近几年来鸭肝炎弱毒活疫苗和高免卵黄抗体的研制成功及临床应用，使本病在很 大程度上得到较好的控制。
[0003] 1992年 Sandhu等（Sandhu，T. S.，B. W. Calnek，and L. Zeman. 1992. Pathologic and serologic characterization of a variant of duck hepatitis type I virus. Avian Dis 36:932-936.)报道鸭肝炎病毒发生变异现象，2002年苏敬良等（苏敬良等.新型鸭 肝炎病毒的分离及初步鉴定.中国兽医科技，2002, 1:15-16.)报道北京和广西等地区免 疫过鸭肝炎疫苗或注射过鸭肝炎高免卵黄抗体的鸭群仍然发生鸭肝炎，并且证明分离到的 鸭肝炎病毒与经典的鸭肝炎病毒无血清学交叉反应，故暂称新型鸭肝炎病毒。2007年，台 湾学者 Tseng (Tseng C. H.，Tsai H. J. , Molecular characterization of a new serotype of duck hepatitis virus. Virus Res, 2007, 126:19-31.)和韩国学者Kim(Kim M.C·，Kwon Y. K. ,Joh S.J. , et al. Recent Korean isolates of duck hepatitis virus revealed the presence of a new geno-and serotype when compared to duck hepatitis virus typel type strains. Arch Virol. 2007,152:2059-2072.)分别报道分离到不同于经典的鸭肝炎 病毒的新型鸭肝炎病毒，通过分子生物学和血清学鉴定，表明台湾和韩国分离的新型鸭肝 炎病毒均属DHAV，但它们之间也存在着明显的血清学差异，所以现在已明确将DHAV分为3 个血清型（陆承平.兽医微生物学.（第五版）北京：中国农业出版社，2012, 460-466.)， 并将经典的鸭肝炎病毒、台湾新型鸭肝炎病毒和韩国新型鸭肝炎病毒分别归属到血清1型 鸭甲型肝炎病毒（DHAV-I)、血清2型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-2)和血清3型鸭甲型肝炎病 毒（DHAV-3)之中。通过分子生物学鉴定和血清学试验证实，我国大陆自2002年至今所分 离鉴定的新型鸭肝炎病毒株与韩国新型鸭肝炎病毒高度同源，属血清3型鸭甲型肝炎病毒 (DHAV-3)〇
[0004] 众所周知，我国是养鸭大国，目前鸭的年饲养量已达40亿只，占全世界鸭饲养总 量的70%以上，鸭肝炎一直是我国养鸭生产的头号疫病，近年来随着血清1型鸭甲型肝炎 活疫苗和高免卵黄抗体的推广应用，使血清1型鸭甲型肝炎得到有效控制，但近十年来由 于新出现血清3型鸭甲型肝炎在我国养鸭地区爆发和迅速蔓延，又成为制约我国养鸭生产 新的严峻问题。
[0005] 经典的鸭肝炎病毒，即现在称的血清1型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-I)，不仅适宜鸭 胚分离培养病毒，而且能通过传统的鸡胚尿囊腔接种方式分离和培育病毒。而近年来我国 发现的新型鸭肝炎病毒，即血清3型鸭甲型肝炎病毒（DHAV-3)，虽然可以通过鸭胚分离和 培养病毒，但是通过常规的鸡胚尿囊腔接种的方法很难培养和分离该病毒。如果DHAV-3不 能适应鸡胚培养，就意为着研制DHAV-3活疫苗存在巨大的技术瓶颈。
【发明内容】
[0006] 本发明目的在于提供一种鸡胚分离培养血清3型鸭肝炎病毒（DHV-3)的方法，为 DHV-3分离培养、弱毒活疫苗的研制奠定基础。
[0007] 本发明可以通过以下技术方案实现：
[0008] 一种鸡胚分离培养DHAV-3的方法，其特征在于该方法包括以下步骤：
[0009] 1.选取经抗DHAV-I阳性血清和抗DHAV-3阳性血清在鸭胚上进行中和试验和交叉 中和试验确诊为DHAV-3的肝脏组织病料用于鸡胚培养分离病毒；
[0010] 2. DHAV-3的组织病料的处理：取少许DHAV-3的肝脏组织，用灭菌生理盐水做 1:5 (W/V)左右稀释、研磨、冻融2~3次、离心，取离心上清液经0. 22 μ m滤器除菌过滤；
[0011] 3.鸡胚接种分离病毒：取上述无菌滤液通过卵黄囊接种途径接种6~8日龄SPF 鸡胚，每只胚接种0. 2~0. 5ml，37°C培养，24h内死胚弃之，连续观察至120h，其间若有鸡胚 死亡，随时取出置2~8°C冰箱冷藏数小时或过夜；若无死亡，则于72~96h随机取3枚胚 置2~8°C冷藏过夜；
[0012] 4.鸡胚传代接种：及时取出胚体，研磨成匀浆、离心取上清液经0. 22 μπι除菌过 滤，取滤液经卵黄囊接种6~8日龄SPF鸡胚5~10枚，每只胚0. 2~0. 5ml ;盲传 5~10 代，随着传代次数的增加，鸡胚死亡时间前移，鸡胚死亡率也逐渐达到100%，表明通过鸡胚 分离病毒成功，并逐渐适应鸡胚培养。
[0013] 发明的详细描述：
[0014] 1.取临床典型鸭肝炎症状病死鸭，无菌操作取肝脏等组织经PCR鉴定DHAV-3为阳 性的样品，且经10~12日龄鸭胚尿囊腔接种能致死鸭胚分离到病毒，再用抗DHAV-I阳性 血清和抗DHAV-3阳性