氯丙烷按照体积比0.5:1再加入到NaOH溶液(0.8 mol/L)中，最后按照重量体积比3 g:1 mL将琼脂糖磁性微球加入到NaOH溶液(0.8 mol/L)中，于40°C下搅拌3 h，得活化琼脂糖磁性微球。
[0024]) ACE的固定:按照质量比1.5: 10将血管紧张素转化酶(ACE)和活化的琼脂糖磁性微球加入硼酸盐缓冲液(0.1 mol/L)中，50°C振荡3 h后，混合液放入磁场中，分离琼脂糖磁性微球，并用蒸馏水充分洗涤，直至无酶蛋白被洗出，真空冷冻干燥得琼脂糖磁性微球固定化ACE。
[0025])贻贝蛋白的酶解和超滤:将厚壳贻贝iMytiluscoruscus)去壳，贻贝肉与甘氨酸-NaOH缓冲液按照Ig:4 mL的重量体积比混合、匀浆，调节pH值至9.5，得混合液；混合液调温度至50°C，然后按照贻贝肉质量的0.8%加入碱性蛋白酶(2.0X 15 U/g)，酶解5 h ；酶解液升温至95°C，并于此温度保持10 min后；调温度至37°C，用I mol/L NaOH溶液调pH至8.6，按照贻贝肉质量的1.0%加入胰蛋白酶(1.9X 14 U/g)，酶解6 h后，将酶解液采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，冻干，即为超滤酶解物。
[0026])贻贝蛋白降压肽的制备:将超滤酶解物依次经琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制(RP-HPLC)纯化，得降压肽。
[0027]①琼脂糖磁性微球固定化ACE的吸附:向硼酸盐缓冲液(0.1 mol/L, pH 7.8)加入NaCl至浓度为0.2 mol/L，然后加入超滤酶解物至浓度为6 mg/mL，最后按照溶液中酶解物重量的40倍加入琼脂糖磁性微球固定化ACE，吸附45 min后，利用磁场将磁性微球与溶液分离，用硼酸盐缓冲液反复洗涤微球至洗涤液220 nm和280 nm无紫外吸收后，然后将磁性微球在1.0 mol/L的NaCl溶液中解吸附，利用磁场将磁性微球与溶液分离，溶液冻干，得降压肽混合物。
[0028]②RP-HPLC纯化:将降压肽混合物配成45 μ g/mL溶液，利用RP-HPLC (条件:进样量为20 yL ;色谱柱为Zorbax C18 (250 X 4.6mm，5 μ m);流动相为40%乙腈；洗脱速度为1.0 mL/min;紫外检测波长为220 nm)进行纯化，根据对ACE的抑制活性得一个高活性降压肽(见图1)。
[0029]③结构检测:收集活性最高的降压肽经检测为单一峰，利用蛋白/多肽序列分析仪测定氨基酸序列为Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp (VSffPCRff), ESI/MS检测分子量为935.07 Da0
[0030]将上述制得的贻贝蛋白降压肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp (VSffPCRff)进行ACE抑制活性实验。实验结果表明:该多肽的半数抑制率(IC5tl)为37.53 土 1.09 μΜ。
[0031]最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的一个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
【主权项】
1.贻贝蛋白降压肽的快速制备方法，其特征在于包括以下步骤: 1)琼脂糖磁性微球的制备与活化:按照重量体积比I~ 1.5g: 30 mL将琼脂糖加入到水中，共同煮沸至琼脂糖完全溶解，加入I ml Fe3O4磁流体，在旋涡混合器上充分混合；在搅拌下将混合液滴入到80°C的有机相中，并在80°C下反应15 ~ 20 min ;有机相冷却至40°C于250 rpm转速机械搅拌10 ~ 15 min使微球成形，并在磁场中分离，制得的微球分别用石油醚和去离子水清洗3次，以清除残余有机相，得琼脂糖磁性微球；将NaBH4按照重量体积比2 ~ 3mg:1mL加入到0.8 -1.0 mol/L的NaOH溶液中，然后将环氧氯丙烷按照体积比0.5 ~ 0.7:1再加入到0.8 -1.0 mol/L的NaOH溶液中，最后按照重量体积比2~ 3 g:1 mL将琼脂糖磁性微球加入到0.8 -1.0 mol/L的NaOH溶液中，于40°C下搅拌3-5 h，得活化琼脂糖磁性微球； 2)ACE的固定:按照质量比I~ 1.5: 10将血管紧张素转化酶和活化的琼脂糖磁性微球加入0.1 mol/L的硼酸盐缓冲液中，40~50°C振荡2~ 3 h后，混合液放入磁场中，将琼脂糖磁性微球分离出来，并用蒸馏水充分洗涤，直至无酶蛋白被洗出，真空冷冻干燥得琼脂糖磁性微球固定化ACE ； 3)贻贝蛋白的酶解和超滤:将贻贝去壳，贻贝肉与甘氨酸-NaOH缓冲液按照Ig:3mL~lg:5mL的重量体积比混合、匀浆，调节pH值至9.5 ~ 10，得混合液；将所述的混合液调温度至45 ~ 55°C，按照贻贝肉质量的0.5 ~ 0.8%加入碱性蛋白酶，酶解4 ~ 6 h ;然后将酶解液升温至90 ~ 95°C，并保持10 ~ 15min ;将酶解液调温度至35 ~ 40°C，用0.1 mol/L NaOH溶液调pH至8.5 ~ 9.0，按照贻贝肉质量的0.8 ~ 1.0%加入胰蛋白酶，酶解4 ~ 6h后，将酶解液采用I kDa超滤膜进行超滤处理，收集分子量小于I kDa部分，冻干，即为超滤酶解物； 4)贻贝蛋白降压肽的制备:将超滤酶解物依次经琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制纯化，得降压肽。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤I)中有机相为Span-80:液体石錯的固液比为lg:25mL。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤3)中的贻贝为厚壳贻贝即Mytilus coruscuso
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述步骤4)的琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和RP-HPLC纯化的具体过程为: 琼脂糖磁性微球固定化ACE的吸附:向浓度0.1 mol/L, pH 7.8的硼酸盐缓冲液加入NaCl至浓度为0.2 mol/L，然后加入超滤酶解物至浓度为5 ~ 8 mg/mL，最后按照溶液中酶解物重量的30 ~ 50倍加入琼脂糖磁性微球固定化ACE，吸附45 min后，利用磁场将磁性微球与溶液分离，用硼酸盐缓冲液反复洗涤磁性微球至洗涤液220 nm和280 nm无紫外吸收；最后将磁性微球在1.0 mol/L的NaCl溶液中解吸附，利用磁场将磁性微球与溶液分离，溶液冻干，得降压肽混合物； 反相高效液相色谱纯化:将降压肽混合物配成45 ~ 55 y g/mL溶液，利用反相高效液相色谱进行纯化，根据对ACE的抑制活性的得降压肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述反相高效液相色谱的条件为:进样量19 ~ 21 UL ;色谱柱是规格为250 mmX 4.6mm, 5 μπι的Zorbax C18 ;流动相为40%乙腈；洗脱速度1.0 mL/min ;紫外检测波长220 nm。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于所制备的降压肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp 对 ACE 的半数抑制率为 37.53 土 1.09 μ Μ。
【专利摘要】本发明公开了一种贻贝蛋白降压肽的快速制备方法，该降压肽的氨基酸序列为Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp（VSWPCRW），ESI-MS测定分子量为935.07Da。贻贝经去壳取肉、酶解、超滤、琼脂糖磁性微球固定化ACE吸附和反相高效液相色谱制（RP-HPLC）纯化，得活性肽Val-Ser-Trp-Pro-Cys-Arg-Trp。本发明制备的活性肽具有显著的血管紧张素转化酶（ACE）抑制活性，可用于高血压治疗相关的药物。
【IPC分类】A61P9-12, C07K1-20, C07K1-36, B01J20-30, B01J20-24, B01J20-28, C07K7-06, B01J13-02, C12P21-06, C07K1-34, C07K1-22
【公开号】CN104762358
【申请号】CN201510177318
【发明人】王斌, 迟长凤, 赵玉勤, 孙坤来
【申请人】浙江海洋学院
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2015年4月15日