一种重组卤醇脱卤酶、突变体、工程菌及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种卤醇脱卤酶、其基因及突变体，含有该基因及突变体的重组表达 载体及重组菌，利用重组菌制备重组酶的方法，以及该重组卤醇脱卤酶制备环氧化物、手性 环氧化物、0 -取代醇的方法。 (二）
【背景技术】
[0002] 卤醇脱卤酶，也叫卤醇-卤化氢裂解酶，通过分子内亲核取代机制催化芳香族或 者脂肪族邻卤醇转化为环氧化物和卤化氢。卤醇脱卤酶不但可以催化碳-卤键的断裂进 行脱卤反应，也可以高选择性地催化接受除了卤离子以外的一系列非自然亲核试剂，如N3' N02'Cf等所介导的环氧化物开环反应。卤醇脱卤酶主要通过蛋白结构中保守的丝氨酸与 底物羟基氧原子之间形成氢键，稳定与底物结合，通过精氨酸降低酪氨酸的pKa值，酪氨酸 从底物上的氧原子作为亲核试剂，进攻邻位卤素取代的碳原子，进而释放卤离子，形成环氧 化物。卤醇脱卤酶介导的生物催化反应，优势主要体现在：1.酶催化反应条件温和；2.酶催 化手性选择高。3.酶催化转化率高
[0003] 卤醇脱卤酶可以广泛应用于合成环氧化物以及取代醇。其中叠氮化醇、氰取 代醇以及硝基醇是合成氨基醇的前体；手性氨基醇在生物制药领域是一类很重要的化合 物，可用来合成多种生物活性物质。异硫氰酸取代醇和噁唑烷酮在农用化学试剂、医药和 高分子化学领域中有着广泛应用。卤醇脱卤酶更已成功应用于他汀类药物关键手性中间体 (R) -4-氰基-3-羟基丁酸乙酯的合成。
[0004] 手性环氧氯丙烷在医药、农药、化工、材料等领域应用广泛。随着手性药物行业的 发展，使得手性环氧氯丙烷作为一种重要医药中间体的地位更加突出。目前，合成手性环氧 氯丙烷主要有化学法和生物法拆分两大类。生物法拆分法具有反应条件温和、环境友好的 优点。但是生物拆分法获得的手性环氧氯丙烷的最高收率只有50%。利用卤醇脱卤酶直 接不对称脱卤合成手性环氧氯丙烷，其理论收率可以达到100%，原子经济效益高，具有潜 在的工业应用前景。但是利用卤醇脱卤酶直接不对称脱卤合成手性环氧氯丙烷的文献较 少。Tetsuji等利用来源于Corynebacteriumsp.N-1074 中的HheB催化 5mM1，3_ 二氯丙 醇生成（R)_环氧氯丙烷。反应初始阶段（R)_环氧氯丙烷的ee值最大可达90%，但随着 反应的进行，ee值慢慢下降直至最终为零。LutjeSpelberg等利用来源于Agrobacterium radiobacterAD1的卤醇脱卤酶HheC催化1,3-二氯丙醇或2,3-二氯-1-丙醇合成环氧 氯丙烷，其ee值小于5%。本课题组也从运动替斯崔纳菌中克隆得到了新的卤醇脱卤酶，催 化1，3-DCP不对称脱卤合成（S)-环氧氯丙烷，但是ee值最高只有60 %，而且随着反应的进 行，ee值同样在下降（CN104263713A) 〇
[0005] 近年来，已从多种微生物中发现了卤醇脱卤酶，部分卤醇脱卤酶的基因已被克隆 并在大肠杆菌中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于催化合成环氧化物及 0-取代醇。目前已知的卤醇脱卤酶，仅有8种已成功在大肠杆菌中表达，并进行了催化特 性的研宄。但是目前发现的卤醇脱卤酶，催化特性优异的卤醇脱卤酶不易获得，使得大多数 不对称脱卤反应，收率低，产物ee值低，无法真正应用于工业生产。因此，开发新型且具有 应用潜力的卤醇脱卤酶一直是生物脱卤和生物开环的重点研宄方向之一。随着DNA测序技 术的进步，急剧增加的生物信息为新酶的开发带来了前所未有的机遇，近年来基因数据挖 掘技术已成为快速开发新酶的有力手段。利用已获得的卤醇脱卤酶序列作为探针，在整个 基因数据库中挖掘同源序列，获得候选酶基因，利用蛋白质工程手段可以进一步改造所获 得的天然酶，从而得到具有所需催化特性的突变酶。通过随机突变、定点突变等蛋白质工程 的手段对卤醇脱卤酶进行立体选择性的改造，提高其对应选择性，将具有较高的应用价值。 (三）
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的问题是，针对之前报道的卤醇脱卤酶催化1，3-二氯丙醇不对 称脱卤合成手性环氧氯丙烷ee值偏低的问题，提供一种卤醇脱卤酶及其编码基因、卤醇脱 卤酶突变体及其编码基因，含有所述编码基因的重组表达载体和重组工程菌，以及将该卤 醇脱卤酶、突变体、表达该卤醇脱卤酶或突变体的重组工程菌作为催化剂催化1，3-二氯丙 醇，制备光学纯（S)_环氧氯丙烷。本发明同时还提供了该重组卤醇脱卤酶和突变体在催化 其它卤代醇生物脱卤或不对称拆分环氧化物合成手性环氧化物和0 _取代醇中的应用。
[0007] 本发明采用的技术方案是：
[0008] 本发明提供一种来源于Sneathiella glossodoripedis的重组齒醇脱齒酶，所述 重组卤醇脱卤酶的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示，所述重组卤醇脱卤酶的编码基因的核 苷酸序列为SEQIDNo.1所示。
[0009] 本发明的卤醇脱卤酶基因具体制备方法为：以来源于运动替斯崔纳菌（Tistrella mobilisZJB1405，CN104263713A)的卤醇脱卤酶作为探针，在NCBI数据库搜索同源 氨基酸序列，发现该序列与Genbank中收录的预测为Sneathiellaglossodoripedis hypotheticalprotein(GenbankNo.WP_037493663)的同源性为 42%，通过序列比对发现 该hypotheticalprotein具有与卤醇脱卤酶相同的催化三联体和一些关键的保守序列，推 测该水解蛋白为疑似卤醇脱卤酶。因NCBI未公布该hypotheticalprotein的基因序列， 根据其氨基酸序列，以及在大肠杆菌异源表达的密码子偏好性，设计合成基因，交送上海旭 冠生物科技发展有限公司合成。碱基序列如SEQIDNo. 1所示的基因，命名为HHDHSg，全长 732bp，氨基酸编码序列从第1个碱基至第729个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为 TAA，其编码的氨基酸序列如SEQIDNo. 2所示。
[0010] 本发明涉及一种所述重组卤醇脱卤酶编码基因构建的重组载体。其可通过本领 域常规方法将本发明的重组卤醇脱卤酶基因连接于各种表达载体上构建而成。所述的载 体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒为 pET28a(b)。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：设计合成基因并在两端 引入XbaI和XhoI酶切位点，交由上海旭冠生物技术有限公司合成，之后将合成基因与表 达载体pET28b用限制性内切酶XbaI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，再经T4DNA 连接酶连接，形成含有本发明的卤醇脱卤酶基因的重组表达载体pET28b-HHDHSg。
[0011] 本发明涉及一种所述重组载体构建的重组基因工程菌。其可通过将本发明的重组 表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生 物，只要能满足重组表达载体可稳定的自行复制，且所携带的本发明的重组卤醇脱卤酶基 因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌，更优选大肠埃希菌（E.coli)BL21(DE3)。将前 述重组表达质粒pET28b-HHDHTm转化至（E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工 程菌株，即E.coliBL21 (DE3)/pET28b-HHDHSg。
[0012] 本发明还涉及重组卤醇脱卤酶的制备方法，其中包括如下步骤：将所述含重组卤 醇脱卤酶基因的重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养 液分离得到含有重组卤醇脱卤酶的菌体细胞。培养本发明的重组工程菌，获得重组表达卤 醇脱齒酶，所述的培养重组工程菌所用的培养基可为本领域任何可使重组工程菌生长并产 生本发明的卤醇脱卤酶的培养基，优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl10g/L， 溶剂为去离子水，pH7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主类型和培养 方法等因素的不同按本领域普通知识进行适当的选择，只要使重组工程菌能够生长并产生 本发明所述的卤醇脱卤酶即可。其他培养转化体具体操作均可按本领域常规操作进行，优 选下述方法：将本发明涉及的重组大肠杆菌重组表达转化体接种至含有终浓度50mg/L卡 那霉素的LB培养基中培养，当培养液的光密度0D_达到0. 8时，在终浓度为0. 2mM的异丙 基-0-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG)的诱导下，高效表达本发明的重组卤醇脱卤酶。
[0013] 本发明还涉及一种所述重组卤醇脱卤酶在催化卤代醇制备手性环氧化物中的应 用，所述的应用为：以含重组卤醇脱卤酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体为催化剂， 以卤代醇为底物，在pH值为7~11(优选8-10)的缓冲液中，于10-50°C(优选20-40°C， 更优选35°C)、150r/min条件下反应，反应结束后，将反应液分离纯化，获得手性环氧化物； 所述卤代醇为1，3-二氯丙醇、1，3-二溴丙醇、2-氯-1-苯乙醇或2, 3-二溴丙醇，所述湿菌 体的用量为1~50g/L缓