一种高效生产l-谷氨酸氧化酶的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种高效生产L-谷氨酸氧化酶的方法，属于发酵工程和酶工程技术 领域。
【背景技术】
[0002] a-酮戊二酸（a-ketoglutarate,简称a-KG)作为一种重要的高值精细化学品 (20-25万元/吨），广泛应用于食品、医药、化工和化妆品等工业领域中。在医药领域中， a-KG能减轻肾病患者的肾脏负担、减少并发症和促进患者手术后快速恢复；与精氨酸等 氨基酸复配，能快速帮助运动员补充能量，广泛应用于功能性营养强化剂；除此以外，由于 a-KG特殊的化学性质，被广泛用于化学合成行业。随着a-KG应用领域的不断拓展，导致 国内和国际市场对a-KG的需求不断增加。从海关了解到的数据，目前国际市场对食品级 a-KG需求量缺口达5万吨以上，而目前食品级a-KG市场价格为20-25万元/吨，且面临 有价无市的窘境。a-KG的生产方法包括：化学合成法、酶催化法和微生物发酵法。目前， 工业化生产a-KG主要采用有机合成法，涉及一系列复杂的化学反应过程，从而引起原料 来源、环境污染等方面一系列问题。同时由于化学法合成a-KG过程中存在严重的安全问 题，导致a-KG难以直接用于食品、医药和化妆品等领域。因此，如何采用生物技术法大规 模制备安全性高的a-KG，是国内外学术界和产业界所关注的焦点问题。
[0003] 本研宄室前期构建完成一株L-谷氨酸氧化酶生产菌株FMME089,并利用酶法生产 a-KG能达到较好的效果，但是此酶的获得量相对较少，因此利用高密度手段规模化高效制 备L-谷氨酸氧化酶，降低a-KG生产成本，具有很好的工业前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是利用高密度手段规模化高效制备L-谷氨酸氧化酶。
[0005] 本发明的第一个目的是提供一种高效表达L-谷氨酸氧化酶的方法。
[0006] 所述方法是以表达L-谷氨酸氧化酶的重组大肠杆菌为生产菌株，在发酵罐上进 行分批补料培养生产L-谷氨酸氧化酶；所述分批补料培养是指在分批发酵过程中，采用 D〇-stat补料方式进行补料或者采用指数补料和D〇-stat两种补料方式相结合的策略进行 补料培养。
[0007] 所述重组大肠杆菌，在本发明的一种实施方式中，为以E.coliBL21，以pET28a表 达载体，表达来源于StreptomycesghanaensisATCC14672的L-谷氨酸氧化酶的重组菌。
[0008] 所述D〇-stat补料方式，在本发明的一种实施方式中，是指当发酵过程的DO突然 升高时开始补料，控制DO关联补料，每当DO高于设定的参数值时就进行片刻的补料。从而 将发酵过程溶氧控制在较低的范围内，比如10-30%。
[0009] 在本发明的一种实施方式中，所述D0-Stat设定的关联参数为20% -30%中的任 意一个值。
[0010] 所述单独使用D0-Stat补料的方法，在本发明的一种实施方式中，具体是： (1)将重组大肠杆菌种子液按照3-6%的接种量接入发酵罐中，控制温度35-40°C，转速 300-500rpm，通气量l-3vvm，补料前控制DO在30 %以上；（2)补料培养阶段：当DO突然升 尚时候开始补料，控制DO关联补料，每当DO尚于设定的参数值时就进彳丁片刻的补料；（3) 诱导培养阶段：当菌体达到对数生长中后期或者稳定期时采用终浓度为5g/L-15g/L-的乳 糖进行诱导。
[0011] 所述指数补料和D〇-stat两种补料方式相结合的策略，在本发明的一种实施方式 中，是指在分批发酵过程中，当DO突然上升时开始采用比生长速率0. 15-0. 451T1进行指数 补料，指数补料过程中维持DO不低于20 %，当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为D〇-stat 并控制溶氧不高于设定的参数值，当菌体〇D_达到30-60时采用乳糖进行诱导。
[0012] 所述诱导，在本发明的一种实施方式中，诱导温度为25-30°C。
[0013] 所述诱导，在本发明的一种实施方式中，诱导时间为8_16h。
[0014] 所述溶氧限制，就是发酵罐设备所能达到的最大溶氧量。在本发明的一种实施方 式中，是指在最高转速800-900rpm、通气量3vvm下能达到的最大溶氧。
[0015] 所述两种补料方式结合的方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：将重组大肠 杆菌种子液按照3-6 %的接种量接入发酵罐中，控制温度35-40°C，转速300-500rpm，通气 量l-3vvm，补料前控制DO在30 %以上；（2)指数补料培养阶段：当DO突然上升时开始采用 比生长速率0. 15-0. 451T1进行指数补料，指数补料过程中维持DO高于20 %; (3)D〇-stat补 料阶段：当达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于设定的参数值； (3)诱导培养阶段：当菌体0D_达到30-60时，采用终浓度为5g/L-15g/L的乳糖进行诱导， 诱导温度为25-30°C。
[0016] 所述DO-stat设定的参数值，在本发明的一种实施方式中，为20% -30%中的任意 一个值。
[0017] 所述两种补料方式结合的方法，在本发明的一种实施方式中，具体是：以4%的接 种量转接到含发酵罐中，初始发酵条件为转速300rpm、温度37°C、通气量lvvm，当DO突然上 升是开始采用比生长速率〇. 251T1进行补料，补料过程中通过调节转速维持DO高于30%， 4h后达到发酵罐溶氧限制，补料方式改为DO-stat并控制溶氧不高于30%，当菌体浓度为 0D6Q(I= 40时采用终浓度10g/L的乳糖进行诱导，于25-30°C下诱导12h。
[0018] 所述方法中，对于发酵罐中的发酵培养基，本领域技术人员完全可以根据现有的 大肠杆菌培养基，选择适合产酶的培养基或者是进一步对培养基进行优化。
[0019] 本发明的第二个目的是提供一种按所述方法得到的L-谷氨酸氧化酶或重组大肠 杆菌菌体。
[0020] 本发明的第三个目的是提供L-谷氨酸氧化酶或重组大肠杆菌菌体在转化生产 a_酮戊二酸方面的应用。
[0021] 所述应用，在本发明的一种实施方式中，是以L-谷氨酸或谷氨酸钠为底物，在 pH7. 0-9. 0,温度35-42°C下，转化18-24h，催化生产a-酮戊二酸。
[0022] 所述底物在本发明的一种实施方式中，其浓度为110_135g/L。
[0023] 本发明的有益效果：1、应用本发明方法得到的L-谷氨酸氧化酶酶活达35U/mL以 上，最高可达156U/mL，实现了L-谷氨酸氧化酶的高效表达；2、发酵得到的发酵液可以直接 用于转化生产a-KG，底物转化率可达98. 7%且全细胞转化投入的菌液体积仅为摇瓶水平 的 1/50。
【附图说明】
[0024]图1:乳糖优化条件的优化；
[0025] 图2:分批发酵发酵曲线；
[0026]图 3 :DO_stat发酵曲线；
[0027] 图4 :指数发酵和DO-stat相结合发酵曲线；
[0028] 图5 :最终确定高密度策略的发酵曲线。
【具体实施方式】
[0029] 实施例1乳糖诱导条件优化
[0030] 以本实验室构建的重组菌FMME089 (PanqingNiu,Enzymaticproductionofa-ke toglutaricacidfromL-glutamicacidviaL-glutamateoxidase,JournalofBiotechnolo gy，2014, 56-62)为出发菌种，优化乳糖诱导条件。
[0031] 1)将重组菌株接种于LB培养基中，0D6QQ为0. 5-0. 6之间时，分别加入l、3、5、7g/L 的乳糖37°C诱导4h，比较LG0X的表达量。发现5g/L的乳糖诱导效果最好酶活达到4. 53U/ mL(图 1A)。
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