水稻OsCTE3基因在增强植物耐冷性中应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物技术领域中水稻E3泛素化连接酶基因OSCTE3在增强植物耐冷性 中的应用。
【背景技术】
[0002] 在水稻的整个生命周期中，经常受各种非生物胁迫和生物胁迫，这些严重影响植 物的生长和发育，并会影响作物的产量和品质。而水稻作为主要的粮食作物，提高其抗逆 性尤为重要，而发掘改善水稻抵抗非生物胁迫能力的基因将为水稻的抗逆分子机制研宄和 分子辅助育种奠定基础。泛素-蛋白酶体途径广泛存在于真核生物中，主要包括泛素化系 统和26S蛋白酶体系统两部分。该途径在维持细胞功能，细胞周期运转，胚胎发育，激素 响应，抵御环境胁迫和衰老等方面发挥着重要的作用。在泛素化系统中，关键酶主要包括 泛素活化酶（Ubiquitin-activatingenzyme，El)、泛素结合酶（Ubiquitin-conjugating enzyme，E2)和泛素连接酶（Ubiquitin-proteinligase，E3)。在水稻中El基因有 6 个， E2及E2-like基因有49个，而E3基因则超过1300个。这些可能是由于在泛素化系统中， E3的功能主要是特异性地识别不同的泛素化底物，从而使泛素从E2蛋白转移到特定的底 物上。因此，E3被认为是该途径识别目标底物的最主要成分。根据不同E3基因上的结构 域，可将其分为两大类：即单亚基E3和多亚基E3。单亚基包括具有HECT(homologousto E6_associatedproteincarboxylterminus)结构域的E3、含有环指状（RINGfinger)结 构域的E3和含有U-box结构域的E3。
[0003] 0sCTE3是一种含有RING-finger结构域的E3泛素连接酶基因，RING-finger结构 域是指70个氨基酸中由半胱氨酸（C)和组氨酸（H)组成的8个氨基酸通过与锌离子螯合 作用C3H2C3(RING-H2)或C3H1C4(RING-HC)构型。Ringfinger结构域是RING结构域家族 最典型的特点，而此结构域是E3具有泛素连接功能的最主要因素并且每一环指结构域连 有两个锌离子，因为环指结构域维持其特定的构象需要锌离子。E3活性依赖于环指结构域， 并通过其与E2相连发挥蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs)的功能。据统计在拟南芥和水稻 中分别有426个和425个具有RINGfinger结构域的E3基因，这在E3基因中占有相当高 的比例。已被报道的许多E3连接酶都参与非生物胁迫响应，并在其中扮演重要的角色。例 如SDIR1和RHA2a是依赖ABA信号通路的盐胁迫和干旱胁迫响应的正调控因子；DRIP1和 DRIP2E3连接酶中含有DREB2A转录因子，它们则是干旱胁迫响应的负调控因子。
[0004] 虽然近年来对于E3泛素化连接酶参与非生物胁迫应答反应的机制有了初步的研 宄，但是还远远不够，其作用机制还不是太清楚，因此更多的参与植物非生物胁迫调控的泛 素化连接酶E3还有待鉴定和深入研宄。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是提供序列表中序列1所示的蛋白及其编码基因（0SCTE3)。
[0006] 本发明提供了序列表中序列1所示的蛋白及其编码基因在增强植物耐冷性中的 应用；所述蛋白的编码基因为如下1)_4)中任一所述的基因；
[0007] 1)序列表中序列2、3的自5'末端2第268位-1029位所示的DNA分子；
[0008] 2)序列表中序列2、3所示的0嫩和1?隱分子；
[0009] 3)在严格条件下与1)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的DNA分子；
[0010] 4)与1)或2)所述的DNA分子具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分 子。
[0011] 含有序列表中序列2所示蛋白的编码基因的重组表达载体在增强植物耐冷性中 的应用也属于本发明的保护范围。
[0012] 所述重组表达载体的构建过程中，在其转录起始核苷酸前加上4个Myc蛋白标签， 在pCUbil390的多克隆位点间，即Ubiquitin启动子后插入所述序列表中序列1所示蛋白 的编码基因得到的重组表达载体。
[0013] 所述植物为单子叶植物-水稻，包括双子叶植物。
[0014] 本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将序列表中序列1所示的蛋白的编码 基因导入植物中，得到转基因植物；所述转基因植物与目的植物相比耐冷性增强。
[0015] 本发明通过低温胁迫下OsCTE3基因的表达差异，以及超表达水稻植株在冷胁迫 条件下的抗性变化，开展其基因克隆与功能分析，分析候选基因与水稻冷胁迫应答的关系。 结果表明，0sCTE3基因在对照和冷胁迫处理条件下，在超表达转基因株系中的表达量显著 的高于野生型对照日本晴，同时表型鉴定显示过表达0sCTE3基因能够显著改善水稻抵御 低温胁迫的能力。本发明为改良、增强水稻耐冷性，加速抗逆分子育种进程，具有十分重要 的理论和实际意义。
【附图说明】
[0016] 图1为以实时定量PCR分析OsCTE3在对照条件下野生型和超表达株系中的表达 量
[0017] 图2为以实时定量PCR分析OSCTE3在冷胁迫下的野生型和超表达株系中的表达 量
[0018] 图3为Southernblot方法检测超表达株系中的目的基因
[0019] 图4为超表达0sCTE3转基因植株的耐冷性鉴定
[0020] 具体实施方法
[0021] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0022] 下述实施例中说用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0023] 实施例1、过表达0sCTE3基因转基因株系的获得
[0024] 1、过表达载体构建
[0025] 根据日本晴序列全长设计引物，以日本晴cDNA为模板，扩增获得0sCTE3的基因全 长，同时在5'和3'端加上PstI、BamHI酶切位点，扩增引物为：
[0026]F:5 ' -GCACTGCAGATGGACCAGAITTACATGGCT-3 '(下划线部分为PstI酶切位 点）；
[0027]R：5'-GACGGATCCTCAGAACAAGAGCAGGCACAG-3，（下划线部分为BamHI酶切位 点），扩增产物经PstI和BamHI酶切纯化后，回收目的DNA片段（762bp);同时，用EcoRI 和BamHI酶切表达载体pCUbil390(含有Ubiquitin1启动子）（公众可从中国农业科学院 作物科学研宄所获得，记载过该材料的非专利文献是：HaoPeng，QianZhang，YadongLi， CailinLei，YingZhai，XuehuiSun，DayeSun，YingSun，TiegangLu(2009)Aputative leucine-richrepeatreceptorkinase,OsBRRl,isinvolvedinriceblastresistance Planta，230 :377-385)，T4连接酶连接，得到目的质粒，然后PstI单酶切将人工合成的 4XMyc蛋白标签核酸序列(CTGCAGATGAGCGGGTTAATTAACGGTGAACAAAAGCTAATCTCCGAGGAAGA CTTGAACGGTGAACAAAAATTAATCTCAGAAGAAGACTTGAACGGACTCGACGGTGAACAA