一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2h4及单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种降钙素原单克隆抗体杂交瘤2H4及单克 隆抗体。
【背景技术】
[0002] 细菌或病毒等经由创面、呼吸道、泌尿道、消化道入侵，在严重创伤，全身抵抗力 下降，体内正常菌群失调，细菌移位等时，均可引起机体出现严重的感染症状，是引起临床 各种并发症，如脓毒症、败血症休克，多器官功能障碍症（multipleorgandysfunction syndr〇me，MODS)，乃至死亡的主要原因。据美国2001年统计资料显示，该年仅重度脓 血症就有75. 1万例，平均死亡率高达28. 5%，这意味着该年死亡的人数竟然是爱滋病 (acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)的近三倍。对感染性疾病及其并发症能早 期诊断和及时治疗，可有效降低死亡率。
[0003] 常规用于诊断炎症治疗过程的指标如体温、白细胞分类和计数、血沉或C反应 蛋白（CRP)、血常规检查等，，用于感染性疾病的血清学诊断已沿用多年，因其都不是十 分可靠的指标，是非特异性参数，所以易引起误诊或漏诊。1990年发现的降钙素原 (procalcitonin，PCT)经证实其在血清中浓度的增高与感染的发生有密切关系，能为疾病 的诊断、鉴别，治疗方案的选择，预后判断等提供新的实验室标准。
[0004] 降妈素原（procalcitonin,PCT)是一种由116个氨基酸组成、分子量大约为13KD 的糖蛋白，是降钙素（calcitonin，CT)的前肽物，无降钙素样的激素活性，其分子由降 钙素、下钙素和一个含57个氨基酸的N2末端碎片组成。它的半衰期为25-30h，在体内稳定 性很好。因为在正常及健康的个体中，PCT经一系列的酶催化作用最后水解形成CT，故其血 清PCT的浓度极低，仅为10~50pg/ml，一般的方法检测不到。在全身性细菌、真菌和寄生 虫感染，系统炎症反应综合症（SIRS)、败血症、急慢性肺炎、急性胰腺炎、活动性肝炎、创伤 等患者的血清PCT水平异常增高，其浓度可达正常水平的几倍甚至上万倍，其生物学来源 机制可能为靶细胞（PBMC)等在LPS血类败血症相关因子作用下，应急分泌PCT，这种应急分 泌超过细胞后转换过程（由PCT分解为CT)或后转换过程缺少必需的水解酶，从而导致实 验室观察到的PCT成倍增长，而CT水平不变或稍增高；在病毒感染，自身免疫性疾病，器官 移植排斥反应等患者的血清PCT浓度不增加或轻微增加。这就决定了PCT的高度特异性， 因此可用于此类疾病的鉴别诊断；在全身性细菌感染和脓毒症辅助鉴别诊断、预后判断、疗 效观察等方面有很高的临床价值。
[0005] 因此为了诊断细菌性或非细菌性炎症反应、鉴别诊断脓毒症和全身炎症反应堆的 严重程度，预防抗生素滥用等，本领域迫切需要开发抗PCT单克隆抗体，以便开发一种PCT 的诊断试剂盒。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种抗降钙素原的单克隆抗体。
[0007] 本发明另一目的在于提供分泌上述抗降钙素原单克隆抗体的杂交瘤细胞2H4。
[0008] 本发明还有一个目的在于提供上述杂交瘤细胞2H4的制备方法。
[0009] 本发明上述目的通过以下技术方案予以实现：
[0010] 本发明所述的检测PCT的抗体是用合成PCT抗原多肽作为抗原免疫BALB/c小鼠 获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株2H4,杂交瘤细胞分泌的抗体为 IgGl阳性，轻链为k型。所述抗PCT单克隆抗体杂交瘤2H4,于2014年12月16日保藏于 中国典型培养物保藏中心(地址：中国武汉武汉大学)，保藏号为CCTCCNO:C2014232。
[0011] 本发明中PCT的氨基酸序列为AGM62655. 1，如SEQ ID NO :1所示。
[0012] 本发明中PCT的抗原多肽序列如SEQIDNO:2所示。
[0013] 所述的保藏号为CCTCCNO:C2014232的杂交瘤细胞株2H4的制备方法是：PCT抗 原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂混 合免疫BALB/c小鼠，期间进行两次以上免疫，取血清效价大于1:105的BALB/c小鼠脾细 胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50%PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用PCT抗原多肽包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过多次 有限稀释，最后获得稳定分泌抗PCT单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为2H4。应用此株杂 交瘤细胞以1X106/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲养观察 10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法ProteinGSepharoseFastFlow 纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。
[0014] 与现有技术相比，本发明特色如下：
[0015] 本发明以合成的PCT抗原多肽包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活性， 并用此纯化抗体对病人血清进行Western-blot证明该抗体可以识别天然PCT蛋白。
[0016] 本发明的单克隆抗体其免疫原是偶联了KLH的合成PCT抗原多肽，其肽序列全长 27个氨基酸。
[0017] 本发明针对PCT合成短肽制备出的单克隆抗体对检测PCT蛋白具有较高的特异 性和灵敏度，该抗体的应用将为PCT的功能研宄和开发基于PCT的诊断试剂奠定基础。
【附图说明】
[0018] 图1是本发明单抗2H4对病人血清免疫印迹的结果。泳道1 :上样为正常人血清； 泳道2, 3 :上样为细菌感染病人血清；泳道M:蛋白Marker。
【具体实施方式】
[0019] 实施例1本发明单克隆抗体的制备和鉴定
[0020] 1、单抗2H4的制备
[0021] 1)PCT抗原多肽的设计、制备及载体偶联
[0022] 根据GenBank上的人PCT序列（登录号：AGM62655. 1)获得人PCT蛋白序列，含有 116个氨基酸。用TMHMM软件分析PCT蛋白的跨膜域，IEDB软件分析PCT蛋白免疫原性、 亲疏水性及表面可及性，结果表明人PCT蛋白34-60aa有27个氨基酸抗原性、亲水性及表 面可及性较强（图1)。经过上述分析，最终筛选多肽序列为：VQMKASELEQEQEREGSSLDSPRS KRC(34-60aa，SEQIDN0:2)。该短肽（PCT-P1)及C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH的短肽 (PCT-P1-KLH)由上海吉尔生化公司合成。
[0023] 2)免疫小鼠
[0024] 将合成肽PCT-P1-KLH与弗氏完全佐剂按1:1混匀500y1乳化后，皮下多点注射 6-8周龄雌性Balb/c小鼠3只，每只小鼠抗原接种剂量为50yg，三周后抗原与弗氏不完全 佐剂按1:1混匀500y1乳化后皮下多点注射，每只小鼠抗原接种剂量为50yg，间隔三周后 50yg不加佐剂腹腔注射，共免疫4次。
[0025] 3)免疫血清效价测定
[0026] 采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50yg合成肽PCT-P1溶解于10ml0. 05M pH9. 6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100y1/孔，4°C过夜。使用PBS(含有0. 05 % (V/V)Tw