一种弓形虫蛋白TgVP1单克隆抗体杂交瘤3A6及单克隆抗体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及细胞工程领域，具体涉及弓形虫蛋白TgVPl单克隆抗体杂交瘤细胞株 3A6及单克隆抗体。
【背景技术】
[0002]V-H+-PPaSe是一种独特的质子泵，在多种动植物中都存在。它能够水解无机焦 磷酸盐的磷酸酐键，并利用所释放的能量转运质子，产生跨膜的电化学梯度，发挥和质子泵 ATP酶类似的作用。V-H+-Ppase能使储存的能量高效转化为H+和/或电转膜梯度，用于多 种不同的细胞内转运过程。V-PPases最早被发现存在于植物和光合细菌中，近期研宄表明 锥虫、利什曼原虫、弓形虫、恶性疟原虫也存在这种酶。值得关注的是，在这些寄生虫的动物 宿主中均不存在这种酶类，因此V-PPases作为寄生虫病潜在的药物靶点具有重要的研宄 价值。弓形虫的V-PPases主要分布于酸性钙体及质膜，根据结构和功能的不同可分为两 种类型，VP1和VP2。TgVPl需要K+激活其生物学活性。当弓形虫入侵细胞时，TgVPl组成 圈状结构分布于弓形虫外缘，并随着弓形虫的侵入在虫体内迀移。当弓形虫完成侵袭过程 时，TgVPl重新回到弓形虫的顶端。TgVPl含有17个跨膜域，N端具有信号肽序列，可以指 导TgVPl进入弓形虫的分泌途径，但具体作用机制尚不明确。有研宄表明弓形虫焦磷酸酶 活性可抑制弓形虫在细胞内的复制。因此，TgVPl有作为潜在的弓形虫病临床诊断和治疗 革巴标的可能，制备TgVP1的抗体具有十分重要的意义，可以为该蛋白功能的研宄奠定基础， 同时为其作为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种能用于ELISA、western-blot及 免疫荧光检测的抗弓形虫蛋白TgVPl的单克隆抗体。
[0004] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0005] 本发明所述的检测弓形虫蛋白TgVPl的抗体是用合成TgVPl抗原多肽作为抗原免 疫BALB/c小鼠获得，并用细胞融合技术获得产生这种抗体的杂交瘤细胞株3A6,杂交瘤细 胞分泌的抗体为IgGl阳性，轻链为k型。所述抗弓形虫蛋白TgVPl单克隆抗体杂交瘤3A6， 于2014年12月16日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCN0:C2014231。
[0006] 本发明中弓形虫蛋白TgVPl的氨基酸序列为EPT25031. 1，如SEQ ID NO :1所示。
[0007] 本发明中弓形虫蛋白TgVPl的抗原多肽序列如SEQ ID NO :2所示。
[0008] 所述的保藏号为CCTCC NO :C2014231的杂交瘤细胞株3A6的制备方法是：TgVPl 抗原多肽与马来酰胺活化的匙孔血蓝载体蛋白KLH偶联，经脱盐纯化后作为免疫原与佐剂 混合免疫BALB/c小鼠，期间进行两次以上免疫，取血清效价大于1:105的BALB/c小鼠脾细 胞与SP2/0骨髓瘤细胞按常规方法用50% PEG-4000进行融合；用含20%小牛血清的HAT RPMI-1640培养基筛选融合细胞，用TgVPl抗原多肽包被ELISA板，进行ELISA筛选；经过 多次有限稀释，最后获得稳定分泌抗TgVPl单克隆抗体的杂交瘤细胞株，标记为3A6。应用 此株杂交瘤细胞以1X106/只的量注入石蜡预处理的8-10周龄的BALB/c雌性小鼠腹腔，饲 养观察10-14天后小鼠腹部膨大时抽取腹水。采用亲和色谱法ProteinGSepharoseFast Flow纯化单克隆抗体，以SDS-PAGE鉴定单克隆抗体的纯度，纯度达到90%以上。
[0009] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0010] 本发明以合成的TgVPl抗原多肽包被ELISA板，通过ELISA法检测纯化抗体的活 性，并用此纯化抗体对纯化的弓形虫蛋白进行Western-blot证明该抗体可以识别TgVPl蛋 白。
[0011] 本发明将此纯化抗体用于进行弓形虫的免疫荧光染色证明其能识别天然的TgVPl 蛋白。此株杂交瘤细胞分泌的单克隆抗体为进一步研宄TgVPl功能奠定基础，同时为其作 为疾病标志物的可行性提供实验数据支持。
[0012] 本发明的单克隆抗体其免疫原是偶联了KLH的合成TgVPl抗原多肽，全长29个氨 基酸。本发明的单克隆抗体除了能应用于ELISA和Western检测变性TgVPl蛋白以外还可 以应用于细胞免疫荧光检测未变性的天然TgVPl蛋白。目前国内外尚无针弓形虫TgVPl特 异性抗体，而本发明的抗体不仅能与变性蛋白结合，还能与具有高级结构的天然蛋白结合， 从而能应用于免疫荧光等实验。本发明针对TgVPl合成短肽制备出的单克隆抗体对检测 TgVPl蛋白具有较高的特异性和灵敏度，该抗体的应用将为TgVPl的功能研宄和其作为疾 病标志物的可行性提供实验数据支持。
【附图说明】
[0013] 图1为本发明单抗3A6对弓形虫免疫印迹的结果，其结合条带的分子量约为 85kDa。泳道1 :上样为弓形虫速殖子裂解蛋白；泳道2 :上样为OFTu细胞裂解蛋白；泳道M: 蛋白Marker。
【具体实施方式】
[0014] 下列实施例旨在举例说明而不是限制本发明。
[0015] 实施例1本发明单克隆抗体的制备和鉴定
[0016] 1、单抗3A6的制备
[0017] 1)弓形虫TgVPl抗原多肽的设计、制备及载体偶联
[0018] 根据GenBank上的弓形虫TgVPl序列（登录号：EPT25031. 1)获得弓形虫TgVPl蛋 白序列，含有816个氨基酸。用TMHMM软件分析TgVPl蛋白的跨膜域，IEDB软件分析TgVPl蛋 白免疫原性、亲疏水性及表面可及性，结果表明弓形虫TgVPl蛋白292-320aa有29个氨基 酸抗原性、亲水性及表面可及性较强。经过上述分析，最终筛选多肽序列为：292aa_320aa， SEQIDN0:2。该短肽（TgVPl-Pl)及C端偶联匙孔血蓝载体蛋白KLH的短肽（TgVPl-Pl-KLH) 由上海吉尔生化公司合成。
[0019] 2)免疫小鼠
[0020] 以合成肽TgVPl-Pl-KLH免疫6-8周龄雌性BALB/c小鼠。
[0021] 第一次免疫：取合成肽TgVPl-Pl-KLH与等体积的Bentonite佐剂混匀后，以每只 50yg/500yL的量腹腔内注射BALB/c小鼠；
[0022] 第二次免疫：隔2周后，取合成肽TgVPl-Pl-KLH与等体积的Bentonite佐剂混匀 后，以每只50yg/500yL的量腹腔内注射BALB/c小鼠；
[0023] 第三次免疫：再隔2周后，取合成肽TgVPl-Pl-KLH与等体积的Bentonite佐剂混 匀后，以每只50yg/500yL的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾静脉取 血，以合成肽TgVPl-Pl包被，ELISA检测血清效价，取效价大于1:105的小鼠脾细胞与骨髓 瘤细胞进行融合；
[0024]Bentonite佐剂使用商品化产品。
[0025] 3)免疫血清效价测定
[0026] 采用间接ELISA法测定免疫血清效价。取50yg合成肽TgVPl-Pl溶解于10ml 0. 05MpH9. 6碳酸盐缓冲液，包被聚苯乙烯微96孔板，100y1/孔，4°C过夜。使用PBS(含有 0.05% (V/V)Tween-20)洗板三次，用 10mMPBS含 1%BSA封闭液 100y1/孔，37°C封闭 2h， 使用PBS(含有0. 05% (V/V)Tween-20)洗板三次，第三次免疫后10天小鼠尾静脉采血，鼠 免疫血清用含1%BSA10mMPBS进行1(T2~1(T8倍稀释，加入96孔板，lOOyl/孔37°Clh， PBS(含有0. 05% (V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1 :10000倍稀释辣根过氧化物酶标记 羊抗小鼠IgG(Sigma，INC.)，100y1/ 孔 37°C30min，同上洗板后，TM